Estamos gratos pelo apoio do NIH (números Prêmio R00 NS072192 para MKL, HD029178 para AS.L., e 2 RO1 NS032457 para CAW). MKL é o destinatário de Boston das Crianças Carreira de Desenvolvimento da Irmandade Hospital / Harvard Medical Fellowship Shore School e membro da Fundação Alfred P. Sloan. CAW é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

1. Isolamento embrião / Preparação Esta técnica pode ser usada para ratinho ou rato. Neste protocolo que demonstram a técnica de coleta de LCR e dissecção explante cortical cerebral com o cérebro de rato embrionário. Vamos comentar sobre eventuais diferenças importantes para ratos contra ratos que existem dentro das técnicas gerais. Para o sistema de teste idade embrionária, E1 é classificado como o dia da ficha para ratos, E0.5 e é classificado como o dia da ficha para os ratos. <ol><li> Prepare um prato micro dissecção Sylgard com elastômero de silicone. Elastómero de Silicone Sylgard 184 é fornecido como um componente do líquido de duas partes, Parte A e Parte B. Parte A e Parte B são misturadas numa proporção de 10:1 em peso ou volume. Depois que os componentes líquidos são misturados, despeje o elastómero Sylgard em uma placa de Petri para cobrir toda a superfície do prato. Algumas bolhas de ar podem estar presentes que irá dissipar durante o processo de cura. Colocar a tampa no prato de Petri e permitir que o elastomer de curar. O elastómero pode ser curado à temperatura ambiente, durante 24 horas, ou a temperaturas mais elevadas (por exemplo 37 ° C) para uma mais rápida secagem. Uma vez que os componentes líquidos solidificar, o prato de dissecação está pronto para usar. O prato pode ser usado repetidamente por várias experiências, desde que seja feita bem após o procedimento. </li><li> Preparação da pipeta micro-capilar (agulha). Micro-pipetas capilares são preparados pela aplicação de calor e puxar usando um extrator micropipeta Narishige PC-10 vertical com as seguintes configurações: Um puxão passo; Aquecedor # 2 ajustado para 58, 100 g de peso tração. A ponta fina da micropipeta é cuidadosamente agarrado fora usando finas # 55 fórceps. O diâmetro médio resultante interior da agulha é de 85 ^ m. </li><li> Prepare a montagem aspirador de aspiração CSF. Insira micro-êmbolo provida de micro-pipetas capilares para dentro da agulha capilar. Alternativamente, anexar um filtro de plástico descartável para a extremidade do conjunto do tubo de aspiração que está ligado to o micro-pipeta capilar. Empurrar a agulha através da junta para a posição na extremidade oposta do conjunto do aspirador. </li><li> Transferência de embriões isolados da maca para um prato dissecção micro-preparado com Sylgard. </li><li> Remover as membranas extra-embrionárias e os tecidos de modo a que o embrião é claramente exposto. Cada tecido camada primeiro parede uterina e depois o. Decídua-pode ser dissecada com uma tesoura Iridectomia finas (Ferramentas Ciência ou seja Belas # 15000-02) Em cada local de implante, por um lado à parede do útero, em seguida, a decidua pode ser feita uma incisão paralela ao eixo longitudinal do útero, e a incisão pode então ser aberta ainda utilizando fórceps finos. A decídua pode ser removido depois de uma incisão semelhante, expondo as membranas fetais. Deve haver cuidado para que as membranas fetais não são incisão ou perfurado. </li><li> Lavar com solução estéril de sal equilibrada de Hanks (HBSS) e remover o excesso de fluido que envolve o embrião, utilizando uma pipeta, bem como um filtro ou Kimwipepapel cortado em triângulos. </li></ol> 2. Colecção ventricular CSF <ol><li> Visualize embrião sob o microscópio de dissecção: para rato, o embrião deve ser deitado de lado, de tal forma que se tem uma vista sagital do embrião em desenvolvimento. Com embriões de ratos E16 ou mais, posicionar o embrião em sua coluna dorsal, ao longo de sua maior dimensão planar, a partir de um crânio com a direção caudal, como se o embrião está deitado de costas. Deste modo, o LCR pode ser recolhida a partir tanto da direita e da esquerda do ventrículo lateral. </li><li> Firmemente inserir a pipeta micro-capilar para o ventrículo lateral, ventrículo