Este trabalho foi financiado doações de NINDS (NS066071) e da NIAAA. (P50AA017823) para ECO. Os autores agradecem ao Dr. Robert Quinn e os funcionários do Departamento de Recursos Animais de Laboratório para cuidar dos animais. Agradecemos Judson Belmont para suporte técnico, Nicole Belletier de assistência como um pesquisador Verão Graduação (SURF). Agradecemos também o Dr. David Cameron para comentários e edições em uma versão anterior do manuscrito.

1. Anteriores electroporações utero com expressão da proteína verde fluorescente plasmídeo <ol><li> Soluções para injecção de DNA de plasmídeo são preparados com CAG-eGFP DNA 27 diluído para a concentração de trabalho final de 0,33 mg / ml em DDH 2 O. Qiagen Endo-free Maxi-Preps são utilizadas para purificar o plasmídeo a partir de bactérias transformadas. Corante verde rápido a ~ 0,02% (w / v final) é adicionado à solução de DNA, como um marcador de injecção. </li><li> Para preparar a área cirúrgica, spray para baixo bancada de trabalho e estágio estereomicroscópio com uma solução de etanol 70% e seque. Pulverizar uma tesoura cirúrgica e pinças com etanol 70% antes da dissecção e seque. </li><li> Cronometrados grávidas suíços / Webster barragens são sacrificados no E13 por transferência para uma câmara cheia de CO 2 a partir de um cilindro pressurizado e a barragem é monitorizado até que todo o movimento parou, durante pelo menos 1 min. Após o sacrifício por inalação de CO2, os embriões são removidos do útero e colocados emde 10 cm de placa de Petri contendo gelada solução salina balanceada de Hanks (HBSS). </li><li> Dissecar cuidadosamente cada embrião das membranas que envolvem extraembryonic e manter geladas HBSS. </li><li> Transferir cada embrião individualmente para uma placa de 10 cm segundo Petri contendo HBSS frio. Use uma seringa Hamilton de injectar 2-3 ul da mistura de DNA rápido verde no ventrículo do hemisfério cerebral esquerdo, tendo o cuidado de injectar-se numa área cortical espacialmente separada da área cortical para análise futura. </li><li> Para electroporate, mantenha o embrião suavemente com uma pinça e coloque a pá levemente positivo do eléctrodo de pinça sobre a linha média dorsal da cabeça e levemente coloque a pá negativa por baixo do queixo do embrião. Electroporações são conseguidos com um electroporador BTX830 programado para entregar cinco impulsos de 30 V de 50 ms de duração, separadas por intervalos de 950 mseg. Essas configurações são para o modelo BTX830. Outros sistemas podem ser utilizados de acordo com o fabricante INSTRUÇÕESns. </li></ol> 2. Preparação Explante todo Hemisfério <ol><li> Após a electroporação, os embriões são colocados de volta para gelados HBSS. O cérebro é removido usando duas pinças de joalheiro # 5 para remover a pele e crânio cartilaginoso a partir da cabeça do embrião. A pinça é então deslizado por debaixo do cérebro para remover o cérebro intacto do crânio. O hemisfério electroporated (à esquerda) é, em seguida, dissecado a partir do tecido cerebral e do cérebro médio em anexo é removido. Durante todo o cuidado é tomado procedimento de dissecção para não danificar as meninges que recobrem o hemisfério esquerdo cortical. </li><li> Uma vez que cada dissecados de embriões são transferidos em HBSS, utilizando uma pipeta de 1 ml com uma ponta de pipeta de corte. O hemisfério é expelido suavemente para uma inserção de cultura de colagénio revestida. Até seis explantes hemisfério são dispostos lado medial para baixo em cada pastilha de 24 mm. Uma vez dispostos, HBSS excesso é removido da pastilha e a pastilha é então colocada em um poço de 35 milímetros de um prato de 6 poços. O poço contém exactly 2,7 ​​mL de meio: DMEM-F12 meios contendo Glutamax e suplementado com 2% de B-27, 1% G5 e 1% de Penicilina-Strep. Algumas gotas de meios de comunicação a partir do poço pode ser pipetado em cima de cada explante, mas não se adicione o meio em excesso do original de 2,7 mL por poço. </li><li> Uma vez que os explantes foram colocados em filtros de colagénio do prato de 6 poços contendo os explantes são colocados em um Rothenberg Billups (BR) câmara (que também contém um prato de humidificação com água). A 95% / 5% de oxigénio / CO mistura de gás 2 é injetado na câmara durante pelo menos 1 min antes de selar a câmara fechada e desconectar a 95% / 5% de oxigénio / CO 2 do tubo de abastecimento de gás. A câmara de BR é