Agradecemos ao SF 4206 Icore (Université de Caen) para o uso da facilidade de citometria. JC recebeu bolsas de pós-doutorado do Conseil de Radioproteção d&#39;EDF e Conseil Régional de Basse-Normandie. Esses dados fazem parte de projetos financiados pelo Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l&#39;Orne et du Calvados.

1. Preparação de C12FDG, bafilomicina A1 e Cultura de Células <ol><li> Dissolve-se o pó C 12 FDG em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 20 mM. Alíquota e armazenar a -20 ° C. DMSO deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas. </li><li> Dissolve-se o pó A1 bafilomicina em DMSO para uma concentração final de 0,1 mM. Alíquota e armazenar a - 20 ° C. Bafilomicina deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas. </li><li> Cultivar a linha de células RPMI 8226, ou outras linhas de células aderentes ou não, em meios contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO 2. Estimar o número de células necessárias para o experimento. A fim de registar um número suficiente de eventos durante a análise de citometria de fluxo, 5 x 10 5 células são necessários. Para determinar a porcentagem de células senescentes, são necessárias três amostras de células: Amostra sem rótulo, as células não tratadas marcadas com C 12 FDG, células tratadas corados comC 12 FDG. </li><li> Sementes das células 24 h antes do experimento de realização de modo a que as células estão na fase de log da curva de proliferação celular. </li></ol> 2. A indução da senescência <ol><li> Induzir a senescência das células cancerosas, adicionando um medicamento quimioterápico. Concentração da droga e da duração do tratamento deve ser adaptado ao tipo de célula testada. Comece com um tratamento de 48 horas com a concentração final de 50 nM para a doxorrubicina numa concentração de células de cerca de 10 6 células / ml. Não se esqueça de incluir amostra não tratada (controle negativo). </li></ol> 3. Bafilomicina A1 Tratamento <ol><li> Verificar a viabilidade celular em células de mistura com azul de tripano (v / v), com o medicamento quimioterápico utilizado no passo anterior pode levar à apoptose celular. Encher uma câmara de Malassez e contar o número de células azuis (células mortas) e de glóbulos brancos (células vivas). Se a percentagem de viabilidade for inferior a 70%, as células mortas pode ser removed usando um kit adequado para assegurar que as células mortas não influenciará a análise subsequente. </li><li> Remova os meios de cultura e substituir por novos meios de cultura pré-aquecido. Tratar as células com uma concentração final de 100 nM de bafilomicina A1. Bafilomicina A1 é utilizado para neutralizar o pH ácido dos lisossomos. Incubar 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 4. C 12 FDG Coloração <ol><li> Dissolve-se 12 C FDG em meios de cultura fresco pré-aquecido, a uma concentração final de 2 mM. </li><li> Adicionar o composto às células na concentração final de 33 uM e incubar 2 h a 37 ° C, 5% de CO 2. Se utilizar as células não aderentes, centrifugar as células a 300 xg por 5 min a 4 ° C (a velocidade pode ter que ser ajustada para o tipo de célula utilizado), lavar 2x com PBS. Ressuspender o sedimento celular em 500 uL de PBS frio. Se estiver usando células aderentes, remova a mídia e lavar 2x com PBS. Colher as células aderentes utilizando uma solução de tripsina e centrifugaras células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C (a velocidade pode ter que ser ajustada para o tipo de célula utilizado). Ressuspender o sedimento celular em 500 uL de PBS frio. Em ambos os casos, a concentração de células deve ser de cerca de 10 6 células / ml. </li><li> Realizar um co-imunomarcação para caracterizar ainda mais a população de células senescentes. </li></ol> 5. Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Calibrar o citómetro de fluxo, utilizando os grânulos de controlo recomendadas pelo fabricante do citómetro de fluxo. Para todas as etapas de, pelo menos, 10 eventos de 4 têm de ser registadas. </li><li> Executar a primeira amostra contendo células não marcadas. Prepare a dois parâmetros gráfico exibindo Canal Forward Scatter (FSC) versus Side Canal Scatter (SSC). Defina os tubos fotomultiplicadores (PMT) e definir uma região de interesse excluindo as células mortas e restos celulares que poderiam ter aparecido durante a preparação da amostra. Portão esta região de interesse de um histograma de um parâmetro FL1 exibindo na escala de logdo eixo x e o número de eventos no eixo y. O número total de eventos representa o número de células analisadas. Definir a PMT de modo que as células não marcadas aparecem na primeira década na escala de log do eixo x. Determinar a autofluorescência das células, se necessário. </li><li> Executar a segunda amostra contendo células não tratadas. No histograma um parâmetro exibindo FL1 (fluorescência de C 12 FDG), coloque o cursor após a população mal rotulados. Este limite vai permitir a discriminação entre células não senescentes (células mal rotulados) e células senescentes (células vivas rotulados). </li><li> Executar a terceira amostra contendo células tratadas. Brilhantemente células rotuladas, ou seja, células senescentes aparecem acima do limite determinado na etapa anterior. Avaliar a percentagem de células senescentes, dividindo-se o número de eventos brilhantes por o número total de eventos. Se necessário, a actividade de a-galactosidase β também pode ser estimada utilizando a média de fluorescênciaintensidade. </li></ol>

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos aqui um método baseado em citometria de fluxo para quantificar a senescência celular em células cancerosas vivas. Este método baseia-se na utilização do composto membrana permeável, a 12 C FDG, e pode, portanto, ser utilizado em qualquer tipo de célula e depois de vários tratamentos, desde que o composto é absorvido pelas células. Após a absorção celular, a 12 C FDG é hidrolisado pela β-galactosidase, enriquecido em lisossomas de células senescentes. Após excitação ...

