Este trabalho foi realizado em parte do Centro de Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Nanotecnologia Infra-estrutura (NNIN), que é apoiada pela National Science Foundation, NSF prêmio nenhum. ECS-0335765. CNS é parte da Universidade de Harvard.

O protocolo para gerar alinhado tecido funcional do miocárdio pode ser dividida em três partes principais. A fabricação do mestre micropatterned usando técnicas de litografia suave não é considerado parte do protocolo a seguir, mas pode ser feita com base no método estabelecido 6. 1. Printing microcontact de fibronectina em PDMS Substrates <ol><li> Misture Sylgard 184 (Dow Corning) em elastómero PDMS uma base de 10:1 a cura proporção do agente e desgaseificar o conjunto usando um dessecador para eliminar quaisquer bolhas de ar. </li><li> Curar PDMS contra um mestre previamente fabricada com 20 um de largura e 2 m de altura cristas, separados por espaçamento de 20 uM para qualquer um 2 dias à temperatura ambiente ou a 4 horas a 65 ° C para se obter selos microtextured PDMS. </li></ol> * A cura num exsicador é altamente recomendável para eliminar quaisquer bolhas de ar. <ol start="3"><li> Spin-coat PDMS em lamelas de vidro (por exemplo,22x22 mm) a 5000 rpm durante 2 min utilizando um revestidor de rotação Headway para produzir finos e ainda PDMS substratos, de 15 um de espessura. </li><li> Limpar selos com etanol 70% para remover poeira e partículas de sujeira. Deixe-os secar ao ar. </li></ol> Selos * pode ser usado várias vezes, no entanto, renovando selos PDMS em uma base regular é recomendado devido a uma abrasão da superfície ao longo do tempo. <ol start="5"><li> Selos colocar num Plasma-Prep II SPI Cleaner Plasma e processo para 1 min a 275 mTorr para tornar as superfícies de PDMS hidrofílico. </li></ol> * Tratamento de plasma de oxigênio devem ser observados. Tempos mais longos de tratamento pode resultar em fractura do elastómero. <ol start="6"><li> Esterilizar selos com etanol a 70% durante 1 min. Secar rapidamente com ar comprimido. </li></ol> * Novos passos devem ser realizados numa câmara de segurança biológica para manter a esterilidade. <ol start="7"><li> Cubra carimbar superfícies com Fibronectin solução (50 ug / ml em DDH 2 O). Deixe-a adsorver, pelo menos, 10 min. </li><li> Sacudir solução fibronectina de selos e secar rapidamente com ar comprimido. </li><li> Estabelecer contato conformado entre selos e substratos PDMS para 2 minutos e pressione com firmeza. </li><li> Enxágüe com substratos micropatterned DDH 2 O. Armazená-los em DDH 2 O para um máximo de 2 semanas a 4 ° C a menos que inicialmente utilizada. Loja PDMS selos em DDH 2 O. </li></ol> 2. Manutenção de Double linhagens de células estaminais embrionárias Primeiro, prepare os seguintes meios para a cultura de células embrionárias de rato: Rato embrionário fibroblasto (MEF)-Meio: Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS) de células ES ou Differentiation-grade, 1% de Penicilina-Estreptomicina (P / S) Células-tronco embrionárias (ESC)-Médio: DMEM, 15% FBS ES célula-grade,1% não-aminoácidos essenciais (NEAA), 0,5% P / S, o Factor Inibitório de 0,2% da leucemia (LIF), 0,0007% 2-mercaptoetanol (2-ME) <ol><li> Revestimento de placas de 6 poços com 0,1% de gelatina estéril em DDH 2 O e deixá-la adsorver 15 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar MEFs partir de uma alíquota descongelada a 50 ml de PBS, num tubo cónico e centrifugar para a 1000 rpm durante 5 min. Ressuspender MEFs no MEF-médio. </li><li> Após a adsorção, aspirado de gelatina