Este estudo foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft para SW (DFG WA 2804) e uma bolsa da universidade para SW a partir do Centro de Pesquisa Experimental e Clínica, a cooperação do Max Centro de Medicina Molecular e Faculdade de Medicina Charité, em Berlim Delbrück. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos ao Sr. Robert Westphal para o suporte técnico durante o seu estágio no nosso laboratório.

Todos os procedimentos com animais devem ser aprovados pelo comitê institucional local, bem-estar animal antes da execução. Durante as medições MR um nível adequado de anestesia e de monitorização fisiológica (temperatura corporal, freqüência respiratória) são requisitos indispensáveis. 1. Geração de Rato derivadas da medula óssea células dendríticas <ol><li> Extrair as células da medula óssea de ratinhos C57BL / 6, como previamente descrito 12. Esse protocolo remonta a 1992 e 13 foi originalmente descrito por um grupo de Ralph M. Steinman (1943-2011), descobridor da célula dendrítica 14. </li><li> Resumidamente, extrai tíbia e fíbula logo após sacrificar ratinhos. Trabalhando sob a capela de fluxo laminar (para evitar a contaminação microbiana), lave a medula óssea em uma pequena placa de Petri com meio de lavagem (5% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% HEPES em RPMI) 12. </li><li> Transferência da suspensão de células através de uma célula de estrainer (tamanho de malha de 100 um, de nylon) em um tubo de centrífuga estéril de 50 ml, a fim de remover restos de osso e tecido. Depois de várias etapas de lavagem e uma de 12 etapas de lise, a contagem das células viáveis ​​utilizando azul de tripano e um hemocitômetro. </li><li> Ressuspender as células da medula óssea a uma concentração de 400.000 células ml -1 em meio de cultura (RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de HEPES e 1% de L-glutamina) contendo 75 ng mL-1 de rato de granulócitos macrófago factor estimulante de colónias (mGM-CSF), obtida a partir de sobrenadantes de células HEK 293FT transfectadas com um plasmídeo de GMCSF rato. Transferem-se 10 ml de suspensão de células (4 x 10 6 culas) em placas de Petri (100 mm x 20 mm) e incubadas num incubador de CO2 (37 ° C, 5% de CO 2). No dia 3, reabastecer meio de idade com 10 ml de meio fresco (mantendo a concentração final da MGM-CSF em 75 ng ml -1). No dia 6, remover 10 ml do meio velho e reconstituircom 10 ml de meio fresco (concentração final mGM-CSF = 75 ng ml -1). No dia 8, remover 10 ml do meio velho e reabastecer com 10 ml de meio fresco (concentração final mGM-CSF = 150 ng ml -1). </li><li> No dia 10, a amadurecer diferenciada CC com 1 ug mL1 lipopolissacarídeo (LPS) durante 24 horas. </li></ol> 2. Marcação de células dendríticas com 19 Partículas F-ricos <ol><li> Durante a etapa de maturação 24 hr (1,5), com o rótulo do CD 1 mM de flúor rico perfluoro-15-coroa-éter-5 (PFCE) partículas (500-560 nm), também por 24 hr. Prepara grandes partículas flúor-rotulados por emulsionar PFCE em Pluronic F-68 (volume total de 2,5 mL) utilizando uma célula de desregulação sonotrodo titânio e empregando um programa de pulso contínua (100% de amplitude, potência = 250 W) durante 60 segundos. </li><li> Após os passos de incubação acima, recolher o DC maduras e flúor marcado utilizando um raspador de células de cultura de tecidos, a transferência para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugara 500 x g durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Para lavar as partículas de sobra e células mortas, deixa as células colhidas a aderir em pratos de poli-L-lisina. Para se preparar para este passo, placas de Petri com revestimento de poli-L-lisina (1 mg mL-1) a 37 ° C durante 1 hora, em seguida lavar o não ligado a poli-L-lisina com PBS. </li><li> Incubar as células colhidas de cima das placas de poli-L-lisina em meio isento de soro e permitir que as células a aderir (1 hr a 37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Lavar o meio para descartar as células não aderentes, as partículas remanescentes e células mortas e lavar três vezes com pré-aquecido (37 ° C) PBS. </li><li> Colheita de células aderentes por um tratamento tripsina-EDTA (0,25% de tripsina-EDTA, 3 min de incubação a 37 ° C). </li><li> Seguindo um outro passo de centrifugação