Este trabalho foi financiado pela Research para prevenir a cegueira e National Institutes of Health concessão EY10542.

1. Fatias de retina Preparação <ol><li> Montar a câmara (desenho ilustrado na Figura 1). Colocar duas gotas de gordura vácuo, espaçadas de ~ 8-10 mm de distância, através da câmara de registo para formar um canal para superfusate e em que para incorporar as fatias de retina. Adicione uma segunda gota de graxa alguns milímetros mais longe além de cada uma dessas duas esferas de gordura para funcionar como um dique e limite de transbordamento. Coloque um pequeno pedaço triangular de kimwipe na extremidade da câmara de fluido para garantir o contacto com o eléctrodo de referência. </li><li> Pressione um pedaço de membrana de nitrocelulose (~ 5 x 10 mm, 0,8 mM poros) plana contra a lâmina de vidro em duas pequenas gotas de gordura vácuo. Evite gorduras directamente abaixo do centro da membrana de nitrocelulose, tal como esta pode impedir a aderência da retina. </li><li> Para preparar o cortador de tecidos, quebrar uma borda dupla lâmina de barbear em 4 pedaços e coloque um no braço corte. Corte uma fatia fina de nitrocellulose membrana para garantir que a aresta de corte da lâmina fique plana contra a câmara de registo e, portanto, limpa corta através da membrana de nitrocelulose. </li><li> Manter uma pequena proveta de solução salina anfíbio (Tabela 1) em gelo na estação de esvaziamento. </li><li> Salamandra eutanásia por decapitação. Hemisect a cabeça sagital e na medula através da medula espinhal. Coloque metade da cabeça em um pedaço de algodão umedecido com solução salina anfíbio em cima de um bloco de linóleo. A outra metade da cabeça pode ser embrulhado com uma toalha de papel húmido e armazenados a 4 ° C para utilização mais tarde no dia. </li><li> Enuclear o olho. Usando pequenas Vannas tesoura, corte a pele que liga o olho à órbita ao redor. Depois de libertar a frente do olho a partir do tecido orbital ao redor, puxar o olho para a frente e deslize a tesoura sob o olhar de cortar os músculos do olho e do nervo óptico, liberando o olho da órbita. </li><li> Coloque o olho enucleado em uma cama de algodão nobloco de linóleo. Descarte o meia cabeça. Corte o excesso de gordura orbital do fundo do olho. </li><li> Adicione uma pequena incisão no centro da córnea com uma lâmina de bisturi afiado. Retire a córnea deslizando Vannas multa tesoura na incisão e prorroga o corte radial em direção ora serrata. Cortar circunferencialmente em torno ora serrata rodando o bloco de linóleo ou o algodão entre os cortes. </li><li> Depois de cortar todo o caminho ao redor do olho, retire a córnea ea lente, puxando-os para fora do lado da ocular. Mova o ocular, resultando em uma superfície dura do bloco de linóleo umedecido com solução salina anfíbio. Corte-o em três partes com uma lâmina afiada, usando um movimento de corte fino para garantir que você tenha cortado todo o caminho através da esclera. </li><li> Coloque uma ou duas peças de ocular na membrana de nitrocelulose com a superfície da retina voltada para baixo. Mergulhe os pedaços restantes com soro fisiológico adicional e colocá-los na geladeira para a 4 ° C. </li><li> Gently pressione o pedaço de ocular contra a membrana de nitrocelulose, com uma pinça fina. Imergir a membrana de nitrocelulose e um pedaço ocular com várias gotas de solução salina fria e anfíbio blot com as bordas com kimwipe ajudando a retina para aderir. Mais uma vez, submergir a ocular e da membrana de nitrocelulose, com várias gotas de solução salina fria e anfíbio descascar a esclera / coróide / retina epitélio pigmentar da retina para isolar (que podem aparecer rosa devido à presença de não branqueada rodopsina). Se necessário, o corte do nervo óptico para libertar a retina. </li><li> Se a retina não aderiu firmemente, escorrer a solução salina com um Kimwipe para puxar a retina mais firmemente para baixo sobre a membrana de nitrocelulose. Substitua a solução salina. Repetindo, se necessário. </li><li> Encher a câmara com uma