Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Agradecemos a Darwin Pendure a assistência técnica.

Declaração de Uso de Animais: Os animais foram tratados de acordo com orientações descritas no Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, usando protocolos aprovados pela Universidade de Minnesota Animal Care Institucional e Comitê de uso. 1) Preparação das soluções <ol><li> Antes de realizar a gravação eletrofisiológico, soluções intracelular, extracelular e enzimas precisam estar preparados. </li><li> Solução extracelular: uma garrafa de mistura (8.8g) de meio de pó de Ames (Sigma) com 1 l de H 2 O e 1,9 g de bicarbonato de sódio (23 mM). Em todos os pontos da solução extracelular está saturado com 95% O 2 / 5% CO 2 da mistura de gases. Transferência de 200 mL para um copo para armazenamento de retina. Coloque a solução restante no recipiente de sistema de perfusão para a perfusão gravidade uma vez retina está montado. </li><li> Solução intracelular: solução intracelular deveria ter sido feito anteriormente e depois aliquotado em alíquotas 500-1000 mL e armazenadas a -20 ° C. Solução intracelular varia de acordo com a experiência necessária, para gravações de pinça de corrente mostrado aqui usamos (em mM): 125 K gluconato, 2 CaCl 2, MgCl 2 2, EGTA 10, 10 HEPES, 2-Na 2 ATP, 0,5 mM NaGTP pH para 7,2 com KOH 5. Um traçador fluorescente como 10 mM Alexafluor-594 hidrazida (Invitrogen) podem ser adicionados para visualizar dendrites durante o experimento, e neurobiotin (0,3%) também podem ser incluídos para a análise da anatomia das células após a gravação. Quando estiver pronto para gravar, descongelar solução intracelular. </li><li> Solução enzimática: Combine 10000 Unidades colagenase (Chemicals Worthington) com 83 mg Hialuronidase (Chemicals Worthington) em 4,150 mL de solução extracelular. Loja em 50 mL alíquotas a -20 ° C. Alíquotas pode ser usado por várias semanas. Quando estiver pronto para tratar a retina, diluir em 500 mL alíquota de bolhas solução extracelular. </li><li> De fosfato tamponada (PBS): Em 800 mL de H 2 O adicionar 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na 2 HPO 4 e 0,24 g de KH 2 PO 4. Trazer o pH para 7,4 com NaOH. Ajustar o volume para 1 L. </li><li> 0,2 M de tampão fosfato: Em 800 ml de H 2 O adicionar 21,8 g de Na 2 HPO 4 e 6,4 g de NaH 2 PO 4. Trazer volume de 1 L. </li><li> Solução de paraformaldeído 4%: Heat 50ml H 2 O a 60 ° C. Adicionar paraformaldeído 4g, mexa por alguns minutos. Adicione algumas gotas de NaOH 1M (cerca de 5 gotas), continue a mexer até que a solução é clara. Adicionar 50 ml de tampão fosfato 0,2 M em béquer. Verificar o pH com tiras de pH (~ 7,4). Filtro e cool. </li><li> Solução de bloqueio (soro de cabra 10%, 0,5% TritonX100): Em 1,8 ml de PBS adicionar 0,2 ml de soro de cabra e 10 mL Triton X-100. TritonX-100 serve para permeabilise o tecido. </li><li> Estreptavidina solução (soro de cabra 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 Estreptavidina 594): Em 1,9 ml de PBS adicionar 0,1 ml de soro de cabra, 10 mL Triton X-100 e 4 mL de Estreptavidina 594. </li></ol> 2) Isolamento de retina de rato Ferramentas de dissecção necessários: 1 # 2 Pinça, 2 # 5 pinças, tesouras oftalmológica <ol><li> Euthanize do mouse de acordo com protocolos aprovados, neste caso, CO 2 asfixia e globo ocular enuclear suavemente inserir um ângulo # 2 pinças atrás do olho e levantando o globo ocular. </li><li> Lugar do globo ocular em uma placa de Petri 35 mm com solução extracelular. Cortar o nervo óptico e qualquer músculos extra-oculares associadas ou tecido conjuntivo com uma tesoura oftalmológica. Cortar a córnea com uma tesoura oftalmológica e retirar a lente usando # 5 fórceps. Rasgar a esclera usando um par de fórceps # 5 e use a pinça para cortar