de lavagem, ressuspender a quantidade necessária de CD maduras no soro livre de PBS estéril. </li><li> Para determinar se as células foram marcadas com êxito, é recomendado verificar a physicochemicos características das células por citometria de fluxo (FACS). A dispersão lateralmente (SSC) deve revelar um aumento na granularidade nestas células, como previamente descrito 11. Deve também ser mantido em mente que os fibroblastos podem contaminar as culturas DC e também pode assumir as partículas 19 F em paralelo. Por conseguinte, o grau de pureza DC devem ser avaliados (por medição da percentagem de células CD11c + CD11b + utilizando FACS) antes da aplicação in vivo. </li></ol> 3. Aplicação in vivo de 19 F-marcadas Células Dendríticas <ol><li> Administrar DC (junho 10 - julho 10) num volume de 50-100 ul intracutaneamente nos membros posteriores de um ratinho C57BL / 6, posicionando o rato num suporte e cuidadosamente inserindo uma agulha G 26 ½ nas camadas superiores da pele antes da aplicação (uso de seringas de 0,5 ml de tuberculina com agulhas permanentemente conectados para minimizar volume morto). Para garantir umn aplicação intradérmica apropriada, é importante que a parte inserida da agulha seja parcialmente visível por baixo da pele. Se a agulha não é mais visível, a agulha foi inserida demasiado profunda nas camadas da pele. Para o indivíduo não treinado, a aplicação intradérmica pode ser realizada sob anestesia. </li><li> Imagem membros por em flúor vivo (19 F) / prótons (1 H) MRI (veja a próxima seção) 21 horas após a injecção. </li></ol> 4. In Vivo 19 F / 1 H Ressonância Magnética As instruções detalhadas para configurar os exames de RM referem-se a um scanner MR Bruker usando o software de controle Paravison (versão 5.1). Nomes referentes a funções e itens específicos do fornecedor foram destacadas em itálico. Para outros scanners MR estes passos pode ter de ser ajustada de acordo com as orientações dos fabricantes. <ol><li> Organizar o acesso a um dedicadopequeno scanner de ressonância magnética animal. Para qualidade de imagem adequada, um sistema com uma intensidade de campo magnético de 9,4 Tesla ou mais e bobinas de radiofreqüência sob medida (por exemplo, um H / 19 F bobina dupla ajustável volume de RF, 35 mm de diâmetro interno, 50 mm de comprimento; rápida Biomed, Würzburg, Alemanha) são recomendados. </li><li> Antes de ressonância magnética, preparar a instalação do aparelho de ressonância magnética para anestesia e monitorização fisiológica. Assegure-se que a máscara respiratória do leito / detentor animal é ligado ao sistema de isoflurano e que a sonda de temperatura e uma almofada de respiração está conectado a um sistema de monitorização remota de animais (por exemplo, Modelo 1025, SA Instruments Inc., Nova Iorque, EUA). Este último serve para monitorar os parâmetros vitais do animal, tais como a temperatura do corpo e da respiração. </li><li> Anestesiar ratos narcose por inalação através de uma câmara de mouse conectado a um sistema de isoflurano. Ajustar o fluxo de ar e O 2 em 0,2 L min -1 e 0,1 L min -1, respectivamentee 3% de isoflurano (ajustados a partir de um vaporizador) durante cerca de 2 min, até que o nível desejado de anestesia é alcançado (sem resposta seguinte pitada tep). Taxas de fluxo óptimas podem variar dependendo da configuração que está sendo usado. Esteja ciente de que altas taxas de fluxo pode levar à desidratação. A monitorização cuidadosa das condições dos animais é necessária em todos os momentos, como mencionado acima. </li><li> Posicione o mouse propenso na cama mouse / detentor do pequeno animal MR scanner (Figura 1). </li><li> Mantendo a taxa de fluxo de ar constante e S 2, ajustar o vaporizador isoflurano para 0,8-1,5%, até um padrão de respiração óptima é alcançada. Recomenda-70 respirações por min - A freqüência respiratória de 50. </li><li> Mantenha a temperatura do corpo a 36-37 ° C durante o experimento, empregando uma água morna (ou, alternativamente, ar quente) sistema de circulação. </li><li> Mantenha os olhos do úmido mouse com estéril olho pomada lubrificante durante a medição. </li><li> Depois de garantir que o animalno suporte de imagem e as ligações ao sistema de monitorização, mova o suporte para o centro do 1 H / 19 F ampliada da bobina (que está posicionado no isocentro do íman scanner para animais). </li><li> Definir a posição do rato de modo que o joelho encontra-se dentro do isocentro do íman, ou com um método automático (por exemplo, usando um laser de posicionamento combinado com um suporte de animais motorizado) ou manualmente, por meio do cálculo da distância do suporte precisa ser movido para o íman para atingir o isocentro. </li><li> Para confirmar o posicionamento correto do animal no scanner e, posteriormente, o planejamento da geometria fatia de imagem (ou seja, tamanho, posição e rotação no espaço), adquirir explorar imagens em três orientações padrão (axial, coronal, sagital), utilizando resolução de imagem rápida e de baixo métodos de aquisição (por exemplo, protocolo TriPilot, que usa uma seqüência de pulsos flash). </li><li> Ajustar a bobina RF ao H frequência de ressonância 1 (p.ex.. 400,1 MHz para 9,4 T) e para a frequência de ressonância de 19 F (por exemplo, 376,3 MHz para 9,4 T) e igualar a impedância característica da bobina de 50 ohm utilizando o monitor de sintonização do scanner de MR animal. Ajuste e adequação é necessário para atingir as condições ideais para a transmissão e recepção do sinal. </li><li> Realize as configurações do sistema automático necessárias, incluindo calços para ajustar a homogeneidade do campo magnético (por exemplo ADJ_SHIM), ajustes de freqüência do sistema para ajustar a RF à freqüência Lamor do mouse (por exemplo ADJ_SF) e ganho de referência para ajustar a amplitude RF ( por exemplo ADJ_REFG). Todas essas configurações são importantes para tornar os campos magnéticos estáticos e variável (B 0, B 1), na região de interesse, o mais homogéneo possível. </li><li> Adquirir um segundo conjunto de imagens agente (como acima) ao longo das três orientações ortogonais, após ter regulado o campo de visão (FOV) de tal modo que ambos os membros inferiores ARe visível a partir da pelve de pé (CxLxA = 50x25x25 mm). Estas imagens servem para planejar as orientações das 3D 1 H / 19 F exames finais. </li><li> Estabelecer um protocolo 3D TurboRARE para um H-scan: TR / TE = 1500/53 ms, FOV = 50x25x25 mm, Matrix = 400x200x200, Fator RARE = 16 (. Tempo de varredura de aproximadamente 60 min). Ajuste FOV com a ajuda das imagens de escoteiros, iniciar a digitalização (semáforo). </li><li> Carregar um único pulso-FID de sequência com um TR de, pelo menos, 1000 mseg. Abra Editar digitalização e definir núcleo a 19 F. Use as configurações de ganho manual, desmarcando o ganho automático referência no Método Editar da caixa de ferramentas. </li><li> Inicie a medição sem a gravação de dados para exibir um sinal de MR em tempo real usando GSP (ir setup). Se o sinal espectral 19F dentro da janela de aquisição é muito baixa, adicionar mais médias no Método Editar e / ou modulam o pulso atenuador (SP0 TX0 ou deslizante) até um sinal é claramente visível. Ajuste a frequência básica para o centro de pico espectral 19 F em 0 Hz na janela de aquisição. Aplicar freqüência básica e pressione Parar. Note-se que o isoflurano utilizada como anestésico pode gerar um sinal de fundo. De 9,4 Tesla MRI o deslocamento químico entre os 19 partículas F contendo eo isoflurano é de cerca de 1800 Hz. Assegure-se que a largura de banda de excitação é menor do que 3.600 Hz para evitar a excitação do isoflurano em conjunto com as células ou partículas de 19 F-etiquetados. A freqüência básica deve ser definido corretamente no sinal gerado pelos 19 células F-marcadas. Alternativamente, outro método de anestesia pode ser usado como o experimentador entender. </li><li> Clone (duplicado) o protocolo TurboRARE 3D a partir do anterior 1 H digitalização. Vá em Edit Método e desmarque o ganho de referência automático (como acima). Set 19 F núcleo de edição de digitalização. Mudar a matriz de 128x64x64ea RARE-Factor, pelo menos, 40 (até 64). Para uma TR / TE 1000/6 ms e 64 médias, o tempo de verificação é de aproximadamente 70 min. Defina o ganho do receptor para 101 (caixa de ferramentas) e iniciar a digitalização sem quaisquer ajustes usando GOP (ir gasoduto). </li><li> Quando os exames terminar retrair o titular do mouse a partir do scanner MR. Desligue o rato cuidadosamente do titular. Se o mouse não é sacrificado para análise ex vivo (por exemplo, histologia