então colocado a 37 ° C de cultura de tecidos incubadora durante o resto do período de cultura, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fixação de explante para Histologia <ol><li> Numa hotte preparar a solução de fixação Pagano pelo primeiro g 8 solubilizante de paraformaldeído em 100 ml de pré-aquecido (~ 80 &amp; deg; C) DDH 2 O. Adicionar 1-3 gotas de NaOH concentrada para promover a solubilização e agitar suavemente. Uma vez solubilizados misturar a solução de paraformaldeído a 8% de 1:1 com uma solução que é de 500 mM de sacarose, 100 mM de Hepes, pH 7,4, 50 mM de MgCl2, 5 mM de KCl para uma concentração final de 4% de paraformaldeído em 250 mM Hepes 50 mM de sacarose , 25 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4. </li><li> Para corrigir os explantes aquecer a solução fix Pagano e 37 ° C. Remover rapidamente a maior parte dos meios DMEM/F12 de cada poço de cultura e adicionam-se 5 ml de Fix Pagano a cada poço de explantes. Certifique-se de cobrir cada explante completamente na correção. Fixar durante 1 h à RT. Não remova explantes de filtro antes de 1 hora da fixação. </li><li> Depois de remover a solução de fixação fix Pagano e substituir com Pagano solução sem correcção (250 mM de sacarose 50 mM de Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Adicionar algumas gotas de azida de sódio a 10% e armazenar a 4 ° C até que a incorporação. </li></ol> 4. Incorporação e Sectioning para Histologia <ol><li> Prepara-se uma solução de 10% de pele de vitela por solubilização de gelatina 10 g de gelatina de pele de vitelo em 100 ml de água quente (55-60 ° C). Colocar em solução de gelatina a uma placa quente a 60 ° C e periodicamente redemoinho até solubilizado. </li><li> Verter cerca de 10 ml da solução de gelatina a 10% na parte inferior de uma placa de 10 cm de Petri e deixar 30 minutos para solidificar. Isto irá formar um &quot;pad&quot; para a incorporação de explantes. Estas almofadas podem ser preparadas com antecedência dias e armazenado a 4 ° C. Use uma régua para desenhar uma grelha no fundo da placa de Petri e transferir explantes individuais em cada caixa da grelha. Remover a solução residual Pagano e utilizando um pipetador, cobrir cada explante, com solução a 10% de gelatina quente e deixa-se solidificar. Retomar a adição lenta de uma solução de gelatina, até que cada explante é completamente rodeado por gelatina, tomando cuidado para não derreter a almofada por meio da adição de um excesso de aquecer a gelatina de uma só vez. Permitir a gelatina para endurecer por ~ 1 hora. Uma vez endureceu o indiviexplantes ual pode ser cortado em pequenos blocos de gelatina. Os blocos são pós-fixados em Pagano fixar por 24-48 horas antes da corte com uma vibratome. </li><li> Explantes em blocos de gelatina são posicionados bulbo olfatório-se e seccionadas no plano coronal em 100 um de espessura. As secções são recolhidas e armazenadas em PBS + azida de sódio a 0,1% a 4 ° C até processamento imunohistoquímico. </li><li> Detecção imuno-histoquímica é realizada através da transferência de pontos para uma placa de 24 poços (2-3 pontos por poço). Primeiro bloco de anticorpo de ligação não específica por adição de 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 e 2% de BSA) a cada um, bem incubar 1 hora com agitação suave. O anticorpo primário apropriado é então diluído em PBST + B e 0,4 ml por poço é adicionado por incubação durante a noite à temperatura ambiente. O primário é lavada com PBS 3X lavagens, pelo menos, 10 min cada. O anticorpo secundário e 2 ug / ml de Hoechst 33342 mancha nuclear são então diluídas em PBST + B e as amostras são incubadas durante 2 h à RTcom agitação suave. Três lavagens de PBS (10 min cada) são executados e em seguida, as secções são montadas em lâminas com um 90% de glicerol a 50 mM Tris, pH 7,4, meios de montagem. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Temos melhorado e avaliadas num modelo experimental - explantes hemisfério inteiros - para o estudo do desenvolvimento cortical precoce (E13-E15). O modelo mostrou-se útil para a análise de migração e diferenciação da linhagem neuronal excitatória que constitui a camada 6 do córtex cerebral 25,37. As principais vantagens do sistema são: 1) crescimento organotípica DIV para 2, 2) simplicidade de preparação, e 3) o acesso aos neurónios experimental para a manipulação de electroporação, farmaco...