em excesso e MEFs suplemento para os poços. Permitir MEFs dia 1 anexar. </li></ol> * Uma alíquota de 10 milhões de MEFs suficiente para 3 placas de 6 poços. <ol start="4"><li> Quando MEFs ter anexado, adicionar células ES a partir de uma alíquota descongelada a 50 ml de PBS, num tubo cónico e centrifugar para a 1000 rpm durante 5 min. Ressuspender as células ES em ESC médio e adicione-os aos poços contendo MEFs. Cultura de células ES em ESC médio até confluência é atingido. </li></ol> * Uma vez que as células ES atingiram confluência, passaging é requa fim de evitar o crescimento excessivo IRED e para manter as colónias de células ES. <ol start="5"><li> Prepare células-tronco embrionárias para passaging. Aspirado ESC-médio e lave uma vez com PBS estéril. </li><li> Aspirar PBS e adicionar 500 ul de tripsina. 3.5 Processo min a 37 ° C. </li><li> Pipetar a solução de tripsina cima e para baixo várias vezes para quebrar as colónias de células ES e neutralizá-la com 500 ul de meio de ESC. </li><li> As células ES de passagem de acordo com a sua relação desejada, por exemplo, a transferência de 33 uL para o outro bem com previamente preparada MEFs a passagem 1/30. Manter as células ES em ESC-Médio. </li></ol> * A relação de passagem de 1/30 permite que as células ES para atingir confluência em 3 dias. Células ES de passagem de acordo com a sua programação na diferenciação in vitro. 3. Diferenciação in vitro de Double linhagens de células estaminais embrionárias e isolamento e propagação de células progenitoras cardíacas Primeiro, prepare o followimedia ng necessário para a diferenciação in vitro de células ES: Adaptação médio: Média Modificado Iscove da Dulbecco (IMDM), 15% FBS célula ES-grade, 1% de NEAA, 0,5% P / S, 0,2% de LIF, 0,0007% de 2-ME Diferenciação de Médio: IMDM, 15% FBS Diferenciação grau. NEAA 1%, 0,5%, P / S, 0,35% de ácido ascórbico a 0,1 M, 0,0007% de 2-ME <ol><li> Iniciar diferenciação in vitro quando as células atingiram a confluência ES. Revestimento de placas de cultura de 10 centímetros, com 0,1% de gelatina estéril em DDH 2 O e deixá-la adsorver 15 min a 37 ° C. </li></ol> * Ser consciente da duração do processo de diferenciação in vitro. Leva 8 dias até progenitoras cardíacas podem ser isolados. Planeje suas experiências nesse sentido. <ol start="2"><li> Colheita células-tronco embrionárias como antes. Após a adsorção, aspirado de gelatina em excesso e adicionar cerca de 1/3-1/2 da suspensão de células ES de cultura preparadopratos contendo Adaptação médio. Células de cultura durante 2 dias. </li></ol> * Escolha a quantidade de células-tronco embrionárias para a adaptação de acordo com suas experiências. <ol start="3"><li> Colheita adaptado células ES para um tubo cónico de 50 ml contendo PBS com 1. 5 ml de tripsina. Centrifugar as células ES dissociadas a 1000 rpm durante 5 min e ressuspender-los em Diferenciação médio. </li><li> Fazer corpos embrióides (EB) de cerca de 1.000 células por 10 ul gota em 15 placas de cultura de centímetros utilizando uma pipeta multi-canal. Inverter as placas de cultura e EBS como suspensão de gotículas durante 2,5 dias a 37 ° C. </li><li> Após 2,5 dias, a piscina EBs de 6-8 pratos de cultura de 15 centímetros em um usando Diferenciação médio e cultura para lhes mais 3,5 dias a 37 ° C. </li><li> Depois de 3,5 dias, recolher EBS em um tubo cônico 50 ml e deixá-los afundar até o fundo por cerca de 5 min. Sugar o sobrenadante e lavar EBS com PBS estéril. Deixe EBs afundar novamente para o fundo para approximately 5 min. </li><li> Dissociar EBs, processando-os com 2. 