solução salina fria anfíbio e transferi-lo para a fase do fatiador de tecidos. Cortar a retina e a membrana de nitrocelulose em tiras finas, trabalhando a partir de uma extremidade para a outra, rodando o micrómetro vernierem incrementos de 125 uM. Pressione a lâmina de barbear gentil mas firmemente através da retina e membrana de nitrocelulose. </li><li> Transfira as fatias da retina movendo tiras de membrana de nitrocelulose para o canal principal da câmara de gravação. Retire uma tira de membrana livre e, em seguida, mantê-lo no lugar enquanto se move a câmara por baixo, tendo a certeza de manter as fatias submerso. Incorporar as arestas da membrana de nitrocelulose em tiras de graxa vácuo, rodá-los em 90 graus para visualizar as camadas da retina. </li><li> Pressionar a membrana de nitrocelulose fixa sobre a superfície do vidro. Mesmo se não houver retina em cada peça, coloque as tiras de membrana de nitrocelulose em intervalos regulares (~ 1 mm de distância) ao longo de todo o comprimento do canal de perfusão para ajudar a quebrar a tensão superficial e aumentar o fluxo de fluido. </li></ol> 2. Gravações Whole-cell emparelhados <ol><li> Depois de todas as fatias foram transferidas, mover a câmara de registo com o estágio de uma posição vertical, fixosmicroscópio palco e prender o cabo-eletrodo de referência. Concentre-se sobre as fatias usando uma distância longa de trabalho, imersão em água, 40-60X objetiva. O microscópio deve ser colocado sobre uma mesa de ar para amortecer as vibrações e encerrado numa gaiola de Faraday para reduzir a interferência eléctrica. </li><li> Superfuse as fatias continuamente a uma taxa de 1 ml / min com solução salina anfíbio borbulhar com 100% de O 2. Ligue a sucção, certificando-se de que a entrada e saída são equilibrados. Escoamento pode ser regulado pela rotação da extremidade biselada da agulha de aspiração ou movendo o kimwipe na extremidade da câmara mais perto ou mais longe da agulha de saída. A preparação pode ser mantido à temperatura ambiente ou arrefeceu-se com um dispositivo Peltier ou simplesmente definindo um bloco de gelo sobre a platina do microscópio. </li><li> Examinar fatias sob luz fraca ou de infra-vermelho e identificar um par de células - um fotorreceptor (haste ou cone) e células horizontais ou bipolar nas proximidades - alvo para a gravação de célula inteira. Hastes podem ser identified pelos seus corpos celulares de grandes e proeminentes rod-like segmentos exteriores (Figura 2A). Cones são menores do que as hastes e tem pequenos segmentos exteriores cónicos. Células bipolares e células horizontais somas estão na fila mais exterior de corpos celulares na camada nuclear interna (INL, Figuras 2B e 2C). </li><li> Antes de preparar fatias, use um extrator pipeta para a fabricação de micropipetas de vidro de borosilicato (1,2 mm de diâmetro externo, 0,95 mm de diâmetro interno com um filamento de vidro). A ponta de cada uma micropipeta deve ser ~ 1-2 microns de diâmetro. </li><li> Usando uma agulha de enchimento não-metálicos (por exemplo, uma fabricados a partir de uma seringa de 1 cc ou a Microfil), preencha pipetas com a solução intracelular (Tabela 1) e anexar ao suporte do eletrodo. </li><li> Eleve a objetiva do microscópio ligeiramente. Posicione a pipeta fotorreceptor abaixo do objetivo e, em seguida, baixá-lo de modo que a ponta é posicionada logo acima das fatias. Repita com tsegundo ele pipeta. </li><li> Ajuste qualquer deslocamento no nível atual da linha de base no amplificador. Verificar a resistência da pipeta com um pulso despolarizante mV 5-10. Nós normalmente utilizam pipetas que variam 10-15 mohms, o resultado a longo conicidade do veio e baixa osmolaridade das soluções anfíbio pipeta. Com as soluções de osmolaridade mamíferos superiores, estes mesmos pipetas apresentam valores de resistência de ~ 8-12 mohms. Embora tenhamos usado maiores diâmetros de ponta com os valores de resistência de 3-4 mohms em soluções de anfíbios, as vantagens proporcionadas por uma resistência de acesso