mesencefálico ou cisterna magna, na tentativa de não contacto com as células neuroepiteliais uma vez que a pipeta foi inserida. Para os embriões de rato E14.5, ou mais, o LCR pode ser aspirado a partir do ventrículo direito e, em seguida, a agulha retirada e inserido no ventrículo esquerdo. Por causa da permeabilidade dos ventrículos e do tubo neural em embriões com menos de E14.5, ovolume de CSF inteira pode muitas vezes ser aspirado a partir dos ventrículos laterais com uma inserção de agulha única. No entanto, este não é sempre o caso, como tempos de desenvolvimento e de permeabilidade dos ventrículos de ligação pode variar ligeiramente, e, por conseguinte, o micro-pipeta capilar também pode ser inserido na cisterna magna de recolher o volume máximo CSF. </li><li> Uma vez que a micro-pipeta capilar é inserido no ventrículo lateral, ventrículo mesencefálico ou cisterna magna, com cuidado e gentilmente comecem aspiração do CSF ​​para a pipeta, utilizando o micro-êmbolo para criar pressão negativa e aspirar o LCR, ou fornecendo uma suave pressão negativa criada pela boca de modo que começa a CSF suavemente fluir para dentro da pipeta micro-capilar, de forma lenta e controlada. Recomendamos que o espectador verifica com seus próprios funcionários locais sobre as políticas institucionais sobre essas abordagens. </li><li> Continuar a aplicar pressão negativa e recolher o CSF ​​na pipeta micro-capilar.Em ambos os embriões de ratinho e rato de E16.5/E17 ou menos, é possível observar o colapso do ventrículo ligeiramente pelo aparecimento de um torrão formando no lado da cabeça do que a pipeta micro-capilar é dentro Em embriões mais velhos, devido ao aumento do tamanho do cérebro, pode não ser possível observar a cabeça em colapso. </li><li> Parar de aplicar a pressão e remover suavemente a pipeta micro-capilar do ventrículo lateral. </li><li> Suavemente expelir a amostra do LCR para um tubo Eppendorf que foi arrefecida em gelo. </li><li> Continuar a recolher a CSF de uma ninhada inteira de animais e piscina as amostras no mesmo tubo. </li><li> Centrifugar a 10.000 xg a 4 ° C durante 10 minutos para remover quaisquer células contaminantes. </li><li> Analisar as amostras para detectar quaisquer sinais de contaminação de células neuroepiteliais e células vermelhas do sangue. Sinais de contaminação são geralmente indicados pelo fluido que aparece turvo ou vermelho / rosa, ou a presença de uma pastilha com uma mancha de sangue tingido. Após a centrifugação, o CSF podem ser analisados ​​microscopicamente para qualquer evidência de células ou detritos celulares. Se houver sinais de contaminação do fluido deve ser descartada. Como um controle adicional, o teor de pellet pode também ser coradas para células. Uma amostra de CSF limpo pode ser utilizado para cultura de células, a cultura cortical, espectrometria, western blot, ELISA, e outros ensaios. O CSF clara deve ser transferido para um novo tubo Eppendorf estéril. A amostra pode agora ser utilizado para análise, combinada com as outras amostras, ou de snap congelados com azoto líquido e armazenado a -80 ° C. A congelação e descongelação de amostras pequenas de fluido pode resultar numa diminuição do volume pequeno e alterações na concentração de proteína. Isto pode ser evitado através de secagem por congelação das amostras. </li></ol> 3. Dissecção Explante cortical <ol><li> Transferir o embrião E14.5 isolado da maca em um prato de micro-dissecção preparado com Sylgard. </li><li> Remover embrião de membranas extra-embrionárias e dos tecidos, tal como descrito no passo 1.5. </li> &lt;li&gt; Lavar com solução estéril de sal equilibrada de Hanks (HBSS) e remover o excesso de fluido que envolve o embrião usando uma pipeta. </li><li> Dissecar através da região cervical separação da cabeça do resto do embrião (figura 1A). </li><li> Usando um bisturi fino (faca oftálmica), cortar a linha média do couro cabeludo. Agarrar cada um dos lados da incisão com uma pinça fina e remover a pele. Em seguida, use uma tesoura Iridectomia para fazer uma incisão que percorre toda a extensão da linha média do crânio em desenvolvimento. Subsequentemente, fazer