Tradicionalmente, macrófagos têm sido difíceis de estudar em ensaios de quimioterapia em tempo real porque as células estão se movendo lentamente. Este protocolo fornece um meio de imagem macrófagos migrando em um gradiente quimotactic por até seis horas ou mais. Em comparação com ensaios de implante, como ensaios de transferência, essa técnica tem as vantagens de que a morfologia do macrófago pode ser observada, e parâmetros como velocidade celular e eficiência quimotactica podem ser medidos.
Macrófagos estão envolvidos em muitas doenças inflamatórias, e essa técnica pode ser útil para estudar drogas projetadas para inibir a quimiotaxis. Também pode ser aplicado a outros tipos de células, como monócitos humanos. Ao tentar essa técnica pela primeira vez, é melhor praticar o preenchimento das câmaras de quimiotaxis antes de trabalhar com células.
Um dos aspectos mais importantes da técnica é a prevenção de bolhas de ar. Comece preenchendo previamente os canais de conexão de um ou dois slides de quimiotaxis com o RPMI 1640 HEPES Médio modificado preparado de acordo com as instruções do manuscrito. Coloque um slide em um prato de cultura celular, e coloque o prato em um bloco de alumínio aquecido a 37 graus Celsius.
Em seguida, insira plugues nas portas um e quatro. Use uma ponta de tubulação chanfrada de 200 microliter para depositar 15 microliters do RPMI 1640 Médio HEPES modificado na porta de enchimento três. Em seguida, insira a ponta da tubulação na porta dois e aspire 15 microliters a uma taxa moderadamente rápida, que irá pré-encher o canal de conexão, bem como os dois canais de alimentação de flanqueamento.
Cubra as portas de enchimento dois e três com tampas e coloque o deslizamento de quimiotaxis em um rack em uma câmara de umidade fechada dentro de uma incubadora seca e sem dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Para isolar os macrófagos, insira um cateter plástico de calibre 24 na cavidade peritoneal de um rato sacrificado de três a quatro meses de idade, e use uma seringa plástica de cinco mililitros para lavar a cavidade com a solução de sal tampão de Hank sem cálcio ou magnésio. Depois de coletar o meio lavado em um tubo, centrifuá-lo a 300 vezes G por 6,5 minutos.
Descarte o supernascer e suspenda as células em 200 microlitrais de meio RPMI 1640 modificado. Diluir uma alíquota da suspensão das células de 1 a 20. Em seguida, use um dispositivo de contagem para contar as células.
Diluir as células para uma concentração final de 10 vezes 10 para as seis células por mililitro, e mantê-las a 37 graus Celsius em um bloco de alumínio aquecido. Encanar a suspensão da célula cinco vezes para reduzir a aglomeração, e deposite suavemente 10 microliters na porta três da câmara de quimiotaxis. Coloque a ponta da tubulação na porta dois e desenhe lentamente a suspensão da célula no canal de conexão.
Assim que a suspensão do celular tiver sido introduzida, remova os plugues nas portas um e quatro para prender o fluxo e coloque tampas nas quatro portas de enchimento. Em seguida, coloque os slides de quimiotaxis na câmara de umidade de 37 graus Celsius por duas a três horas. Inspecione a área de observação com um microscópio invertido.
Em seguida, coloque as portas de enchimento um e dois, e verifique se a porta de enchimento três está cheia para o topo com média e livre de bolhas de ar. Se necessário, use uma agulha de seringa estéril de 27 calibres para desalojar bolhas de ar. Em seguida, aspire 60 microliters de médio com uma tubulação mecânica de 100 microliteres, e coloque a ponta na porta de enchimento três.
Use o anel de ajuste de volume para injetar lentamente e firmemente o meio no reservatório até atingir a parte superior da porta de enchimento quatro após um a dois minutos. Para encher o segundo reservatório, mova o plugue da porta um e insira-o lentamente na porta três. Aspire 50 microliters de médio, e coloque a ponta da tubulação na porta quatro, e injete lentamente o meio no segundo reservatório para que ele atinja o topo da porta de enchimento um após um a dois minutos.
Adicione 495 microliters de médio a um tubo microcentrífugo de dois mililitros, e adicione cinco microliters de patente azul cinco. Brevemente vórtice da mistura, em seguida, adicione 5,4 microliters de Recombinant Mouse Complement C5a e vórtice novamente para misturar. Certifique-se de que a depressão rasa na parte superior da porta um é meio-livre, e deposite 15 microliters do complemento azul C5a contendo meio.
Em seguida, insira uma ponta de tubulação de 200 microliter na porta de enchimento quatro e gire lentamente o anel de ajuste de volume para desenhar o meio no reservatório oposto. Desenhe ar na curta coluna vertical da porta de enchimento um até que a interface fluido-ar esteja no meio da coluna. Em seguida, conecte a porta um antes de levantar suavemente a tubulação da porta quatro, certificando-se de que o slide permanece no lugar e lentamente tampe a porta quatro.
Para realizar a imagem de lapso de tempo, coloque o slide de quimiotaxis no palco de um microscópio invertido equipado com uma incubadora de estágio, e imagem a área de observação com uma lente objetiva de contraste de fase 10X, com foco no macrófago lamellipodia. O slide de quimiotaxis usado para microscopia de vídeo de lapso de tempo de macrófagos peritoneais do rato tem três câmaras de quimiotaxis, cada uma das quais possui quatro portas de enchimento. As células foram semeadas na área de observação de cada câmara.
E depois de uma incubação de duas a três horas, as câmaras foram lentamente preenchidas com meio. Quando as células da área de observação foram inspecionadas, até dois terços das células foram lavadas. Geralmente, as células B-1 fracamente aderentes foram lavadas, e as demais células eram predominantemente macrófagos.
Para distinguir os macrófagos das células B, células recém-isoladas foram rotuladas com anticorpos específicos. Os macrófagos foram rotulados com fluorescência verde, as células B com vermelho, e os núcleos celulares com azul. A migração do macrófago foi investigada pela introdução do Complement C5a, um quimioattractant, a um dos dois reservatórios.
Foram registradas as faixas migratórias de macrófagos migrando em um gradiente Complementar C5. O ponto de partida de cada faixa de migração foi normalizado para X é igual a zero e Y é igual a zero para criar um plot migratório. Em seguida, calculou-se a velocidade celular e a eficiência quimática dos macrófagos individuais.
Esta técnica tem sido útil para estudar os papéis de subunidades de proteína G, e Rho GTPases, e motilidade macrófago em quimiotaxis.