inferior são compensados ​​por uma maior dificuldade de vedação para as membranas celulares e uma degradação mais rápida das correntes de cálcio e outro segundo mensageiro respostas de minúsculas. </li><li> Ao aplicar pressão ligeira, a posição positiva da pipeta pós-sináptico para que ele contata o corpo da célula horizontal ou bipolar. Em seguida, posicionar a pipeta pré-sináptica de modo que entra em contacto com o corpo da célula de uma haste ou cone de fotorreceptores. Gravações APPEar a ser mais estáveis ​​quando ponteiras contacto com o segmento interno em vez da soma, especialmente em cones. </li><li> Enquanto monitoriza a resistência, libertar a pressão positiva na pipeta pós-sináptica. Por vezes, a libertação de pressão positiva é suficiente para formar uma vedação gigaohm. Se não, aplicar sucção suave, com uma seringa de 1 ml ou por via oral. Após a resistência de ponta cresceu para&gt; 100 mohms, aplicar um potencial de realização de -60 mV. Após a obtenção de um selo gigaohm, nulo quaisquer transientes de capacitância pipeta e repita o procedimento de vedação para o fotorreceptor pipeta, aplicando um potencial de realização de -70 mV. </li><li> Rupture o patch usando sua boca ou uma seringa para aplicar o vácuo para cada célula de cada vez. Rods, cones, e células bipolares vontade tipicamente ruptura com sucção suave. Obtenção de configuração de célula inteira com uma célula horizontal pode exigir uma maior sucção (ou seja, com uma seringa de 3 cc), em combinação com fortes impulsos de tensão rápidas entregues com o &quot;zap&quot; fGolpe do amplificador de patch clamp. A ruptura da membrana e estabelecimento de configuração de célula inteira será evidente pelo aparecimento de fenómenos transitórios de capacitância de célula inteira. </li><li> Confirmar a identidade da célula pós-sináptica fisiologicamente pela aplicação de um flash de luz e entregando uma série de passos de voltagem de -120 a +40 mV em incrementos de 20 mV (Figuras 3 e 4). </li><li> Para avaliar se o par de células são ligados sinapticamente, entregar uma breve (25-100 ms), 60 mV passo despolarização ao fotorreceptor (a -10 mV, próximo do pico do cálcio tipo-L por voltagem de corrente) e procurar para as correntes de pós-sinápticos no segundo neurónio ordem (Figura 5). Um passo despolarizante forte deve provocar uma corrente de influxo rápido, transiente pós-sináptica na célula pós-sináptica bipolar horizontal ou OFF causada por uma explosão de libertação de vesículas do cone (Figura 5). </li></ol>

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B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A preparação fatia retina provou ser muito útil para a análise dos circuitos e mecanismos utilizados pela retina para processar a informação visual. A capacidade de obter gravações de células inteiras simultaneamente de pré e pós-sináptica neurônios tem sido particularmente útil neste esforço. Gravações de células inteiras emparelhados são muito mais fácil de alcançar com fatias do que com os preparativos da retina plana de montagem, porque as diferentes camadas da retina estão expostos. Além disso, por causa de seus grandes neurônios da retina, salamandras têm uma longa história como uma preparação da retina e, portanto, fornecer um sistema modelo particularmente bem caracterizada. Com a prática, fatias saudáveis ​​de salamandra retina pode ser preparado regularmente. A poucos passos importantes podem fazer a diferença entre sucesso e fracasso. 1) Certifique-se de que a lâmina de barbear é montado sobre o cortador de tecidos de modo a que fique plana contra a superfície do vidro e fatias limpa embora tanto o tecido e underlyimembrana de nitrocelulose ng. Se você fez um corte limpo através da membrana de nitrocelulose, você deve ouvir um leve clique quando a lâmina atinge a superfície da lâmina de vidro. 2) Certifique-se que a retina tenha aderido à membrana de nitrocelulose. Caso contrário, a retina pode flutuar para longe da membrana durante qualquer passo dos procedimentos. 