ou espectroscopia, veja abaixo) diretamente após as medidas de RM, acompanhar de perto até que ele esteja completamente recuperado da anestesia. Regulação da temperatura corporal é afetada pela anestesia, por isso durante o processo de recuperação, coloque o rato em uma gaiola separada, que é colocada sobre uma almofada de temperatura regulada quente. Uma vez que o mouse esteja completamente recuperado da anestesia, devolvê-lo à sua gaiola exploração e à sala do animal. </li><li> Para sobrepor as imagens para 19 F 1 imagens H, utilize o Menu Exibir oPÇÃO no mesmo software (Paravison). A função Underlay pode ser encontrado em Correlacionar. Salve o underlay, carregue a nova imagem e destacar a camada de 19 F, definindo uma nova cor a partir do olhar para cima da tabela. A discriminar entre os 19 e F 1 H scans, alterar o limite para a cor escolhida (corte Olhe para cima de mesa) de tal forma que o sinal de 19 F terá a cor escolhida ea imagem H fundo uma permanecerão em escala de cinza. Outros programas de pós-processamento (por exemplo, ImageJ) estão disponíveis para criar as 1 h / 19 F sobreposições de imagem. </li><li> No caso de uma quantificação em vivo do sinal 19F ser necessário, seguir um protocolo quantitativa simples como anteriormente descrito 15,16. Em resumo, a quantificação pode ser feita através da colocação de um tubo de referência com uma concentração conhecida de PFCE-emulsão no FOV lado do rato. Depois de adquirir as imagens MR, quantificar as intensidades dos sinais de F-19, utilizando região de interesse análise (ROI) e comparar com a curva de calibração in vitro, como mostrado na Figura 2. </li></ol> 5. Linfonodo Espectroscopia de Ressonância Magnética (MRS) <ol><li> Depois de sacrificar o mouse, remova o linfonodo poplíteo e coloque em um pequeno tubo NMR 5 mm e adicionar 100 ml de 2% PFA. </li><li> Instalar uma bobina de espectroscopia de 19 F (por exemplo uma bobina toroidal), que tem uma abertura de pelo menos 5 mm, para segurar o tubo de RMN contendo o nódulo linfático. </li><li> Colocar o tubo de NMR no interior da bobina e mover a bobina ao isocentro do magneto. </li><li> Ajustar a bobina de RF com a frequência de ressonância 19F (376,3 MHz, por exemplo, para 9,4 T) e igualar a impedância característica da bobina de 50 ohm utilizando o monitor de sintonização do scanner de MR animal. Ajuste e adequação é necessário para atingir as condições ideais para a transmissão de sinal erecepção. </li><li> Defina todos os parâmetros de correção dentro do Toolbox calçar a 0 e pressione aplicar. Normalmente, não é necessário aplicar métodos shimming vez que o volume da amostra é relativamente pequena. Se um sinal 19 F suficiente estiver disponível, os métodos automatizados pode ser aplicada para calçar, a frequência do sistema e o ganho do receptor, conforme descrito acima. </li><li> Carregar uma única sequência de impulsos FID com um TR de, pelo menos, 1000 mseg. Abra Editar digitalização e definir o núcleo de 19 F. Use as configurações de ganho manual, desmarcando o ganho automático referência no Método Editar da caixa de ferramentas. Defina o número de médias a 1. </li><li> Comece a seqüência usando GSP. Se o sinal espectral 19F dentro da janela de aquisição é muito baixa, adicionar mais médias no Método Editar e / ou modulam o pulso atenuador (SP0 TX0 ou deslizante), até que um sinal é claramente visível. Ajuste a frequência básica de modo que o 19 F SPEpico ctral está no centro da janela de aquisição a 0 Hz e aplicar frequência de base. Ajustar o pulso atenuador de novo para maximizar o sinal, para alcançar 90 ° excitação. Quando o sinal é na Parada máximo de imprensa. </li><li> Definir as médias no Método Editar entre 64 e 256 (ou mais, se necessário, dependendo do sinal) e de iniciar a aquisição usando GOP. O sinal detectado correlaciona linearmente com o número de médias. Durante quantificação ter em mente que o sinal detectado deve ser normalizada para uma média. Além disso, é necessário calcular o número de células a partir do sinal normalizado 19 F (figura 2) um padrão de concentração conhecida de um ou de uma curva de calibração de calibração. </li><li> Uma vez que a verificação for concluída, remova a amostra, coloque a próxima amostra e prosseguir com o passo 5.3. </li></ol>

