Agradecemos a Divisão de Emory University of Animal equipe recursos para a assistência veterinária. Fontes de financiamento incluem: ALS Association, Departamento de Defesa, e Neuralstem, Inc.

1. Uso de Animais Procedimentos demonstrados aqui foram aprovados pelo Animal Care Institucional da Universidade Emory e Uso Comissão (IACUC). Minipigs Feminino Göttingen pesando aproximadamente 15-20 kg são utilizados. 2. Anestesia Os animais estão em jejum de aproximadamente 12 horas antes da cirurgia. Sedação e indução da anestesia de animais constituído por uma mistura de cetamina por via intramuscular (35 mg / kg), acepromazina (1,1 mg / kg) e atropina (0,04 mg / kg). Os animais são então intubados e mantidos com oxigénio e 1-3% de isoflurano anestesia geral. Neste ponto, a parte de trás da cabeça e de cada animal é raspada. Profundidade da anestesia é monitorada pelo pessoal veterinário. Ausência de reflexos interdigitais, da córnea e da pálpebra, bem como freqüência cardíaca e respiratória, oximetria de pulso, direta / indireta da pressão arterial, o fim-de maré medições de dióxido de carbono, e tônus ​​muscular / resposta a estímulos nocivos são usados ​​para monitorar a profundidade<html> da anestesia. 3. Posicionamento Os animais são levados para a sala de cirurgia e colocado em uma posição de bruços em um costume quadro projetado para imitar posicionamento do paciente na mesa cirúrgica Jackson espinhal. O quadro utiliza correias ajustáveis ​​que são colocados sob o peito e pélvis do animal, permitindo que o abdómen para pendurar livre e, portanto, minimizar a pressão no abdómen e no tórax e consequente sangramento venoso epidural (Figura 1). O quadro também fornece a imobilização externa da coluna para o procedimento 1. Além disso, os animais são colocados numa almofada de recirculação aquecida para manter a temperatura do corpo e uma veia marginal da orelha cateterizada para a administração do fluido e qualquer administração de fármaco necessária durante uma cirurgia. Finalmente, o campo cirúrgico está preparada com álcool e solução Chlorhexadine ou Betadine e campos cirúrgicos são colocados no campo cirúrgico. le &quot;&gt; Laminectomia 4. Uma incisão na pele aproximadamente 10-15 cm é feita e da musculatura paraespinhal é dissecado para fora da coluna vertebral bilateralmente. Em seguida, uma laminectomia dorsal de níveis múltiplos será realizada. Os processos da lâmina e espinhoso de três sobrejacente vértebras C3-C5 ou L2-L4 segmentos são removidos usando fórceps e uma broca cirúrgica. 5. Colocação do Derrick Spinal Chamamos Derrick Spinal o dispositivo concebido para a entrega do gene e (célula) terapias para o 2-5 da medula espinhal. Discussão detalhada sobre a concepção e evolução deste dispositivo pode ser encontrado no Riley et al., 2011. 4 Para fixar o dispositivo ao paciente, mensagens percutâneas são colocadas através de incisões na pele um centímetro acima e abaixo da incisão principal e montado com a lâmina acima e abaixo da incisão primária. Em seguida, dois afastadores integrados estão ligados ao four percutâneas mensagens acima e abaixo do local de incisão para expor a área da coluna vertebral que foi submetido a laminectomia. 6. Abertura da dura-máter Com o auxílio de uma ferramenta de Woodson dental e uma lâmina 11, a incisão de 2,5 cm é feita através da dura-máter, expondo a medula espinhal. A dura-máter é reflectida para longe da camada pial usando sutura 4-0 e Nurolon fixada à musculatura paraespinhal profundo. Patties cirúrgicos são colocados nos extremos rostral e caudal da abertura. Estes proporcionam uma barreira parcial para o fluxo de fluido cerebrospinal, e também proporcionar um alvo seguro para os cirurgiões para colocar ventosas sem danificar o fio. Nos seres humanos, sob a ampliação do microscópio cirúrgico, a superfície pial é dissecado a este ponto. Devido a limitações técnicas, este procedimento não é necessário ou viável em animais. 7. Spinal Cord Injeções e deslocamento lateral da torre Spinal para injeção adicionals Imediatamente antes da injecção, um bolus de metilprednisolona (125 mg, IV) é administrado para evitar inchaço da medula espinhal. Neste ponto, o sistema de trilho da plataforma está ligado e os trilhos laterais estão ajustadas para o comprimento apropriado. A gôndola é top-carregados nos 2 bares e a unidade Z é montado na junta universal. A seguir, a cânula carregado é colocado no microdrive. Usando a junta universal sobre a plataforma de microinjecção, os ângulos coronal e sagital são ajustadas para assegurar uma trajetória ortogonal à superfície das injecções espinais seguir a colocação da cânula. A agulha é posicionada em conformidade com a zona medial da raiz dorsal de entrada (DREZ). O DREZ é identificado com a ampliação de 3,5 X lupa cirúrgica e penetrou numa trajectória ortogonal à superfície do cabo num ponto &lt;1 mm