3) Não exponha as fatias cortadas ao ar, pois isso irá prejudicar muitas das células superficiais. 4) Certifique-se as fatias e membrana de nitrocelulose deitado contra a lâmina de vidro para que as camadas da retina são visíveis sob o microscópio de dissecação. 5) Equilibre as taxas de entrada e saída superfusate para evitar transbordamento da câmara de gravação. Isto impede que as alterações súbitas nos níveis de solução, o que pode causar movimentos abruptos de tecidos. 6) Selecção de um par de células saudáveis ​​próximos uns dos outros. Células com citoplasma lisa são mais saudáveis ​​do que as células com citoplasma granuloso. As células mais profundas na fatia são mais propensos a reter con sináptica intactacontatos. 7) Certifique-se que a ponta da pipeta não tenha quebrado ou roçou outro tecido ou detritos no meio do caminho para as células. 8) Verificar a resistência pipeta para garantir que ele não está entupido com detritos ou uma bolha, o que pode tornar difícil a obtenção de uma gravação de célula inteira de qualidade. Em vez de fixar a retina para papel de filtro de nitrocelulose, alguns investigadores incorporar retinas num bloco de agar e usar um vibratome para cortar fatias de retina. Apesar de não ter tentado esta abordagem, Kim et al. 11 discutir as vantagens de ambas as abordagens. Em sua experiência, a abordagem baseada em agar fornece um rendimento mais consistente de fatias planas com camadas da retina bem delineados, mas abordagem baseada em papel do filtro produz fotorreceptores saudáveis. Cones e bastonetes são responsáveis ​​pela transdução de luz em mudanças no potencial da membrana. Com gravações emparelhadas, o potencial de bastonetes ou cones membrana pode ser manipulated diretamente e assim a capacidade para gerar respostas de luz, embora útil para a identificação de tipos de células, pode não ser essencial. Por isso, muitas vezes preparar fatias de luz branca. No entanto, mesmo quando preparado sob iluminação brilhante, salamandra neurónios da retina pode gerar grandes respostas de luz, tal como ilustrado pelas respostas na FIG. 3. Isto é em parte devido a um número relativamente grande reservatório de cromóforo no grande volume de segmento externo, mas também podem reflectir a capacidade das células para regenerar Müller 11-cis-retinal para cones 12. Para obter respostas totalmente claras de adaptação ao escuro, pode-se preparar as fatias sob iluminação infravermelha. Para dissecções sob luz infravermelha, damos GenIII intensificadores de imagem (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) para as oculares do microscópio de dissecação e iluminar o tecido com uma lanterna LED infravermelho. Para cortar e outros procedimentos que não são realizados sob o microscópio de dissecação, nós empregamos uma head-mounted image intensificador. Para a colocação das pipetas de correção, nós visualizamos fatias usando uma câmera CCD infravermelho sensível (por exemplo, Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) montado na vertical, microscópio de fase fixa. Com estas precauções, pode-se obter respostas haste exibindo sensibilidade única fóton 6, 13. Uma limitação do trabalho em fatias retina é que os longos processos celulares de campo grandes neurônios da retina pode perder muitos de seus dendritos durante o processo de corte. Preparações fatia retinianas são, portanto, mais úteis para o estudo da fisiologia de células em que os contactos sinápticos envolvem processos para fechar o corpo da célula. Retinas de anfíbios e mamíferos compartilham muitos dos mesmos tipos de células e utilizar mecanismos fisiológicos semelhantes 14-16. Enquanto salamandra retina é um bom modelo para muitos aspectos da retina dos mamíferos, uma diferença importante parece ser a presença de uma via de vareta dedicada em mamíferos que involves contatos de células especializadas haste bipolares em células amácrinas AII 14. Uma limitação adicional da retina salamandra é o pequeno número de ferramentas genéticas desenvolvidas especificamente para esta