Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Silvia B Campos-Bilderback e George J Rhodes para a realização dos procedimentos cirúrgicos envolvendo a colocação de linhas de acesso venoso. Eles também gostariam de agradecer a Sara E Desmame para manter as colônias Munich-Wistar, que consistem em Simonsen e cepas Frömter.

1. Conjugação de albumina de soro de rato Sulfo-rodamina 101 sulfonilo (vermelho do Texas) <ol><li> Dissolve-se 100 mg de albumina de soro de rato (RSA) em 6.667 ml de bicarbonato de sódio a 100 mM pH 9,0; concentração final de 15 mg / ml num tubo de 50 mL cónico. </li><li> Solução lugar no gelo / água copo e legal entre 0 e 4 ° C. </li><li> Adicionar 200 mL de dimetil formamida anidra qualidade elevada (DMF) a um frasco de 10 mg de cloreto de sulfonilo vermelho do Texas (TRSC); vórtice no meio durante 15 seg. </li><li> Solução RSA Vortex no meio e adicione o TRSC dissolvido. </li><li> Envoltório cónico de 50 ml em folha (Parafilm pode ser usado para assegurar uma vedação hermética é formada), local horizontalmente w / gelo e apenas lugar no balancim solução a agitar lentamente (para evitar a formação de bolhas) no balde de gelo, para permitir a reacção prosseguir a 0 a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Adicione 5 L de solução salina a 0,9%, e molhar um peso molecular de 50 kDa cortado câmara, que pode ser tanto uma) membrana de diálise com clipes, b) ditubagem ÁLISE como num flutuador-a-lyzer, ou c) da cassete Slide-a-lyzer (todos adequados para a remoção de TRSC não conjugada). </li><li> Mistura de reacção lugar na câmara de diálise e colocar no recipiente de 5 L w / solução salina a 0,9%, dializar durante a noite a 4 ° C, com uma agitação suave, utilizando uma barra de agitação. </li><li> Alterar a solução de diálise de 5 L de manhã e no fim da tarde até uma incubação durante a noite resulta em praticamente nenhuma mudança de cor (Isto normalmente leva ~ 48 h, com pelo menos quatro trocas). Além disso, com o MWCO de 50 kDa estar tão perto do MW de RSA, 66kDa, que nunca é possível produzir uma solução límpida, que será dependente da distribuição do tamanho de poro da membrana, 60 horas e 5 trocas é tempo mais do que suficiente. </li><li> Medir o volume e se dividir o peso inicial de 100 mg por o volume para dar uma concentração aproximada de TR-RSA; tipicamente concentrações intervalo 10-13 mg / ml. O corante final: razão de albumina deve ser ~ 4:1, um fluoróforo por 15,000 Daltons de massa molecular da proteína. Armazenar a 4 ° C; NUNCA congelar a solução TR-RSA, como resultado a fragmentação que pode ocorrer se alterar os valores de permeabilidade. </li></ol> 2. Preparando o Microscópio Stage invertido para a imagem latente / Microscópio Configurações <ol><li> Ponto ~ 4-7 pedaços de fita de autoclave (aproximadamente ¾ &quot;de comprimento) perfeitamente empilhadas umas sobre as outras no interior de 50 mm com um prato inferior lamela de 40 mm (lamela prato inferior). Estes devem ser colocados mais perto de uma das arestas de modo que o borda da fita vai entrar em contacto com a borda de curvatura do rim, mas não bloquear o caminho da luz objectivo (Figuras 1A e 1B), ratos maiores exigirá mais espaço entre a fita ea aresta de prato. </li><li> Colocar duas almofadas Repti-Therm próximos à fase juntamente com os primeiros 50 mm prato (Figura 1A). Coloque um aquecimento da água da camisa cobertor sobre o palco. </li><li> Maximizar a eficiência na recolha de imagens, assegurando a torre objetivo tem o ar 10xr 20x (ar ou água de imersão) a objetiva de imersão em água de maior potência para coletar imagens para a quantificação objetiva e. </li><li> Durante as imagens do modo mais eficiente para adicionar água para os objectivos está a rodar para o lado e adicionar água usando uma seringa de 1 cc com uma peça longa de tubo de PE-200, que pode atingir o topo dos objectivos. </li><li> Definir a intensidade da excitação do laser 10watt a ~ 15-20%, utilizando os filtros de densidade neutra em relação ao software. O arsenieto de gálio fosforeto fotodetectores não descanned estão definidos para 750 para coletar as emissões verdes, e 625 para recolher as emissões vermelhas. Emissão azul (tal como a mancha nuclear Hoechst 33342) são recolhidos utilizando um detector de