duas incisões adicionais, cerca de 1/3 da distância das extremidades anterior e posterior do crânio em desenvolvimento. Use uma pinça fina para segurar as &quot;abas&quot; do crânio que resultam desta parte da dissecação, e remover o tecido em desenvolvimento crânio, expondo o córtex (Figura 1B). </li><li> Usando o cérebro bisect bisturi ao longo da linha média do plano médio-sagital, separando os hemisférios direito e esquerdo corticais (Figuras1B, C). A pia-aracnóide e são deixados ligados ao córtex, e na dura-máter é removido juntamente com o crânio em desenvolvimento. </li><li> Prepare cada hemisfério cortical separadamente. Coloque o lado medial do hemisfério acima de modo que você pode ver a eminência ganglionar e do córtex em desenvolvimento (Figuras 1C, D). </li><li> Usando o bisturi, faça uma incisão coronal através do neuroepitélio cortical caudal para o bulbo olfativo desenvolvimento. Esta incisão deve começar no limite anterior das eminências lateral e medial ganglionares, e se estendem através da região cingulado anterior do rudimento desenvolvimento cortical (Figura 1E). </li><li> Faça outra incisão coronal apenas caudal ao limite posterior da eminência ganglionar laterais (Figura 1F). Esta incisão também deve estender a partir do limite lateral da eminência ganglionar para a parede medial do rudimento desenvolvimento cortical. </li><li> Retrair a cortical &quot;flap&quot; created pelas duas incisões feitas em passos de 3,7 e 3,8, usando um bisturi ou pressão de um fluxo suave de HBSS entregues com uma pipeta de 200 uL para evitar danos mecânicos ao córtex. Em seguida, fazer uma incisão transversal ao longo do limite que separa a eminência ganglionar lateral, a partir do córtex em desenvolvimento (Figuras 1G, H). Então, dissecar afastado do hipocampo em desenvolvimento e bainha cortical do telencéfalo medial, no vértice do neocórtex, onde a superfície cortical lateral encontra a parede inter. </li><li> Fazer uma incisão transversal ao longo do limite que separa a eminência ganglionar lateral, a partir do córtex em desenvolvimento (Figura 1H). </li><li> Remover qualquer tecido extra que é dissecado na placa a partir do explante Sylgard dissecados cortical. Pode-se usar pipetagem suave com tampão HBSS fresco para pipetar fora qualquer tecido extra dissecados. O córtex dissecado agora é com o lado meníngea voltado para baixo (Figura 1I). </li></ol><ol><li> Prepara-se uma laçada de fio de platina ligado a uma pipeta de vidro. Aquece-se a pipeta de vidro com um fio de platina dobrada inserida na extremidade da pipeta de vidro. Por torção da extremidade do laço de fio de platina, o tamanho do laço pode ser aumentado ou diminuído, e o ciclo pode ser moldada para se ajustar ao tamanho do explante desejado. (Isto pode ser preparado antecipadamente e reutilizados.) </li><li> Aquece-se a extremidade do fio de platina para esterilizar o circuito. </li><li> Isolar o explante dissecados cortical e remova a mídia HBSS extras por pipetagem suave, deixando uma pequena quantidade para usar com a alça de arame. </li><li> Coloque de 1 cm de membrana de policarbonato de 4 cm de diâmetro prato de imagem. </li><li> Usando o lado da laçada do fio de platina, suavemente virar o córtex, de modo que o lado virado para cima está meníngea. </li><li> Levantar o explante cortical fora do prato de dissecação, ao colocar o explante no meio do ciclo e com as forças hidrostáticas intrínsecaslevantar o explante em uma superfície plana. </li><li> Coloque suavemente o explante sobre a membrana de policarbonato, e levantar a alça de fio de platina longe de tal modo que o explante permanece na membrana em uma superfície plana com a superfície ventricular fazendo contacto com a membrana. </li><li> Levantar suavemente a membrana e pipetar 50 uL de CSF ou outros meios de comunicação com a membrana. </li><li> Cobrir a placa de imagem, coloque-o num recipiente secundário humidificado, e incubando a 37 ° C em CO2 a 5% durante 24 h para suportar a proliferação de células e crescimento contínuos explante. Figura 2 representa um diagrama esquemático do prato preparação cortical do explante final. </li></ol>