espécie. No entanto, os anticorpos e reagentes que têm como alvo regiões shRNA bem conservados em outras espécies podem ser utilizadas com êxito na salamandra, como podem muitos inibidores de moléculas pequenas e reagentes peptídicos. Além disso, com algumas modificações na técnica, as fatias da retina podem ser preparados a partir de outras espécies em que algumas dessas ferramentas são mais prontamente disponíveis. Para além da sua utilidade para o registo de células inteiras emparelhado, a preparação de retina salamandra fatia é também compatível com uma variedade de outras abordagens. Como discutido acima, as fatias da retina pode ser usado para estudar as respostas de luz em combinação com vários protocolos de fixador de tensão 17. Neurónios da retina pode também ser carregada com corantes fluorescentes sensíveis ao Ca2 +, Cl -, ou Na+ Introduzido através da pipeta patch ou por banho-aplicação 15,18-20. Um péptido fluorescente que se liga à fita 21 sináptica pode ser introduzido através da pipeta patch e utilizado para imagiologia da fita 10, ou, quando conjugado com fluoresceína, para intensamente e selectivamente danificar a fita 22. Temos também utilizado fatias de retina em combinação com pontos quânticos para monitorar os movimentos dos canais de cálcio individuais em haste e cone terminais sinápticos 23. Assim, a fatia da retina vertical é uma preparação experimental versátil para o estudo dos mecanismos básicos sinápticas e as funções de processamento única realizadas na primeira sinapse, a via de sinalização visual.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

Uma das tarefas centrais da retina neurociência é compreender os circuitos de neurônios da retina e como essas conexões são responsáveis ​​por moldar os sinais transmitidos para o cérebro. Os fótons são detectados na retina por haste e cone fotorreceptores, que convertem a energia em um sinal elétrico, transmiti-lo a outros neurônios da retina, onde é processado e comunicado a alvos centrais do cérebro através do nervo óptico. Primeiros insights importantes sobre os circuitos da retina e processamento visual veio dos estudos histológicos de 1,2 Cajal e, posteriormente, a partir de registros eletrofisiológicos da atividade spiking de células ganglionares da retina - as células da retina 3,4 de saída. Uma compreensão detalhada do processamento visual na retina requer uma compreensão da sinalização em cada passo na via de fotorreceptores de células ganglionares da retina. No entanto, muitos tipos de células da retina são burIED profunda no tecido e, portanto, relativamente inacessível para a gravação eletrofisiológico. Esta limitação pode ser superada por trabalhar com fatias verticais, nas quais as células que residem dentro de cada uma das camadas da retina são claramente visíveis e acessíveis para gravação electrofisiológico. Aqui, descrevemos um método para fazer seções verticais de retinas de larval salamandras tigre (Ambystoma tigrinum). Embora esta preparação foi originalmente desenvolvida para as gravações com microeléctrodos afiadas 5,6, é descrito um método para a gravação de fixação de tensão dupla de células inteiras a partir de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem em que manipulam o potencial de membrana do fotorreceptor enquanto grava simultaneamente pós- as respostas sinápticas em células horizontais ou bipolar. Os fotorreceptores da salamandra tigre são consideravelmente maiores do que os das espécies de mamíferos, tornando esta uma preparação ideal para realizar tsua abordagem experimental tecnicamente desafiador. Estas experiências são descritas com um olho para investigar as propriedades de sinalização da fita sináptica - uma estrutura sináptica especializada encontrado em um apenas um punhado de neurônios, incluindo a haste e cone fotorreceptores, que é bem adequado para a manutenção de uma elevada taxa de tônico liberação de neurotransmissores 7 , 8 - e como ela contribui para as propriedades de sinalização únicos deste primeiro sinapse da retina.