medialmente. Nos seres humanos, uma MRI pré-operatória fornece uma linha de base de avaliação of espinal medula dimensões para o planejamento operacional. Além disso, a espessura da medula espinal é medido para determinar a profundidade alvo do corno ventral. A suspensão é administrada a uma profundidade de 4 mm do contacto pial. A flange feita de plástico Ultem serve como um batente na superfície pia para evitar que a agulha avança mais profundamente do que o desejado. Uma vez que a ponta da agulha está posicionado no alvo, a manga metálica rígida exterior é puxado para cima, deixando a tubagem flexível exposto. Uma vez que a injecção está terminada, a agulha é deixada no local durante um adicional de 1 min para prevenir o refluxo de células acima do trato de injecção de uma cânula. Cuidado é tomado para evitar a vasculatura superfície por ajustando levemente o microdrive ou lateralidade ou rostro-caudalmente. Alguns locais de hemorragia a partir de penetração pode ocorrer. Quando o sangramento como é encontrado, patties micro são colocadas sobre o local da punção sangramento e a sucção é aplicada a eles a pavio sangue para fora da cânula penetrção local e evitar o acúmulo na medula. Isto permite de forma confiável para que o sangue coagule. Cauterização é evitado como é a pressão direta. Após a remoção da agulha, o aparelho estereotáxico é deslocado para o local alvo ao lado ao longo do eixo rostro-caudal, separados por 2 ou 4 mm, ou conforme necessário, para evitar vasos sanguíneos visíveis sobre a superfície dorsal da medula espinhal. Este processo é repetido tantas vezes como proposto em um determinado estudo. 8. Cânula flutuante A cânula de infusão personalizado de diâmetro estreito é usado para administrar as injecções. A cânula é constituída por uma agulha de calibre 30 chanfrada de comprimento fixo ligado a uma tubagem de calibre 30 silastic flexível de comprimento variável. A extremidade distai é equipado com um luer lock Hamilton que está ligado a uma bomba de microinjector. O tubo de silastic proximal é ensheathed dentro de uma cânula de calibre 24 exterior rígida que assentos na extremidade proximal da flange da agulha de injecção. Este flange dois bancosa cânula exterior e serve como um batente de profundidade para a agulha de injecção. Para cada injecção, o volume apropriado da suspensão de terapêutica é administrada por um. Usando um pré-calibrado Minj-PD microinjector bomba (Tritech Research, Inc., Los Angeles, CA) a um caudal de 5 ul por minuto 9. Fecho Uma vez que todas as injecções foram feitas, a torre de perfuração vertebral é suavemente removido e as incisões são fechadas em quatro camadas. A dura-máter é fechado com um 4,0 Nurolon ponto, de uma forma estanque. 0 sutura Vicryl é usado para a camada mais profunda muscular. Fáscia é então fechada com sutura Vicryl 0 também de uma forma estanque. A camada dérmica é finalmente fechada com Vicryl 2,0, com um ponto de funcionamento. Fechamento da pele é concluída com fio de náilon 3-0. 10. Recuperação e Tratamento da Dor Os animais são extubados e monitorados para a recuperação da anestesia 2 horas seguintes. Em seguida, os animais são transferidos para c indivíduoidades e monitorizados pelo menos uma vez por dia para o consumo de alimentos, a defecação, micção e. Para a gestão da dor, um emplastro transdérmico de fentanilo (75 mcg) são grampeadas nas costas dos animais, durante três dias de pós-operatório, a analgesia. Além disso, a buprenorfina (0,05 mg / kg, BID, IM) também pode ser administrado durante um a três dias de pós-operatório. 11. Resultados e Resultados Representante As observações clínicas e comportamento são realizadas antes da cirurgia e depois gravados nos Dias 1 a 7 e semanalmente até ponto final de acordo com o desenho do estudo. Os dados comportamentais são coletadas para avaliar morbidade neurológica, como descrito anteriormente 6. Função sensorial é avaliada pela presença ou ausência de uma resposta de retirada do estímulo mecânico para os dedos dos membros anteriores e posteriores. Função motora segue o índice de Tarlov (Tabela 1): 0 - Paralisia, nenhum movimento; 1 - Tônus perceptível nas patas traseiras, m ligeiraovement; 2 - Movimento nas patas traseiras, mas incapaz de se sentar ou ficar; 3 - Capacidade de ficar de pé e andar, mas atáxica e por períodos curtos, 4 - A recuperação completa, a função motora normal. Segurança do processo é determinada pela capacidade de um animal para retornar à linha de base pré-cirúrgica. Déficits neurológicos transitórios deve principalmente resolver entre pós-operatórias dias 1 e 7, com algumas variações dependendo das raças animais e procedimento (número de injeções, entre outros parâmetros). Morbidade permanente é definida pela duração défices neurológicos que não se resolvem no momento em que os animais atingem ponto de extremidade padrão IACUC (Figura 2).