multialkaline nondescanned padrão com uma definição entre 750-800. </li><li> Para assegurar a correcta recolha das emissões de baixa intensidade no espaço de Bowman, certifique-se os limites inferiores dos detectores são ajustados de modo a não excluir esses valores. Marcadores de aviso visual irá indicar se a sensibilidadeajuste é demasiado baixo e estes valores são sendo dado um valor de intensidade de zero. </li><li> Carregue uma seringa de 1 cc com ~ 5-8 mg da solução de albumina fluorescente diluído com solução salina 0,9% estéril para abrir o volume total de 1 cc. </li></ol> 3. A exposição do Rim em Munich Wistar Rat para Intravital dois fótons de imagem <ol><li> Comece com um rato pré-anestesiados usando Pentabarbitol (50 mg / ml de solução, μl/100 120 g de peso corporal), Inactina (130 mg / ml de solução, μ/100 120 g de peso corporal), ou Isofluorano (indução 5%, 1,5 a manutenção 2,5%), uma linha de acesso venoso residente (venosa ou femoral ou jugular), e do flanco esquerdo raspada a partir debaixo da caixa torácica para apenas acima da coxa esquerda. </li><li> Coloque o rato plana em seu lado direito, para que o lado esquerdo raspada está voltada para cima, certifique-se que está sobre a mesa, com a sua postura alongada e não agachado, com as patas dianteiras tocando um ao outro e as patas traseiras tocar uns aos outros (Figura 2A). </li&gt; <li> Muito apalpar suavemente para sentir o rim para determinar onde ele naturalmente coloca dentro do retroperitônio e desenhar uma linha reta paralela ao corpo (de costelas de coxa), utilizando uma Sharpie (Figura 2A). </li><li> Pegue a pele com um par de pinças dentadas, e apertar a pele ao longo da linha traçada usando um par de hemostats para esmagar o tecido e evitar hemorragias. Corte ao longo da incisão usando um par de tesouras cirúrgicas. Trituração a pele exterior e as camadas musculares antes do corte irá reduzir drasticamente e tipicamente eliminar sangramento. </li><li> Repita este procedimento para a camada muscular externa, que é fino. </li><li> Para a incisão na camada muscular interna, que vai expor o peritoneu, o re-apalpar o rim para estimar o tamanho. Beliscar uma linha de incisão menor do que o rim, garantindo a incisão é apenas sobre o rim. É melhor fazer essa incisão muito pequena e torná-lo maior, se necessário. Se esta for muito grande, será necessário suturar.Esta última incisão é crítica; muito mais em qualquer direção irá afetar a estabilidade no palco e induzir tanto artefatos de movimento de respiração (melhor cenário) ou vai esticar a perfusão renal pedículo e reduzir adversamente renal (pior cenário). </li><li> Localize o rim (como mostrado na Figura 2B) e pega a gordura ao redor usando uma pinça, trabalhando para o pólo inferior do rim em uma mão sobre a mão de moda. </li><li> Uma vez que o pólo inferior do rim é atingido, puxe o rim através da incisão enquanto aperta muito suavemente abaixo do rim para exteriorizar. Se a incisão é muito pequena, da camada muscular esmagar e cortar a alargá-la, repetindo o procedimento para exteriorização do rim. </li></ol> 4. Colocar a Munich Wistar Rat no Palco for Imaging <ol><li> Colocar o rim para a borda do prato lamela com o rim ligeiramente rodado para a dorsal (lado posterior) do rato de modo que o lado ventral do rim is fazer contato com o prato fundo de lamela (Figura 1A). Adicionar uma solução aquecida, estéril 09.% De solução salina para o prato. </li><li> Olhar através da objetiva de 10x ou 20x e verificar se há movimento. Se for detectado movimento, rolar o rato sobre um pouco para que o tórax é mais longe do prato fundo lamela, certifique-se o rim é o mais próximo da borda do prato, sem alongamento do pedículo renal (Figura 1B). </li></ol> 5. Aquisição de Imagens para quantificar a permeabilidade renal de albumina <ol><li> Cálculo da permeabilidade glomerular (Glomeruluar coeficiente de crivagem; SGC) de qualquer macromolécula exigirá tendo referência a imagens de glomérulos individuais fundo antes da infusão da molécula fluorescente. Se o seu microscópio é equipado com um palco motorizado capaz de localizações de marcação, encontrar e centro de glomérulos individuais usando o objetivo potência menor e marcar cada local. A dupla passagem Fluorescein / Rhodamine