Vestígios representativos das respostas de luz a partir de neurónios em fatias verticais de salamandra retina são mostrados na Figura 3. O cone, célula horizontal e OFF célula bipolar tudo exibir uma corrente externa em resposta ao aparecimento de luz. O destaque atual para dentro após o flash de luz nas gravações de células horizontais e bipolar é causada pelo aumento da liberação de glutamato de fotorreceptores como despolarizar no deslocamento da luz. A ON célula bipolar responde com uma corrente interna no início da luz resultante de um receptor de glutamato metabotrópicos cascata de sinalização e ativação de canais TRPM1 9 sign-inversora. Células horizontais e células bipolares podem ser distinguidas uma da outra pela sua relações IV (Figura 4). Células horizontais têm tipicamente uma resistência de entrada de cadeia linear ou de rectificação para dentro e IV baixa (&lt;500 mohms, Figura 4A), enquanto as células bipolares têm uma elevada resistência de entrada(0,5-2 GÊ) e exteriormente, retificando I - V (Figura 4B) A Figura 5 mostra resultados representativos a partir de gravações de um par de células cone-horizontal (Figura 5A) e cone-OFF par célula bipolar (Figura 5B).. Em cada uma, o cone despolarizantes para -10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV evocada uma corrente no interior do cone e EPSC rápida na célula horizontal ou bipolar cálcio dependentes da voltagem. Esta forte estímulo é suficiente para esvaziar o conjunto prontamente libertável de ~ 20 de cada fita de vesículas sinápticas, resultando numa EPSC de ~ 47 pA / fita 10. O EPSC célula horizontal na Figura 5A foi 232 pA, sugerindo que recebeu 5 contatos fita do cone pré-sináptico. A estimativa similar do 178 pA EPSC no celular desligado bipolar (Figura 5B) sugere que ele recebeu 4 contatos fita do cone pré-sináptico. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Anfíbio salina </td><td> Pipeta pré-sináptico </td><td> Pipeta Postsynaptic </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 5mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-Glutamato * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconato ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Cloreto Tetraethylammonium </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5mM </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolaridade **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamato é feita por neutralização de 40 mM de ácido L-glutâmico, com 40 mM na solução de CsOH pipeta. ** Um estoque de Cs-gluconato de 1 M é feita por neutralizar uma solução de CsOH com 45-50% de ácido D-glucônico. *** O pH deve ser ajustado com NaOH para a solução extracelular e CsOH para as soluções de pipeta. **** Mantendo a osmolaridade das soluções de pipeta logo abaixo da temperatura da solução extracelular impede inchaço celular e aumenta a longevidade da gravação. Mesa1. Componentes e parâmetros para as soluções intra e extracelulares padrão utilizado neste protocolo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figura 1. Desenho da câmara de gravação. (AC) Top, lateral e cortante vistas da câmara de gravação mostrando dimensões. A câmara é usinado a partir de um pedaço de espessura 2 mm de acrílico. (D) câmara montada. Superfusate entra na câmara através de um comprimento de 10 cm de Teflon tubo (tubo de entrada; tipo 24LW). Superfusate é removido por aplicação de sucção leve a um tubo de metal de calibre 20 chanfrada, no outro lado da câmara. Adjacente a este tubo de saída é um eléctrodo de referência de Ag / AgCl de sedimento. A vantagem deste eléctrodo de referência está ligada à entrada de referência do headstage. Um pequeno triângulo de Kimwipeé colocada sobre o eléctrodo de referência para mantê-lo em contacto com a solução e regular o fluxo de solução para dentro do tubo de saída. A base da câmara é formada por colocação de uma lâmina de microscópio de vidro nas bordas de recesso da câmara. O slide é mantido no lugar com uma gota de graxa de vácuo. As tiras de membrana de nitrocelulose com as fatias de retina são incorporados nos grânulos de graxa de vácuo, que formam um canal para a solução de fluxo. Antes de fazer fatias, uma x 10 mm pedaço de membrana de nitrocelulose 5 é fixada à câmara com duas pequenas gotas de gordura vácuo. Um pedaço da ocular é colocada lado vítrea para baixo nesta membrana de nitrocelulose e levantou fora uma vez que os adere retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figura 2. Pares de células cheias de corante em vepreparação fatia rtical. A) Imagens de uma vara e célula horizontal sinapticamente acoplado que foram preenchidos com contraste corantes fluorescentes introduzidas através da pipeta