5 ml de tripsina, durante 2 minutos num banho de água a 37 ° C agitando suavemente o tubo. Em seguida, adicione 2. 5 ml de PBS estéril com a solução de tripsina e pipetar para cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml aproximadamente 8-10 vezes serológico para quebrar aglomerados de células. Neutralizar a tripsina com 10 ml de tampão FACS contendo 7,5% de FBS células ES ou diferenciação de grau e de 0,01% em PBS DAPI. </li><li> Centrifugar EBs dissociado a 1000 rpm durante 5 min e ressuspender deles em cerca de 1 ml de tampão de FACS. Pipetar cima e para baixo com uma pipeta de 1 ml, aproximadamente 8-10 vezes para quebrar aglomerados de células. </li></ol> * Adicione tampão FACS de acordo com a quantidade estimada de EBs dissociados. As células também altamente concentrados podem entupir durante FACS e muito baixo de células concentradas podem prolongar o tempo de FACS desnecessariamente. <ol start="9"><li> Transferir as células para um tubo de fundo redondo de um filtro estéril com célula de 35 um até se obteruma suspensão de célula única. </li><li> Células diferenciadas Ordenar ES utilizando um citómetro de fluxo e FACSAria obter purificado populações de PVC. </li></ol> * Foi desenvolvida uma estratégia modular multi-passo para isolar células altamente purificadas coloridas. Em suma, primeiro portão em Amplitude Forward Scatter (FSC-A) e Amplitude Side Scatter (SSC-A) (Figura 1A). Isto permite-nos separar células inteiras a partir de detritos celulares. Em seguida, portão FSC-A e Forward Scatter Largura (FSC-W) (Figura 1B). Isto permite isolar singlets celulares de dupletos e outros agregados celulares. Em seguida, portão SSC-A e Lado Scatter Largura (SSC-W) (Figura 1C). Isto aumenta a pureza de singletos celulares. Em seguida, no portão coloração DAPI para isolar as células viáveis ​​(DAPI-negativa) a partir de células não viáveis ​​(Figura 1D). Em seguida, no portão Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) e PE-cianina 7 corante Amplitude (PE-Cy7-A) para obter verdadeiro-positivo vermelho (R + </sup&gt;) e verdadeiros negativos vermelho (R - células) e para excluir autofluorescente vermelho-negativas células (Figura 1E). R + e R - são, em seguida, as células gated em separado em fluoresceína Amplitude isotiocianato (FITC-A) e PE-A para ordenar verdadeiros-positivos verde (G +) e verdadeiros negativos verde (G -) células dentro dessas populações (Figura 1F + 1G). Isto resulta em quatro populações de células como se segue: R + G +, R + G -, R - G + e R - G - (Figura 1H). <ol start="11"><li> Passivar micropatterned substratos com 1% de Pluronic F-127 em DDH 2 O durante 10 min. Em seguida, lave-3x com PBS estéril. </li></ol> * Pluronic F-127 é um surfactante que bloqueia a adesão de células. Ela suporta o confinamento de adesão celular a área micropadronadas. <ol start="12"><li> Anexar juntas PDMS em torno da região modeladae pressione com firmeza. Então CVP semente, sobre substratos fibronectina micropatterned. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Neste protocolo, apresentamos um método para isolar populações purificadas de progenitores cardiogênico e para semente deles em substratos micropatterned fibronectina o que lhes permite alinhar e tomar uma forma haste dos miócitos cardíacos como. Organização celular normal é crítico para a função do tecido normal de 8,10, em especial para o tecido do miocárdio. Os miócitos cardíacos foram mostrados para desenvolver melhorado 11,12 mecânica e propriedades electrofisiológicas 11...