o nervo ótico, onde a retina ea esclera se encontram no disco óptico. Descascar delicadamente a retina de distância da ocular. Dica: Faça cada passo em ambas as retinas antes de passar para a próxima etapa para minimizar o tempo. </li><li> Use uma pinça para remover vítreo ligado à retina. Isto pode ser realizado por &quot;agarrar&quot; o vítreo transparente acima da retina com uma pinça. O vítreo, se removido com êxito, deve ser visível como uma substância clara e gelatinosa sobre o fórceps. Dica: Cortar pela metade retinas remoção do vítreo seguinte irá maximizar a quantidade de tecido utilizável e fazer a montagem na câmara mais fácil. </li><li> Manter o retinas em solução extracelular oxigenada à temperatura ambiente em um ambiente escuro com luz ambiente mínima até que estejam prontos para ser digerida. Retinas pode ser armazenado desta forma para a 6 horas. </li></ol> 3) O tratamento da retina com a mistura de enzima e de montagem na câmara de gravação <ol><li> Diluir uma alíquota de colagenase / hialuronidase em 500 mL de solução extracelular, a solução de colocar em um prato de Petri 35 mm e transferir a retina. </li><li> Manter a retina contêming placa de Petri, coberta e na escuridão, em 95% O2 / 5% CO 2 ambiente por 15 min com agitação suave. Este passo ajuda na digestão de qualquer vítreo restantes e permite fácil acesso à camada de células ganglionares. Dica: para retinas de animais mais jovens com menos vítreo ou se os efeitos adversos são observados, o tempo pode ser reduzido para aproximadamente 5 minutos. </li><li> Remover retina de enzimas contendo meio e lave bastante em solução extracelular </li><li> Transferir a retina na gravação da câmara 6 com a camada de fotorreceptores virada para baixo. Wick longe líquido restante com um pipeta ou tecido e um roll out lados da retina para achatar tecido que está sendo cuidado para tocar somente nas bordas da retina, principalmente evitando o contato com a camada de células ganglionares. Coloque um anel de platina com malha de nylon mais de retina para ancorar o tecido e imediatamente preencher a câmara com solução extracelular. </li><li> Monte a câmara de gravação para o palco microscópio, anexar tubo para perfusão gravidade e sucção a vácuo e anexar fio terra. </li></ol> 4) A localização das células ganglionares EGFP expressar e estimulação luminosa <ol><li> Perfundir a retina por gravidade com solução extracelular em uma taxa mL / min ou mais rápido. Dica: Se a taxa de perfusão é muito lento, o tecido não serão suficientemente oxigenado e sinalização sináptica pode ser interrompido. </li><li> Preencha uma pipeta de gravação com a solução intracelular e inseri-lo no suporte da pipeta. Dica: Pipetas com resistências na faixa de 3 a 5MΩ dar os melhores resultados. </li><li> Visualizar a retina sob infravermelho contraste de interferência diferencial (DIC) óptica com pequeno aumento (objetiva de 10X, NA 0,3) para localizar a pipeta de gravação. A luz infravermelha é usada para minimizar a exposição da retina à luz visível e minimizar adaptação luz. Mover-se para maior ampliação (objetiva de 40X, NA 0,8) e trazê-eletrodo à vista logo acima do tecido. </li><li> Em grande aumento (objetiva de 40X), iluminam a retina com epifluorescência (480 nm para EGFP) e selecione um gânglio fluorescentes e marca no monitor do computador com fita (Figura 1A). </li><li> Sob iluminação DIC e infravermelho, a posição do eletrodo de registro junto à células ganglionares específicas (Figura 1A). Limpe a área imediatamente cobrindo celular através da aplicação de pressão positiva suave para eletrodo de registro por meio de uma seringa de plástico 12cc conectados ao titular da pipeta com tubulação de polietileno. No amplificador, zero qualquer offsets de tensão. Eletrodo lugar em