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	<li>Usvald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dosing+regimen+and+reproducibility+of+intraspinal+grafting+of+human+spinal+stem+cells+in+immunosuppressed+minipigs.">Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs.</a> Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).</li><li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+spinal+cord+therapeutics+delivery:+stabilized+platform+and+microelectrode+recording+guidance+validation.">Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation.</a> Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).</li><li>Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+viral+vector+direct+injection+approach+to+the+cervical+spinal+cord.">Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).</li><li>Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platform+and+Cannula+Design+Improvements+for+Spinal+Cord+Therapeutics+Delivery.">Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery.</a> Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).</li><li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+spinal+cord+therapeutics+delivery:+preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+microinjection+platform.">Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform.</a> Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).</li><li>Raore, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+multilevel+intraspinal+stem+cell+therapy:+assessment+of+surgical+risks+in+Gottingen+minipigs.">Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs.</a> Spine. 36, 164-171 (2011).</li><li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+stem+cell+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat. Rev. Neurol. , (2011).</li><li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+Stem+Cell+Transplantation+in+ALS:+A+Phase+I+Safety+Trial,+Technical+Note+&#38;+Interim+Safety+Outcomes.">Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note &#38; Interim Safety Outcomes.</a> Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).</li><li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+intraspinal+injection+of+neural+stem+cells+in+patients+with+ALS:+results+of+a+Phase+I+trial+in+12+patients.">Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients.</a> Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).</li></ol>

Dr. Boulis é o inventor de dispositivos que permitem a injecção segura e precisa da medula espinhal humana. Neuralstem, Inc. adquiriu uma licença exclusiva para essa tecnologia. Dr. Boulis recebeu partes um inventários de esta taxa, e tem os direitos sobre o pagamento de royalties para a distribuição desta tecnologia. Outros autores não têm nada a revelar.

Apesar da aprovação para prosseguir com a técnica descrita em humanos 7-9, questões críticas ainda precisam ser respondidas para que terapias da medula espinhal para o sucesso. A compreensão rigorosa de tolerância da medula espinhal para injeção intraparenquimatosa é necessária para permitir o planejamento ea execução de ensaios de desenvolvimento de terapias para desmielinizante, degenerativa e doença medular traumática. Actualmente, não existe uma compreensão clara do número de in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Derrick espinhal </td><td> Neuralstem, Inc. </td><td></td><td> Neuralstem, Inc. adquiriu uma licença exclusiva a esta tecnologia </td></tr><tr><td> Minj-PD bomba microinjector </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td></td><td> Customizado para esta aplicação específica </td></tr><tr><td> Cânula flutuante </td><td> Neuralstem, Inc. </td><td></td><td> Customizado para esta aplicação específica </td></tr></tbody></table>

surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs

Esta é a descrição compacta visual de uma combinação da técnica cirúrgica e um dispositivo para a entrega de gene (e celular) terapias para a medula espinhal. Embora a técnica é demonstrada no animal, o procedimento é aprovado pelo FDA e actualmente utilizados para o transplante de células-tronco em medula espinal de pacientes com ELA. Embora a FDA tenha reconhecido à prova de princípio, os dados sobre a eficácia terapêutica em modelos de roedores altamente caracterizados, o uso de animais de grande porte é considerado crítico para a validação da combinação de um procedimento cirúrgico, um dispositivo, e a segurança de uma terapia definitiva para uso humano . O tamanho, anatomia e vulnerabilidade geral da coluna vertebral e medula espinhal dos suínos são reconhecidos para melhor o modelo humano. Além disso, o processo cirúrgico e manipulação de expor a medula espinal, bem como o fechamento da ferida na gusa é virtualmente indistinguível do humano. Nós acreditamos que o modelo de porco saudável representa uma crítical primeiro passo do estudo de segurança processual.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Pontuação Tarlov </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Paralisia, nenhum movimento </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Tônus perceptível nos membros posteriores, o movimento ligeiro </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Movimento nas patas traseiras, mas incapaz de se sentar ou ficar </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Capacidade de ficar de pé e andar, mas atáxica e por curtos períodos </td></tr><tr><td> 4 </td><td> A recuperação...

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Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Curta descrição visual da técnica cirúrgica e um dispositivo usado para a entrega de gene (e celular) terapias para a medula espinhal. A técnica é demonstrada no animal, mas é completamente traduzíveis e sendo utilizado para a aplicação em seres humanos.

Técnica cirúrgica para entrega da Medula Espinhal de Terapias: Demonstração de Processo em Göttingen porquinhos

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

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