Apesar dos recentes avanços na terapia médica, insuficiência cardíaca avançada é a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo desenvolvido. A síndrome clínica surge de uma perda de tecido funcional do miocárdio e, posteriormente, uma incapacidade do coração insuficiente para atender as demandas metabólicas de indivíduos afetados. Como o coração tem uma capacidade limitada de regeneração, o transplante autólogo de coração é a única terapia atual clinicamente aceito diretamente destinado a reabastecer o tecido do coração perdido funcional. Desvantagens significativas do transplante cardíaco, incluindo um número limitado de corações de dadores e a necessidade de uma terapia de longo prazo imunossupressora, impede a utilização ampla desta terapia. Como resultado, a terapia médica tem sido a base do tratamento para os pacientes com doença de coração. Um dos principais desafios no desenvolvimento de drogas é a identificação de ensaios celulares com precisão que recapitulam normal e doente fisiologia do miocárdio in vitro. <html> A recente convergência da biologia de células-tronco e tecnologia de engenharia de tecidos levanta novos caminhos promissores para a regeneração cardíaca. Gerando tecido miocárdico funcional a partir de uma fonte renovável paciente específico seria um grande avanço no campo. Isto permitirá o desenvolvimento de doenças específicas ensaios celulares para desenvolvimento de drogas e de descoberta e iria lançar as bases para a medicina regenerativa cardíaca. Homem-tronco embrionárias (ES) células e, mais significativamente, humanos-tronco pluripotentes induzidas (iPS) células representam uma potencial fonte renovável paciente específico de células progenitoras ventriculares e miócitos ventriculares maduros. A combinação da biologia de células-tronco e as estratégias de engenharia de tecidos resolve este problema através da geração de tecido do coração funcional in vitro que pode ser utilizado no desenvolvimento de ensaios celulares para a descoberta de drogas ou em abordagens cardíacas regenerativos para o tratamento da insuficiência cardíaca avançada. _content &quot;&gt; Um desafio central na regeneração cardíaca tem sido a identificação de um tipo de célula ideal. Uma vasta gama de células têm sido estudados 1, no entanto até à data, embora diferentes precursores cardiogênicos multipotentes a partir de várias fontes, foram descobertas, a identificação de uma célula fonte que atenda aos requisitos críticos, tais como comprometimento com o destino das células miogênicas, a manutenção da capacidade de expandir-se in vivo ou in vitro e da composição a um tecido funcional do miocárdio provou ser um problema central 2. Temos anteriormente descrito um sistema transgénico duplo murino que permite o isolamento de populações altamente purificadas de células progenitoras comprometidas ventricular (PVC) de células ES de diferenciação in vitro. Geramos um ratinho transgénico duplo novela que expressa a proteína fluorescente vermelha DsRed sob o controlo de um intensificador ISL1-dependente do gene e MEF2C a proteína verde fluorescente melhorada sob o controlo deo cardíacas específicas Nkx2.5 potenciador. Com base neste sistema repórter de duas cores fluorescentes, células progenitoras cardíacas primeiro e segundo campo de células ES de desenvolvimento podem ser isolados por meio de separação de células activadas por fluorescência (FACS) de acordo com a expressão de genes MEF2C e Nkx2.5. CVP assemelham miócitos cardíacos com base nos padrões de expressão de marcadores do miocárdio e qualidades estruturais e funcionais 3, que oferece uma grande promessa para fins regenerativos tecido cardíaco. Embora tenha havido muitos avanços no campo da engenharia de tecidos, imitando arquitetura celular nativa continua a ser um desafio fundamental. Os métodos convencionais para enfrentar este desafio são semeadura andaimes biológicos ou sintéticos com células in vitro. Devido a uma série de desvantagens dos andaimes, incluindo a degradação rápida, a estabilidade física e mecânica limitada e baixa densidade celular 1,4,5, procurou-se a engenharia de andaime, menos