O metabolismo mitocondrial é um regulador essencial da durabilidade e memória das células T. Medir a respiração mitocondrial, portanto, dá insights importantes sobre as propriedades das células T. A máquina de cavalos-marinhos pode medir vários elementos da respiração mitocondrial, em tempo real, em linfócitos T primários humanos vivos, sem a necessidade de qualquer rotulagem.
Este método é muito adequado para monitorar o condicionamento físico e o potencial de memória das células T, que são importantes preditores do sucesso da imunoterapia contra o câncer. Para começar, lave as contas CD3/CD28 transferindo 12,5 microliters de contas por milhão de células para um tubo de microcentrída e adicionando 12,5 microliters de PBS por 12,5 microliters das contas no tubo. Em seguida, coloque o tubo de microcentrifuge em um ímã adequado por um minuto, descarte o buffer e resuspenja as contas no volume original do meio da célula T.
Em seguida, adicione 12,5 microliters de contas por milhão de células em uma proporção de uma a duas contas por células, e divida as células em duas condições com cerca de cinco milhões de células em cada. Em seguida, adicione o volume correto de citocinas a cada condição e transfira as células para placas multi-poços. Incubar as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após três dias de incubação, prepare o meio celular T fresco com o dobro da concentração de citocinas. Resuspend e divida as células transferindo metade do volume de cada poço para um novo poço. Em seguida, adicione o mesmo volume de meio de célula T recém-preparado para cada poço.
Para o ensaio de fluxo extracelular, prepare a solução de revestimento contendo bicarbonato de sódio, Cell-Tak e hidróxido de sódio. Em seguida, abra uma placa de cultura celular XF fresca, e adicione 12 microliters da solução de revestimento recém-preparada para cada poço, garantindo até mesmo a distribuição da solução de revestimento na parte inferior de todos os poços. Incubar a placa em temperatura ambiente com a tampa ligada por 30 minutos.
Em seguida, descarte a solução líquida restante de todos os poços. Lave a placa com 200 microliters de água estéril e descarte o líquido. Em seguida, lave a placa com 200 microliters de PBS estéreis de cultura celular.
Depois de descartar o líquido, deixe a placa secar por 30 minutos em temperatura ambiente. Para aplacar células T na placa de cultura celular XF, prepare 50 mililitros de mídia de ensaio misturando mídia XF RPMI adequada com glicose, piruvato e glutamina de acordo com a configuração experimental. Aqueça a mídia preparada a 37 graus Celsius em uma incubadora não regulamentada com dióxido de carbono e coloque o pH em 7,4.
Garanta mídia suficiente para o plantio de células e a preparação das soluções de oligomicina e FCCP. Em seguida, projete um layout de placa com um número crescente de células por poço para a otimização ou ensaio executado. Use quatro poços cheios de mídia e injetados com mídia para medições de fundo.
Depois de contar as células T preparadas anteriormente, pipeta um número apropriado de células para cada poço da placa de cultura celular XF previamente revestida de acordo com o layout da placa. Para aderir as células T à superfície revestida, centrifugar a placa de cultura celular XF. Em seguida, lave as células com 200 microliters de mídia de ensaio.
Descarte a mídia e adicione 180 microliters de mídia de ensaio fresco. Depois de garantir que as células estejam conectadas e distribuídas uniformemente pela superfície do poço, incubar a placa de cultura celular XF a 37 graus Celsius no armário de aquecimento não-dióxido de carbono regulado por 30 minutos. Para a corrida de otimização, prepare soluções de trabalho de oligomicina e FCCP em mídia de ensaio.
Em seguida, carregue as soluções de trabalho de oligomicina ou FCCP nas portas de injeção do cartucho do sensor. Certifique-se de que nenhuma porta de injeção contenha apenas ar. Encha todas as portas vazias com mídia de ensaio.
Em seguida, remova bolhas potenciais nas portas de injeção batendo suavemente as bordas da placa sobre a mesa. Para a execução do ensaio, prepare uma solução de antimicina A de 20 micromolar. Em seguida, de acordo com o layout da placa, carregue 20 microliters de oligomicina ou FCCP na porta de injeção A do cartucho do sensor, e adicione 22 microliters de antimicina A à porta de injeção B de todos os poços.
Em uma corrida representativa de otimização de oligomicina, um patamar na taxa de consumo de oxigênio, ou OCR, é atingido quando a concentração acumulada atinge um micromole. A partir dessa concentração, o OCR não foi mais reduzido. Para as células tratadas com concentrações crescentes do desacoplador FCCP, os níveis de OCR aumentaram até 0,2 micromolar FCCP e, em seguida, atingiram um platô, indicando que o desacoplamento total foi obtido.
Em uma corrida representativa de otimização de concentração celular, o OCR inicial para uma corrida com 200.000 células é aproximadamente metade disso, com 400.000 células. Após o tratamento fccp, o OCR máximo é de 61,6 picomoles por minuto para 200.000 células e 190,4 picomoles por minuto para 400.000 células. Após o tratamento da oligomicina, o OCR em execução com 200.000 células entra em colapso em dígitos únicos e é menor do que o da corrida com 400.000 células.
Investigar o efeito das citocinas interleucina-2 e interleucina-15 no metabolismo das células T revelou que as células cultivadas interleucina-15 possuíam maior respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente. No entanto, a respiração basal e a produção de ATP não foram afetadas. Estudar o metabolismo mitocondrial em células T humanas dá pistas importantes sobre sua durabilidade e potencial de sobrevivência.
Isso resulta em maior conhecimento do condicionamento físico das células T e pode, em última análise, melhorar as taxas de resposta à imunoterapia do câncer.