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M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Cellular+Infiltrates+during+Early+Stages+of+Brain+Inflammation+with+Magnetic+Resonance+Microscopy.">Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).</li><li>Haacke, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este método de empregar 19 F / 1 H MRI para seguir o movimento de CC no nó de linfa dá a oportunidade de estudar os padrões de migração de células imunitárias in vivo. As células dendríticas são excelentes exemplos de rápida migração de células do sistema imunológico que são capazes de manobrar através de estruturas tridimensionais sem fortemente aderidos a substratos específicos 17. Embora a resolução espacial baixa (gama im) da técnica descrita não é co...

O rastreamento de células in vivo é um aspecto crucial em vários campos da biomedicina. Para isso, as técnicas de imagem não invasivas, que pode selectivamente células localizam ao longo de um período de tempo são extremamente valiosos. Antes do desenvolvimento de tridimensional ressonância magnética (IRM), o seguimento da migração de células imunitárias foi limitado a análises microscópicas ou biópsias de tecidos. Rastreamento celular com a ajuda da ressonância magnética ganhou imensa atenção nos últimos anos, não só para estudar o comportamento de células imunologistas imune in vivo, mas também para investigadores clínicos e de células estaminais. Durante meados dos anos 90, os primeiros estudos sobre as nanopartículas de óxido de ferro 1 iniciada uma cascata de acontecimentos para as células de rastreamento com ressonância magnética. Partículas de óxido de ferro reduzir o tempo de relaxamento MR (T2 *) das células marcadas e, assim, causar depleção de sinal em imagens por ressonância magnética. Partículas de óxido de ferro têm sido empregadas para rotular macrófagos 2, oligodendrocyte progenitors 3 e muitos outros tipos de células. Algumas destas partículas também têm sido clinicamente aprovado pela FDA para a rotulagem de vacinas celulares em pacientes com melanoma 4. Desde in vivo ou ex vivo de células rotulagem com partículas de óxido de ferro se baseia em um encurtamento do sinal T2 *, a qual pode ser também provocada por in vivo relacionados com susceptibilidade T2 * efeitos, tais como micro-hemorragias, depósitos de ferro ou bolhas de ar, pode ser difícil de identificar células marcadas in vivo a partir de outro fundo T2 * extinções de sinal 5. Neste artigo, descreve uma técnica para rastrear as células dendríticas (DC), in vivo, através do emprego de 19 F / 1 A imagiologia por ressonância magnética (MRI). Esta tecnologia de rastreamento de celular só foi introduzido em 2005, 6 anos após as primeiras aplicações reconhecidas para 19 F em MRI foram notificados 7. Uma adva importantentage de 19 F sobre óxido de ferro marcação celular partícula é a baixa ocorrência biológica de 19 F no tecido, o que torna possível rastrear células muito seletiva com imagens, basicamente, background-livres. Além disso, é possível sobrepor a F sinal MR 19 a partir de células marcadas transplantados com imagens anatómicas obtidas a partir de ressonância magnética convencional 1H. 19F / 1 H RM é, assim, bastante relevante para os estudos que investigam a migração de células in vivo. As células estudadas com este método são etiquetados com 19-F de partículas ricas. Perfluorocarbonetos sinteticamente derivados (PFC) que consistem principalmente de carbono e átomos de flúor são normalmente usados ​​para preparar as partículas. Estes compostos são insolúveis em água e devem ser emulsionados antes da aplicação in vitro ou in vivo. O tamanho habitual das partículas do PFC que tenham sido utilizados por outros grupos para in vivo de 19 experiências de acompanhamento F-RMvaria entre 100 nm e 245 nm 6,8-10. Temos, porém, que a eficiência de marcação das células dendríticas com perfluoro-15-coroa-éter-5 (PFCE) partículas aumenta com o aumento do tamanho de partícula (&gt; 560 nm) 11.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Charles River, Berlin</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>21875-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS Superior</td>
 <td>Biochrom AG</td>
 <td>S 0615</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Gibco-Invitrogen</td>
 <td>15630-056</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15140-122</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>25030-024</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D8662</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PFA</td>
 <td>Santa Cruz</td>
 <td>sc-281692</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Perfluoro-15-crown-5-ether </td>
 <td>ChemPur</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pluronic F-68 </td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>P5556</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>391-1996</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27 &frac12; G syringes</td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>612-0151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nylon cell strainers (100 &mu;m mesh) </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>734-0004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NMR tubes </td>
 <td>VWR, Germany</td>
 <td>634-0461</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection tools</td>
 <td>FST</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 incubator </td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small animal MR system</td>
 <td>Bruker Biospin</td>
 <td></td>
 <td>9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1H/19F dual-tunable volume RF coil </td>
 <td>Rapid Biomed, W&uuml;rzburg, Germany</td>
 <td></td>
 <td>35 mm inner diameter, 50 mm length</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>19F spectroscopy coil </td>
 <td>in-house</td>
 <td></td>
 <td>tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane inhalation system</td>
 <td>F&ouml;hr Medical Instruments GmbH</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Animal monitoring system Model 1025</td>
 <td>SA Instruments Inc., New York, USA</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