células ganglionares selecionado até que uma ondulação aparece na superfície da célula. </li><li> Com o amplificador no modo braçadeira de tensão, aplicar um pulso de teste e monitorar a passagem de corrente através da pipeta. Aplicar pressão negativa para criar vedação entre eletrodo e da célula. Liberação de pressão negativa quando a célula começa a vedação e espere até que corrente de retenção é indicativo de um selo GÊ elétrica entre a membrana da célula e pipeta. Aplicar suaves impulsos de pressão negativa até transientes capacitivo aparecer e, em seguida, liberar qualquer aplicação de pressão. Dica: se a resistência de acesso (série) é alta (&gt; 30MΩ), muitas vezes isso pode ser amenizada por outras, muito suave, os pulsos de pressão negativa. </li><li> Uma vez que um selo estável foi atingida aplicar um pulso de pressão negativa. Após o modo de toda a célula é obtido, permitem célula para se adaptar escuro por 5 minutos. Registro, no atual modo de fixação de resposta, para full-campo estímulo de luz branca (Figura 1B). </li><li> Após a gravação, Alexafluor-594 terá difundido para os dendritos. O marcador pode ser visualizado sob epifluorescência, em 594 nm e usado para determinar se um gânglio é On, Off, ou Bi-estratificada por alternar entre epifluorescência e DIC óptica infravermelha 5. </li><li> Se neurobiotin está incluído na pipeta e retina vai ser processadas para imunohistoquímica, em seguida, pipeta deve ser cuidadosamente recolhido para proporcionar o mínimo de interrupção da membrana. </li></ol> 5) A análise da anatomia das células ganglionares gravado Enchimento com neurobiotin permite uma análise mais detalhada morfológicas de células ganglionares da gravação. Dica: Se correlações específicas entre um gânglio gravado e morfologia detalhada é desejada, pode ser melhor para gravar e preencher apenas um RGC por preparação. <ol><li> Se neurobiotin foi incluído na solução intracelular, em seguida, colocar a retina em solução paraformaldeído e corrigir durante a noite a 4 ° C. </li><li> Enxágüe em PBS, pelo menos duas horas, pelo menos 6 mudanças. Transferir a retina de um prato contendo solução de bloqueio. Deixe em solução de bloqueio por 2 horas, temperatura ambiente em agitador. </li><li> Substituir a solução de bloqueio com a solução de estreptavidina. Incubar por 2 dias a 4 ° C em shaker. Lavar a retina em PBS, 6 lavagens, 20 min cada. </li><li> Monte a retina com Vectashield em uma lâmina de vidro.A retina deve ser colocado com as células ganglionares para cima. Realizar microscopia confocal (Figura 1C). </li></ol> Resultados representante Se a retina é saudável e, a dissecção foi bem sucedida, as células ganglionares indivíduo deve ser visível sob DIC em grandes ampliações (Figura 1A). Retinas insalubres terá núcleos, grandes granulado e deve ser descartada. Se a resposta sináptica de uma dada célula ganglionar está intacta, então a célula deve responder no início da luz ou compensado com potenciais de ação e, no caso de células ganglionares intrinsecamente fotossensíveis (Figura 1B), uma despolarização sustentada. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Localização, gravação e coloração de uma célula ganglionares da retina fluorescente etiquetado. (A) GFP RGC positiva visualizado sob iluminação de epifluorescência no aumento de 40 vezes (painel à esquerda) e sob iluminação DIC (painel direito). (B) a resposta de uma luz Synaptic células ganglionares da retina M2 intrinsecamente fotossensíveis registrados em todo o celular modo pinça de corrente de RGC fluorescente etiquetado. (C) M1 células ganglionares da retina intrinsecamente fotossensíveis que foi identificado sob epifluorescência, alvo de toda célula de gravação, cheia de neurobiotin, e então processadas para imunohistoquímica.