Os mamíferos cerebrais formas através do córtex concertada migração, proliferação e diferenciação de neurónios sucessivamente gerados. Cada neurónio nasce na zona ventricular (VZ) e migra do VZ na zona intermédia (IZ), formando a placa cortical (CP) 1. À medida que passam através de diferentes domínios corticais, os neurónios migram exibir vários modos de 2,3 a migração dependentes do meio extracelular e de outros elementos celulares (por exemplo, a glia radial) dentro do tecido em desenvolvimento. Neurónios corticais então prender migração no topo da placa de moldagem cortical nos processos coincidentes de prisão migração neuronal e 4 dendritogenesis. Desenvolvimento cortical é iniciada entre os dias embrionários 11-13 (E11-13) 5 a criação da camada plexiforme primordial 6 ou preplate (PP), uma camada de neurónios pioneiras que recobre o VZ. Em perspectivaCamada 6 neurônios corticais (ou seja, os primeiros neurônios corticais nascidos no VZ), em seguida, orientar seu somata em um padrão estereotipado e se fundem em uma camada distinta dentro do PP 7. Estes eventos dividir o preplate em um (camada cortical futuro 1) marginal superficial e uma zona de fundo, o último composto de células subplaca cortical (camada transitória 7). Este processo, denominado divisão preplate, é um evento fundamental para o crescimento futuro do córtex cerebral 8. Muitas mutações genéticas foram identificadas que interromper vários aspectos do desenvolvimento cortical 9. Desenvolvimento cortical também pode ser impactado negativamente pela exposição a toxinas ingeridas como a cocaína e álcool 10 11. Porque malformações corticais que surgem durante o desenvolvimento provavelmente contribui para distúrbios neurológicos (por exemplo, autismo, esquizofrenia), as investigações empíricas de perturbações do desenvolvimento cortical são inerentesly importante. É, portanto, de grande importância para delinear estratégias para estudar o desenvolvimento cortical que permitem testes rápidos de efeitos genéticos ou toxina, mas que também preservar as possíveis interações entre os neurônios de diferenciação, outros tipos de células e da matriz extracelular (ECM) durante esse período inicial do desenvolvimento do cérebro 12 . Explantes de fatia 13 ter fornecido um tal sistema e têm sido amplamente utilizados para o desenvolvimento do ensaio neurónio cortical 14-16. No entanto, ensaios de fatias podem sofrer da desvantagem de que a migração neuronal e laminação pode ser anormal 17 possivelmente devido a danos nas células meníngeas que rodeiam o cérebro em desenvolvimento e ancorar o andaime glial radial. Como radiais fibras gliais são um importante substrato para cortical neurônio interrupção da migração de 18 a lâmina basal por corte pode perturbar localmente arquitetura radial glial e levar a migração cortical alterada. Além disso, a sliced superfícies de explantes proporciona uma região de células mortas, que podem alterar a composição normal do ECM nestas áreas. Abordagens mais recentes têm focado sua análise sobre células localizadas no fundo da fatia que está cercado por adequadas tipos de células saudáveis ​​e ECM. No entanto, em alguns casos, estas abordagens mais recentes podem requerer que a fatia de espessura original de cultura ser crio-seccionado ou parafina seccionado após a fixação, de modo que o interior relativamente normal da fatia é disponibilizada para análise 19-21. Ambos vibratome original seccionamento para preparar as fatias de tempo real para a cultura, bem como o subsequente cryosectioning de fatias fixos para análise requerem cuidados e esforço para estes ensaios para o trabalho. Para fornecer uma abordagem simples e complementar para estudos do desenvolvimento cortical cedo, modificamos uma fatia abordagens existentes 13 para facilitar os estudos do desenvolvimento cortical cedo. Nós desenvolvemos uma whole modelo explante hemisfério semelhante a um modelo existente hemisfério E14 todo que envolveu culturas agitação em 65 rotações por minuto e permitiram o crescimento organotípica para 16-18 horas 22,23. Na nossa abordagem, explantes hemisfério