tecido. Altcélulas Hough cardíacos podem modificar seu microambiente local através da secreção de proteínas da matriz extracelular, eles têm uma capacidade mais limitada de se organizar para haste em forma de miócitos cardíacos, na ausência de sinais extracelulares. Assim, um modelo que fornece as células apropriadas pistas espaciais e biológicas para compor tecido miocárdico funcional é requerida. Impressão microcontact aborda este desafio, fornecendo uma técnica simples e de baixo custo para controlar com precisão a forma da célula, a organização e função 6-8, todos os quais são cruciais para a geração de tecido alinhado funcional do miocárdio. Ela inclui a utilização de microtextured polidimethilsiloxano (PDMS) selos com tamanhos característicos que vão até 2 m 9 que permitem a deposição de proteínas da matriz extracelular em substratos de PDMS em padrões precisos e, por conseguinte, afectar a adesão celular espacialmente. Aqui, propomos combinar tecnologia de bioengenharia de tecidos com haste cell biologia para gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio. Por conseguinte, temos aqui demonstram a nossa abordagem recentemente publicado para o seguinte: (1) a geração de superfícies de proteína micropatterned em PDMS substratos por impressão microcontact para a geração de um modelo para o tecido do miocárdio alinhados, (2) o isolamento de células progenitoras cardíacas altamente purificada a partir de As células ES de diferenciação in vitro, e (3) a combinação de ambas as técnicas para gerar alinhado tecido funcional do miocárdio.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Ácido L-Ascórbico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> Preparar uma solução 0,1 M em DDH 2 O </td></tr><tr><td> Dessecador, vácuo de 10 polegadas </td><td> Nova-Tech International, Inc. </td><td> 55206 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol, Dicloridrato (DAPI) </td><td> Life Technologies </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Modified Eagle Médium da Dulbecco </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30022.01 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> FACSAria citômetro de fluxo II </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal BovinoES célula-grade </td><td> Gémeos Bio-Products </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum Diferenciação de grau </td><td> Gémeos Bio-Products </td><td> 100-500 </td><td></td></tr><tr><td> A fibronectina do plasma bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F4759 </td><td> Solubilizar a 1 mg / ml em DDH 2 O </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium Cover vidro 22x22 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548 B- </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina de pele de suíno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Preparar uma solução de 0,1% em DDH 2 O </td></tr><tr><td> Coater da rotação Headway </td><td> Headway Research, Inc. </td><td> PWM32-PS-CB15 </td><td></td></tr><tr><td> Meio Modificado por Dulbecco Iscove </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30228.01 </td><td></td></tr><tr><td> Factor inibidor de leucemia </td><td> EuPreparado a partir de linhas celulares secretoras de LIF </td><td></td><td> Preparar a solução estoque 500x </td></tr><tr><td> MAM não-aminoácidos essenciais </td><td> Gibco </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td> Fibroblastos embrionários de ratinho </td><td> Colhida a partir de embriões de rato 12-15 dias </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2443 </td><td> Preparar uma solução a 1% em DDH 2 O </td></tr><tr><td> Round-fundo do tubo com 35 coador de células mM </td><td> BD Biosciences </td><td> 352235 </td><td></td></tr><tr><td> SPI Plasma-Prep II Cleaner Plasma </td><td> Suprimentos SPI </td><td> 11005-AB </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard184 Kit de elastômero de silicone </td><td> Dow Corning </td><td> 184 SIL ELAST KIT 0.5KG </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Vacuômetro </td><td> Suprimentos SPI </td><td> 11019-AB </td><td></td></tr></tbody></table>

generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing

Insuficiência cardíaca avançada representa um desafio unmet clínica principal, resultante da perda de viabilidade e / ou completamente funcional das células musculares cardíacas. Apesar da terapia de droga ideal, insuficiência cardíaca representa a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo desenvolvido. Um dos principais desafios no desenvolvimento de drogas é a identificação de ensaios celulares com precisão que recapitulam normal e doente fisiologia humana do miocárdio in vitro. Do mesmo modo, os principais desafios na biologia regenerativa cardíaca giram em torno da identificação e isolamento de células progenitoras específicas do paciente cardíaco em quantidades clinicamente relevantes. Estas células têm para, em seguida, ser montado em tecido funcional que se assemelha a arquitectura do tecido nativo coração. Impressão microcontact permite a criação de formas precisas de proteína que se assemelham a micropatterned organização estrutural do coração, assim fornecendo pistas geométricas para controlar a adesão celular espacialmente. Aquidescrevemos a nossa abordagem para o isolamento de células do miocárdio altamente purificada a partir de células estaminais pluripotentes de diferenciação in vitro, a produção de superfícies de células de crescimento micropatterned com proteínas da matriz extracelular, e a montagem das células-tronco derivadas de células do músculo cardíaco no tecido do miocárdio anisotrópica.

FACS-purificação de células in vitro diferenciadas ES revelou quatro populações distintas de células progenitoras (figura 1). A presença de fibronectina micropatterned foi confirmada por microscopia de imunofluorescência, que exibia uma transferência completa de fibronectina linhas contínuas (Figura 2). Chapeamento de FACS-isoladas células progenitoras para micropadrões fibronectina resultou em alinhamento do G + R + e parte do R ...

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Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K visualizações.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

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Fabrication of Biologically Derived Injectable Materials for Myocardial Tissue Engineering

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications. Briefly, decellularized tissue is lyophilized, milled, enzymatically digested, and then brought to physiological pH. The lyophilization removes all water content from the tissue, resulting in dry ECM that can be ground into a fine powder with a small mill. After milling, the ECM powder is digested with pepsin to form an injectable matrix. After adjustment to pH 7.4, the liquid matrix material can be injected into the myocardium. Results of previous characterization assays have shown that matrix gels produced from decellularized pericardial and myocardial tissue retain native ECM components, including diverse proteins, peptides and glycosaminoglycans. Given the use of this material for tissue engineering, in vivo characterization is especially useful; here, a method for performing an intramural injection into the left ventricular (LV) free wall is presented as a means of analyzing the host response to the matrix gel in a small animal model. Access to the chest cavity is gained through the diaphragm and the injection is made slightly above the apex in the LV free wall. The biologically derived scaffold can be visualized by biotin-labeling before injection and then staining tissue sections with a horse radish peroxidase-conjugated neutravidin and visualizing via diaminobenzidine (DAB) staining. Analysis of the injection region can also be done with histological and immunohistochemical staining. In this way, the previously examined pericardial and myocardial matrix gels were shown to form fibrous, porous networks and promote vessel formation within the injection region.

Methods for preparing an injectable matrix gel from decellularized tissue and injecting it into rat myocardium in vivo are described.

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

This protocol provides methods for the preparation of an injectable extracellular matrix (ECM) gel for myocardial tissue engineering applications.  ...

Bioengenharia

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Fabricando substratos de cultura complexos usando Robotic microcontact Printing (R-μCP) e substituição nucleofílica Sequential

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Engenharia de Tecido Tridimensional de Redes de Astrócitos Alinhadas para Recapitular Mecanismos de Desenvolvimento e Facilitar a Regeneração do Sistema Nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the context of liver diseases, 3-dimensional (3D) models based on cholangiocytes have emerged such as cysts, spheroids, or tube-like structures to mimic tissue topology for organogenesis, disease modeling, and drug screening studies. These structures have been mainly obtained by embedding cholangiocytes in a hydrogel. The main purpose was to study self-organization by addressing epithelial polarity, functional, and morphological properties. However, very few studies focus on cyst formation efficiency. When this is the case, the efficiency is often quantified from images of a single plane. Functional assays and structural analysis are performed without representing the potential heterogeneity of cyst distribution arising from hydrogel polymerization heterogeneities and side effects. Therefore, the quantitative analysis, when done, cannot be used for comparison from one article to another. Moreover, this methodology does not allow comparisons of 3D growth potential of different matrices and cell types. Additionally, there is no mention of the experimental troubleshooting for immunostaining cysts. In this article, we provide a reliable and universal method to show that the initial cell distribution is related to the heterogeneous vertical distribution of cyst formation. Cholangiocyte cells embedded in hydrogel are followed with Z-stacks analysis along the hydrogel depth over the time course of 10 days. With this method, a robust kinetics of cyst formation efficiency and growth is obtained. We also present methods to evaluate cyst polarity and secretory function. Finally, additional tips for optimizing immunostaining protocols are provided in order to limit cyst collapse for imaging. This approach can be applied to other 3D cell culture studies, thus opening the possibilities to compare one system to another.

Three-dimensional (3D) cellular systems are relevant models for investigating organogenesis. A hydrogel-based method for biliary cysts production and their characterization is proposed. This protocol unravels the barriers of 3D characterization, with a straightforward and reliable method to assess cyst formation efficiency, sizes, and to test their functionality.

Geração e Caracterização Quantitativa de Cistos Epiteliais Biliar funcionais e polarizados

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...