monitoring dendritic cell migration using 19f / 1h magnetic resonance imaging

Avanços contínuos nos métodos de imagem não invasivos, como a ressonância magnética (RM) tem melhorado muito a nossa capacidade de estudar os processos fisiológicos ou patológicos em organismos vivos. MRI também está provando ser uma ferramenta valiosa para capturar células transplantadas in vivo. Estratégias de rotulagem de células iniciais para utilização de agentes de contraste de MRI que influenciam os tempos de relaxação de RM (T1, T2, T2 *) e conduzem a um acessório (T1) ou depleção (T2 *) do sinal onde células marcadas estão presentes. T2 * agentes de melhoramento tais como ultrasmall agentes de óxido de ferro (USPIO) foram utilizados para estudar a migração de células e alguns têm sido aprovados pela FDA para uso clínico. A desvantagem de T2 * agentes é a dificuldade de distinguir a extinção do sinal criado pelas células rotuladas de outros artefatos, como coágulos de sangue, micro hemorragias ou bolhas de ar. Neste artigo, descrevemos uma técnica emergente para as células de monitoramento in vivo quebaseia-se na marcação das células com flúor (19F) ricos em partículas. Estas partículas são preparadas por emulsão de perfluorocarbono compostos (PFC) e, em seguida, utilizado para as células de etiqueta, que, posteriormente, pode ser visualizada, por 19 F RM. Vantagens importantes de PFC para o rastreamento de células in vivo incluem (i) a ausência de carbono ligado a 19 C, in vivo, o que proporciona então as imagens de fundo e livres de células completo selectivityand (ii) a possibilidade de quantificar o sinal de células por 19 F MR espectroscopia .

Dezoito de 21 horas após a aplicação intradérmica, 19 células dendríticas F-rotulada (DC) migram para o nó de linfa poplíteos de drenagem. O movimento de CC através dos canais linfáticos para o nó de linfa de drenagem politeal pode ser apreciado por sobrepondo as imagens anatómicas H 1 com as imagens DC 19 F (Figura 2A). Temos anteriormente relatado na migração dessas células in vivo, bem como o impacto de 19 tamanho de partícula em F-...

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Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Rastreamento de células usando MRI ganhou notável atenção nos últimos anos. Este protocolo descreve a marcação das células dendríticas com flúor (<sup&gt; 19</sup&gt; Partículas F)-ricos, em aplicação vivo destas células, e acompanhamento do alcance de sua migração para o linfonodo de drenagem com<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H ressonância magnética e<sup&gt; 19</sup&gt; F MRS.

Monitoramento da Migração de Células dendríticas usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Ressonância Magnética

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

monitoring-dendritic-cell-migration-using-19f-1h-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

11.7K visualizações.  A joint cooperation between the Charité Medical Faculty and the Max Delbrück Center for Molecular Medicine. Rastreamento de células usando MRI ganhou notável atenção nos últimos anos. Este protocolo descreve a marcação das células dendríticas com flúor ( 19 Partículas F)-ricos, em aplicação vivo destas células, e acompanhamento do alcance de sua migração para o linfonodo de drenagem com 19 F / 1 H ressonância magnética e 19 F MRS.

Vídeo: Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Não-invasiva por imagem do Homing leucócitos e Migração In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Imunologia e Infecção

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocolo otimizado para transfecção eficiente de células dendríticas, sem maturação das células

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Preparação de amostras de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

Análise da maturação das células dendríticas e migração pulmonar durante a inflamação alérgica das vias aéreas

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Geração de uma nova vacina de células dendríticas usando melanoma e células-tronco de câncer escântico

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

Um ensaio baseado em CFSE para estudar a migração de Murino pele as células dendríticas em drenagem gânglios linfáticos durante a infecção com<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacilo de Calmette-Guérin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...