<ol>
	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

Esta técnica é aplicável a qualquer gravações ganglionares da retina de células a partir de uma retina isolada. Embora na linha do rato usado acima intrinsecamente fotossensíveis, melanopsina expressando RGCs são rotulados com EGFP 2, 5, este protocolo é facilmente transferível para outros fluorescente etiquetado linhas RGC ou pode ser generalizada para gravar a partir de RGCs selecionados aleatoriamente também. Esta técnica é particularmente valioso porque o arbor dendríticas de cada RGC e seus...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

Os primeiros passos na visão dos vertebrados ocorrem quando a luz estimula a bastonetes e cones da retina 1. Essas informações são então segregados em que são conhecidas como as vias de ON e OFF. A informação do sinal fotorreceptores de luz para as células bipolares (BCs), que despolarizar em resposta ao aumento (On ​​BCs) ou diminui (Off BCs) na intensidade da luz. Essa segregação da informação luz é mantido no nível das células ganglionares da retina (RGCs), que têm dendritos estratificação em qualquer sublamina o Off da camada plexiforme interna (IPL), onde recebem entrada excitatória direta de Off BCs, ou estratificação em o sublamina On do IPL, onde recebem entrada excitatória direta de On BCs. Essa segregação de informações sobre aumentos ou diminuições de iluminação (a On e Off caminhos) é conservada e sinalizada para o cérebro em paralelo. O RGCs são as células de saída da retina, e são, portanto, uma célula importante para o estudo, a fim de entender como a informação de luz é um sinal para os núcleos visuais no cérebro. Avanços da genética do rato nas últimas décadas resultaram em uma variedade de linhas repórter fluorescente mouse onde populações específicas RGC são rotulados com uma proteína fluorescente para permitir a identificação de subtipos RGC 2 3 4 e específicas destinadas para gravação eletrofisiológico. Aqui, apresentamos um método para a gravação respostas luz de células ganglionares fluorescente etiquetado em um intacto, isolado de retina. Esta preparação isolada da retina permite gravações de RGCs onde o arbor dendríticas está intacta e as entradas em todo o arbor dendríticas toda RGC são preservadas. Este método é aplicável em uma variedade de subtipos de células ganglionares e é passível de uma grande variedade de uma única célula técnicas fisiológicas.

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K visualizações.  University of Minnesota. Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Neurociência

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Marcação retrógrada de células ganglionares da retina em Zebrafish Adulto com corantes fluorescentes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Single-cell RNA-Seq de subgrupos definidos de células de gânglio retiniano

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Preparação de Cryo-seções retinal do rato para immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

Isolamento da retina de camundongos e tratamento com metanol para estudar células ganglionares da retina

Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in RGCs have a close relationship with numerous retinal degenerative diseases. Whole-mount retinal immunostaining is frequently used in experimental studies on RGCs to evaluate the developmental and pathological conditions of the retina. Under some circumstances, some valuable retina samples, such as those from transgenic mice, may need to be retained for a long period without affecting the morphology or number of RGCs. For credible and reproducible experimental results, using an effective preserving medium is essential. Here, we describe the effect of methanol as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage. In brief, during the isolation process, cold methanol (&#8722;20 &#176;C) is pipetted onto the surface of the retina to help fix the tissues and facilitate their permeability, and then the retinas can be stored in cold methanol (&#8722;20 &#176;C) before being immunostained. This protocol describes the retina isolation workflow and tissue sample storage protocol, which is useful and practical for the investigation of RGCs.

Autor em destaque: Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina  

Methanol can be used as an auxiliary fixed medium for retinal whole-mount preparations and long-term storage, which is useful for the investigation of retinal ganglion cells.

Preparação de montagem inteira à base de metanol para a investigação de células ganglionares da retina

Retinal ganglion cells (RGCs), which are the projection neurons of the retina, propagate external visual information to the brain. Pathological changes in ...