<ol>
	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 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Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li><li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid.">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li><li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome.">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li><li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. 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A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

O método descrito para a recolha ventricular CSF produziu amostras relativamente puras de CSF embrionário com composição e actividade da proteína estável consistente em uma série de ensaios celulares 9. Com uma técnica boa coleção e tamanho de leitegada de 10 E14.5 ratos, pode-se esperar para coletar 10-15 ul da CSF, e de uma ninhada de ratos E16, pode-se esperar para coletar cerca de 50-90 ul da CSF. Esta técnica minimiza a contaminação a partir de recolha de sangue e de tecidos, por meio de obs...

A CSF é um fluido complexo que banha o neuroepitélio desenvolvimento 1-6 e fornece 7 pressão essenciais e promover o crescimento pistas para o cérebro em desenvolvimento 8-12. Para o estudo da CSF ao longo do desenvolvimento do cérebro, desenvolvemos técnicas para isolar CSF ventricular de desenvolvimento de embriões de rato ou mouse durante vários estágios de desenvolvimento 6,9. Os métodos anteriores de isolamento incluiu o uso de um vidro de micro-agulha e isolando o CSF utilizando um micro-injector 1,2. O nosso método utiliza uma pipeta de vidro de micro-capilar, cuja ponta foi puxado para criar um ponto de penetração do tecido ultrafinas melhorada. A pipeta de vidro de micro-capilar é ligado a um aspirador, de modo que recolha CSF ventricular pode ser controlada com mudanças suaves de pressão. Para investigar a influência de células-tronco de sinais LCR, dissecamos cerebrais corticais explantes, colocá-los em membranas de policarbonato, e flutuar-los no cu apropriadasLTURE meio suplementado com 9 amostras de LCR. Com esta técnica, uma redução dos volumes de meios de cultura são suficientes para o tecido, o que permite um uso eficiente da CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Wiretrop II agulhas capilares </td><td> Drummond Científico </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Adesivos Ellsworth </td><td> # 184 SIL ELAST kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspirador conjunto de tubos </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Filtro descartável </td><td> Venturi ou farmácia local </td><td> não disponível </td><td> Filtro de cigarro normal </td></tr><tr><td> Faca Roundstock oftálmico (15 faca facada grau) </td><td> Precision mundo Instruments, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35 milímetros de vidro prato de cultura fundo </td><td> MatTek Corp </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platina-irídio fio </td><td> Tritech Pesquisa </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Membrana Track-Etch </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Iridectomia </td><td> Belas Science Tools </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