de patch durante a gravação de célula inteira simultânea. Lúcifer amarelo (2 mg / ml), foi incluída na solução pipeta haste (amarelo) e sulfarhodamine B (1 mg / ml), foi incluída na solução pipeta célula horizontal (roxo). Imagens fluorescentes foram capturados usando um disco giratório microscópio confocal (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipado com uma câmera CCD refrigerado (Orca ER) e subiu ao microscópio palco fixo (Nikon E600 FN com 60X, 1,0 NA objetiva de imersão em água). Estas imagens foram sobrepostas em imagens de campo claro das fatias da retina correspondentes usando o Adobe Photoshop. B) Imagens de um cone e sinapticamente acoplados OFF célula bipolar. O terminal do axônio da célula bipolar ramifica no exterior sublamina (S1) da camada plexiforme interna, perto da fronteira com a camada nuclear interna. <strong&gt; C) Imagens de um cone e células horizontal sinapticamente acoplado. Note-se que os terminais de cone são consideravelmente maiores do que o terminal axonal da haste. Embora as células horizontais pode ser identificada pela forma oblonga dos seus corpos celulares, corpos celulares de células e-NO bipolares do tipo fora na INL não pode ser facilmente distinguida antes da gravação. No entanto, pode ter como alvo uma deslocado cone expulsos células bipolares, que têm corpos celulares no ONL e podem ser distinguidas a partir de cones com a ausência dos segmentos interno e externo. A barra de escala é de 20 mM. <img alt="Figura 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figura 3. Correntes registrados no braçadeira de tensão a partir de quatro diferentes neurônios da retina em resposta a um 500 ms flash brilhante de luz branca de luz evocada. Cone O (A), a célula horizontal <strong&gt; (B), e fora da célula bipolar (C) todos responderam à luz com uma corrente para fora. (D) A na célula bipolar respondeu ao mesmo estímulo de luz com uma corrente para dentro. O ruído da linha de base exibido pela célula bipolar off (C) reflete uma liberação contínua de vesículas sinápticas na escuridão que diminui quando fotorreceptores hiperpolarizar na luz. As respostas a estas quatro células foram obtidas em gravações separadas usando fatias preparadas de acordo com a luz branca. A intensidade do estímulo de luz branca utilizada nestes exemplos produzido respostas em células horizontais e bipolares equivalentes a 580 nm, fluxo de fótons de 1 x 10 5 fotões / sec / 2 mM. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figura 4. Relações corrente-tensão (IV) de horizontal células bipolares e desligado. (A) O painel de topo, as correntes de membrana evocados por uma série de passos de voltagem de 150 mseg, de -120 a +40 mV aplicada em incrementos de 20 mV (painel inferior) para uma célula horizontal. Células horizontais tipicamente têm uma baixa resistência de entrada e as relações lineares ou interiormente rectificação IV. (B) a relação IV de uma célula bipolar fora em resposta a uma série de degraus de tensão. Células bipolares têm uma maior resistência de entrada e um IV exteriormente rectificação, devido à ativação de correntes de voltagem-dependentes de potássio. <img alt="Figura 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de gravação de dados emparelhados. (A) Gravação do cone corrente de cálcio voltagem-dependentes (Cone I Ca </sub&gt;) em resposta a um passo de 100 ms a -10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV (Cone m V). Vazamento e capacitância transientes foram subtraídos usando um vazamento protocolo subtração P / 8. Uma corrente rápida excitatório pós-sináptico (EPSC; HC PSC) foi gravada simultaneamente a partir de uma célula horizontal, mostrando que estas duas células são sinapticamente acoplado (B) Uma EPSC foi registada numa célula bipolar fora em resposta ao mesmo estímulo noutro. cone.

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Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) E explicar como usamos essas fatias para estudar o processamento sináptico na retina através da obtenção de gravações braçadeira de tensão de célula inteira dupla de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem.

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K visualizações.  University of Nebraska Medical Center. Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre ( Ambystoma tigrinum) E explicar como usamos essas fatias para estudar o processamento sináptico na retina através da obtenção de gravações braçadeira de tensão de célula inteira dupla de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem.

Vídeo: Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Neurociência

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...