Desde o início dos anos sessenta e sua descoberta por Hayflick e Moorhead, senescência ainda permanece uma curiosidade celular 1. As células humanas não indefinidamente proliferar e, por senescência, Hayflick e Moorhead cunhou o processo de envelhecimento celular. A senescência é uma paragem do ciclo celular estável em que as células permanecem metabolicamente activa em oposição à morte celular. Até à data, quatro mecanismos celulares têm sido mostrados para induzir a senescência: encurtamento dos telómeros, danos no ADN, perturbação da cromatina e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos 2. Isto indica que não só as células normais, mas também as células cancerígenas são capazes de sofrer a senescência 3. Por uma questão de facto, as células de cancro sujeitos a senescência foram mostradas para constituir uma barreira para a progressão do tumor 4-5. No entanto, vários relatórios já apontou que, em determinadas circunstâncias, a senescência celular também pode promover malignidade 6-7. Estudar senescência de câncer cells está prestes a tornar-se um impulso na pesquisa do câncer, como atualmente utilizado medicamentos quimioterápicos podem levar a senescência das células cancerosas não apenas in vitro, mas também in vivo 8. O ensaio principal para investigar quanto à presença de células senescentes, é o ensaio de β-galactosidase a um pH ácido. Este ensaio histoquímico reflecte o aumento na biogénese lisossómica ocorrendo na maioria das células senescentes. Resumidamente, exógena de X-gal, aplicada às células, é clivada pela β-galactosidase enriquecido em lisossomas de células senescentes, dando origem a uma cor azul 9. As células senescentes azul podem então ser quantificado num microscópio de campo claro. Embora muito popular, o ensaio β-galactosidase apresenta grandes inconvenientes. Em primeiro lugar, este ensaio é efectuado em células fixadas. Em segundo lugar, é demorado porque implica para quantificar o grau de senescência por contagem de um número significativamente maior de células senescentes, sob um microscópio. Terceiro, este testeNão é tão sensível a discriminação entre as células senescentes e não senescentes inteiramente depende do observador. Discute-se aqui, um ensaio baseado em citometria rápido e sensível para avaliar inexplorado para a presença de células senescentes vivos. Este ensaio baseia-se na hidrólise de uma molécula da membrana permeável, o 5-di-dodecanoylaminofluorescein β-D-galactopiranósido (C 12 FDG), por β-galactosidase enriquecida em células senescentes. Depois da hidrólise e da excitação do laser, a 12 C FDG emite fluorescência verde e pode, portanto, ser detectada por citometria de fluxo 10, 11. A detecção de células senescentes através de citometria de fluxo tem a grande vantagem de ser rápida e sensível. Além disso, a detecção de células senescentes, por citometria de fluxo pode ser combinada com a detecção de outros marcadores celulares. Este ensaio pode ser usado para detectar células senescentes dentro de uma população de células cancerígenas tratadas com quimioterapia, e pode ser rotineiramente ajustadose em cortes de tecidos, após a dissociação celular, na clínica.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

As células humanas não proliferar indefinidamente. Após a estímulos externos e / ou intrínseco, as células podem morrer ou entrar em uma parada do ciclo celular estável chamado de senescência. Vários mecanismos celulares, tais como o encurtamento dos telómeros e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos, têm sido mostrados para causar a senescência. A senescência não está restrita às células normais, as células cancerígenas têm também sido relatada a senescência. Agentes quimioterápicos têm demonstrado induzir a senescência das células cancerosas. No entanto, permanece controverso se a senescência impede ou promove a carcinogênese. Como se pode, eventualmente, ser específico para cada paciente, um método rápido e sensível para avaliar a senescência celular no cancro logo será necessária. Para este fim, o ensaio padrão β-galactosidase, o método utilizado correntemente, apresenta inconvenientes importantes: é demorado e não é sensível. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria de estudar senescência em live células. Este ensaio tem a vantagem de ser rápido, sensível e pode ser acoplada ao imunomarcação de vários marcadores celulares.

Mieloma múltiplo, uma malignidade hematológica, foi utilizado para avaliar a senescência induzida por um procedimento quimioterápico. Para fazê-lo numa linha de células MM comercialmente disponível (RPMI 8226) foi tratado durante 2 dias com doxorubicina, um fármaco quimioterápico. As células foram então submetidas a um tratamento bafilomicina A1 e ainda incubadas com 12 C FDG. As células foram analisadas por citometria de fluxo. Figura 1 ilustra as diferentes etapas, e mostra que ...

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A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.

Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.5K visualizações.  Université de Caen Basse-Normandie. Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.