inteiras são colocadas em membrana semi-permeável 13, com uma atmosfera de oxigénio de alta cultura 21,24 estender crescimento cortical organotípica durante 48 horas. Esta abordagem também permite a electroporação consistente de desenvolvimento de neurónios corticais. Os embriões são removidos do útero e electroporado para introduzir o ADN plasmídico e do telencéfalo é então dissecado. Cada hemisfério é isolado e colocado com o lado medial para baixo sobre um filtro revestido com colagénio. O explante é então cultivado durante um período de 48 horas, um período que abrange a divisão preplate 8. Durante o período de cultura, L6 neurônios desenvolvem a partir de precursor para neurónios diferenciados 25, posicionado correctamente no interior da placa cortical. Ao longo deste período, o desenvolvimentoneurónio é cercado pela ECM apropriada e tipos de células que se confrontar a célula correspondente in vivo. Este sistema já provou ser valioso para decifrar os eventos celulares que estão na base toxicidade do etanol 26, a camada de formação de 6 e preplate divisão 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Desenvolvimento cortical envolve complexas interações entre neurônios e não-neuronais, incluindo elementos de células precursoras, vasos sanguíneos, meninges e da matriz extracelular associada. Porque eles fornecem um ambiente adequado organotípica, explantes fatia corticais são muitas vezes utilizados para investigar essas interações que controlam a diferenciação neuronal e desenvolvimento. Embora benéficos, o modelo de explante fatia podem sofrer de inconvenientes, incluindo a laminação celular aberrante e migração. Relatamos aqui um sistema de explante todo hemisfério cerebral para estudos do desenvolvimento cortical precoce, que é mais fácil de preparar do que fatias corticais e programas de migração organotípica consistente e laminação. Neste sistema modelo, laminação precoce e padrões de migração continuar normalmente durante um período de dois dias, in vitro, incluindo o período de separação preplate, durante o qual camada cortical prospectivo seis formas. Em seguida, desenvolvemos um electroporação utero ex (EUEP)abordagem que alcança ~ 80% de sucesso na segmentação expressão GFP para os neurônios em desenvolvimento no córtex dorsal medial. O modelo de explante todo hemisfério faz desenvolvimento precoce cortical acessível para intervenção eletroporação, farmacológicos e abordagens de imagem ao vivo. Este método evita a cirurgia necessária de sobrevivência in utero eletroporação (IUEP) abordagens, melhorando simultaneamente a transfecção e consistência de segmentação de área. Este método irá facilitar os estudos experimentais de neuronal migração, proliferação e diferenciação.

O roedor córtex embrionário apresenta um gradiente neurogenético transversal ao longo do período de desenvolvimento, tais neocórtex que lateral é aproximadamente 1 dia mais maduro do que neocórtex dorsal medial 28. A maior parte da camada 6 neurónios são assim gerado (isto é, exibem a sua última fase S) na E12 no córtex lateral (também chamado Campo 40 5) e em E13 no córtex medial dorsal (também chamado campo 1 5). Dividindo Preplate começa aproximadamente 1 dia ...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica explante<em&gt; Ex utero</em&gt; Dissecção eletroporação, e cultura de todo hemisférios cerebrais do rato embrionário. A preparação facilita estudos farmacológicos e ensaios de função do gene durante o desenvolvimento precoce cortical.

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K visualizações.  SUNY Upstate Medical University. Este protocolo descreve um processo melhorado que implica explante Ex utero Dissecção eletroporação, e cultura de todo hemisférios cerebrais do rato embrionário. A preparação facilita estudos farmacológicos e ensaios de função do gene durante o desenvolvimento precoce cortical.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolamento de fluido cerebrospinal de embriões de roedores para uso com dissecados Cerebral Cortical Explantes

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...