A CSF é um fluido complexo, com uma proteoma dinamicamente variáveis ​​ao longo do desenvolvimento e na idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, a CSF nascente diferencia do líquido amniótico no fechamento do tubo neural anterior. Volume de LCR, então aumenta ao longo do dia subsequentes como as células progenitoras gliais que revestem os ventrículos e plexo coróide gerar CSF. Os contactos embrionárias CSF a superfície apical ventricular, das células estaminais neurais do cérebro e da medula espinal em desenvolvimento. CSF fornece pressão de fluido crucial para a expansão do cérebro em desenvolvimento e distribui crescimento importante promover factores de células progenitoras neurais de uma forma temporal específico. Para investigar a função do LCR, é importante isolar amostras puras de CSF embrionário sem contaminação a partir do sangue ou do tecido em desenvolvimento telencefálica. Aqui, nós descrevemos uma técnica para isolar amostras relativamente puras de ventricular embrionário CSF ​​que podem ser usados ​​parauma vasta gama de ensaios experimentais, incluindo a espectrometria de massa, electroforese de proteínas, e de células e cultura de explantes primários. Demonstramos como dissecar e cultura explantes corticais em membranas porosas de policarbonato para crescer desenvolvimento do tecido cortical com volumes reduzidos de mídia ou CSF. Com este método, as experiências podem ser realizadas utilizando CSF ​​a partir de diferentes idades ou condições para investigar a actividade biológica do proteoma CSF nas células-alvo.

A coleção CSF ​​deve produzir um líquido claro e transparente. Não deve haver qualquer evidência de contaminação do sangue, como foi demonstrado por um fluido tingido vermelho ou amarelo no aspirado e no tubo de Eppendorf. Também deve haver nenhuma evidência de tecido aspirado e no tubo de Eppendorf. Quando o CSF ​​é centrifugado, pode-se igualmente avaliar a CSF microscopicamente para assegurar que não existe contaminação. Se houver sinais de contaminação, o QCA deve ser descartada. De uma ninhad...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explantes com volumes mínimos de meio de cultura ou do LCR.

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

isolation-cerebrospinal-fluid-from-rodent-embryos-for-use-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K visualizações.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. O ventricular líquido cefalorraquidiano (LCR) banha os neuroepiteliais e cerebral células progenitoras corticais durante o desenvolvimento do cérebro no início do embrião. Aqui descrevemos o método desenvolvido para isolar CSF ventricular de embriões de roedores de idades diferentes, a fim de investigar a sua função biológica. Além disso, podemos demonstrar o nosso dissecção explante cerebral cortical e técnica de cultura que permite o crescimento de explant...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Neurociência

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

Preparação da amostra para análise de Endopeptidomic no líquido cefalorraquidiano humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Efeitos de Neurotrauma induzida por explosão em roedores pressurizado artérias cerebrais de médio

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo Imaging do transporte de fluido cefalorraquidiano através do crânio do rato intacto usando fluorescência macroscopia

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Técnicas de massagem chinesa: melhorando a função motora em ratos com paralisia cerebral

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal posture development, often accompanied by cognitive impairment. Massage, a traditional Chinese Medicine therapy, can coordinate Zang and Fu, regulate Qi and blood, make the viscera work more smoothly, and calm Yin and Yang. Furthermore, it has been an effective method for CP in clinical. This paper summarizes a set of simple and standardized manipulations of massage for young rats with CP, which is easy to follow. The procedure follows: first, massage of four limb acupoints, including Quchi (LI11) and Zusanli (ST36); second, massage of the abdomen acupoints Zhongwan (RN12), Tianshu (ST25), Guanyuan (CV4), and Qihai (CV6); and finally, massage of the abdomen of the rats. This set of massage methods considerably improved the motor function of young rats with CP and is simple, standardized, and easy to follow. We adapted this set of manipulation methods in animal models to promote the internationalization and standardization of massage.

Autor em destaque: Explorando o potencial da massagem terapêutica na paralisia cerebral usando modelos animais 

Here, we present a set of massage manipulations in the rat model of cerebral palsy that can considerably improve the motor function of cerebral palsy rats.

Massagem Abdominal para Melhorar a Disfunção Motora em Ratos com Paralisia Cerebral

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...