epifluorescência filter é ideal para este procedimento, embora seja filtro de emissão vai funcionar (contraste de fase ou de outras fontes não-fluorescência de iluminação não vai funcionar). Os glomérulos aparece como estruturas circulares vazios rodeados por tubos proximais possuindo um autoflourescence amarelo-laranja inerente quando vista através do filtro de passagem dupla. </li><li> Se o microscópio não tem uma fase motorizada, digitalizar o rim num padrão de quadriculação, com o objectivo de baixa potência e fazer um mapa do local onde o rudimentar glomérulos individuais estão localizados, baseando-se marcos naturais, tais como grandes vasos sanguíneos superficiais que se encontram acima da cápsula renal ou manchas de gordura. </li><li> Desligue o revólver para o objectivo de imersão em água poder superior e tomar conjuntos de cada glomérulos de dados 3D certificando-se as alças capilares e espaço de Bowman são claramente visíveis. Usando uma paleta de pseudo (algo diferente de B / W) vai ajudar a visualizar essas estruturas. </li><li> Concentrando-se em um vaso sanguíneo superficial lentamente infundir em tele fluorescente albumina tomada de tempo com certeza é dada para permitir a distribuição sistêmica. Para moléculas com baixo SGC é essencial para maximizar os valores da intensidade do plasma, mas não atingir níveis que saturam os fotodetectores no microscópio. Isto aumenta a detecção de moléculas de filtrados. Nota: normalmente há um lapso sec 5-7 entre o tempo da albumina fluorescente é introduzido para o tempo que aparece na tela (aquisição de quadros completos em ~ 1 frame / segundo). </li><li> Permitir que aproximadamente 10 min, para permitir que quaisquer potenciais pequenos fragmentos de peso molecular para limpar, antes de adquirir os volumes 3D em intervalos de 1 um a ser utilizados no cálculo SGC albumina. Normalmente, a tensão de Munique ratos Wistar do Simonsen tem muito menos glomérulos superficiais, por isso tudo o que pode ser visualizado são analisados ​​e quantificados. A estirpe Frömter tem um número muito maior de modo que limita o número quantificado para ~ 10. </li><li> No final do estudo, o rato é sacrificado através de uma sobredosagem de anestésicosic utilizado no estudo. Uma dupla pneumothoracotamy é realizada para assegurar a eutanásia. </li></ol> 6. Calculando GSC para fluorescente Albumina de Volumes 3D <ol><li> Usando o software de processamento de imagem Metamorph carregar os conjuntos de dados 3D para cada glomérulos, tanto o conjunto de fundo e definir tomada após a infusão da albumina fluorescente. </li><li> No volume que contém a fluorescente albumina localizar uma alça capilar superficial com espaço suficiente espaço vazio entre suas margens definidas e da borda da cápsula de Bowman. </li><li> No volume fundo localizar o mesmo plano focal que deve conter todos os elementos visuais da imagem que contém albumina. Selecione uma região dentro do ciclo capilar de interesse e anote a leitura média intensidade. Em seguida, selecione uma região no espaço de Bowman e observe a leitura média intensidade. Estes serão utilizados como valores de fundo. </li><li> Para a quantificação, selecione a região semelhante dentro do espaço de Bowman no c albuminaimage ontaining. Faça isso por pelo menos duas outras regiões para ter um valor médio para a intensidade média no espaço de Bowman. </li><li> Selecione o ciclo capilar com a intensidade plasma brilhante e desenhar uma região em torno dele. Em seguida utilizando a função de limiar, destacar os valores brilhantes dentro do plasma circulante, evitando as estrias escuras que estão circulando RBC. Note-se os valores médios da intensidade do espaço de plasma seleccionado. É importante selecionar preferencialmente as áreas brilhantes do plasma porque fatores dentro do sangue servirá apenas para provocar e subestimação dos níveis plasmáticos de fluorescência. </li><li> Usando uma planilha do Microsoft Excel insira os valores para calcular o GSC onde: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos destacados aqui representam o que sentimos ser aqueles que irão produzir valores de permeabilidade consistentes e precisas, porque eles contornar as seguintes armadilhas: <ol><li> Dispersão: a utilização de um emissor de fluoróforos vermelhos permitem uma recolha mais eficiente da luz uma vez que mais fotões de comprimento de onda são menos propensas a dispersão. Usando tanto fluorophores emissores verdes ou azuis irá introduzir uma maior variação na GSC da causa do aumento da variabilidade nos ...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Doenças renais envolvendo perda urinária de grandes macromoléculas essenciais, tais como albumina do soro, têm sido desde há muito se pensa ser causada por alterações na permeabilidade da barreira composta de podócitos, as células endoteliais vasculares, e uma membrana basal trabalhando em uníssono. Dados do nosso laboratório usando microscopia intravital dois fótons revelou uma barreira mais permeável de filtração glomerular (GFB) do que se pensava em condições fisiológicas, com a recuperação de albumina filtrada ocorrendo em um subconjunto inicial de células chamadas células do túbulo proximal (PTC) 1,2 3. As técnicas anteriores usados ​​para estudar a filtração renal e estabelecer a característica da barreira de filtração envolvido micropunção do lúmen desses segmentos tubulares de amostragem mais cedo com o conteúdo ea análise do fluido 4. Estes estudos determinaram a concentração de albumina no fluido luminal ser virtualmente inexistente; correspondente estreitamentecom o que é normalmente detectado na urina. No entanto, a caracterização de polímeros de dextrano com tamanhos definidos por esta técnica revelou aqueles com uma dimensão semelhante à albumina do soro tinham níveis mais elevados no lúmen tubular e de urina, o que sugere uma maior permeabilidade 5. Aqui é uma descrição pormenorizada da técnica utilizada para visualizar diretamente e quantificar glomerular fluorescente permeabilidade albumina in vivo. Este método permite a detecção da albumina filtrada através da barreira de filtração para o espaço de Bowman (a câmara de filtração inicial urinária) e também permite a quantificação de albumina reabsorção pelo túbulo proximal e visualização subsequente de transcitose albumina 6. A ausência de albumina fluorescente ao longo dos segmentos tubulares posteriores rota para a bexiga realça a eficácia da via de recuperação nos segmentos tubulares proximais anterior. Além disso, quando esta técnica foi aplicada para determinar a permeabilidadedos foram relatados dextranos possuindo um tamanho semelhante aos valores de permeabilidade virtualmente idênticos albumina 2. Estas observações suportam diretamente a necessidade de ampliar o foco de muitas doenças renais proteinúricas para incluídos alterações na recuperação de células do túbulo proximal.

A Figura 3 mostra um exemplo de uma imagem feita a partir de uma superfície de um glomérulo Munique Frömter rato Wistar e as medidas tomadas para determinar a permeabilidade da albumina fluorescente. O valor do SGC para a albumina derivada de 0,0111 para esta queda glomérulo individual no intervalo visto nesta linhagem de ratos Wistar de Munique, quando na condição alimentada 3. A estabilidade visto nestas imagens é devido à concepção e execução de instruções representadas nas <...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K visualizações.  Indiana University School of Medicine. Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Medicina

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Um método para quantificar Desempenho Membro Superior na Vida Diária utilizem acelerómetros

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

Na Vivo Análise morfométrica de humano nervos cranianos, utilizando imagens de ressonância magnética da doença doença ouvidos e orelhas de audição Normal

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermal medição da taxa de filtração Glomerular em ratos

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Coloração de Imunofluorescência de Montagem Inteira, Imagem Confocal e Reconstrução 3D do Nó Sinoatrial e Atrioventricular em Camundongo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolamento e Cultura de Macrófagos Cardíacos Residentes do Nó Sinoatrial e Atrioventricular Murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analisando gravações de eletrocardiografia de longo prazo para detectar arritmias em camundongos

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...