A presente pesquisa foi apoiada por uma ERC avançada Investigator Grant (Pa-CSC 233460), Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de concessão nº 256974 (EPC-TM-NET) e Sem 602,783 (CAM-PAC ), o Subdirección Geral de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 &amp; PI12 / 02.643), eo Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha). E. Lonardo foi apoiado pela Roche Fellowship. M. Cioffi foi apoiado pelo Programa de Bolsas Predoctoral La Caixa.

PDAC tumores humanos foram obtidas com consentimento informado por escrito (Comunidad de Madrid, Espanha (CP CNIO-CTC-11 -. CI 11/103-E) Implantação de tumores pancreáticos humanos em ratinhos imunodeficientes requer a aprovação do Conselho de Revisão Institucional, bem como Institucionais . Animal Care e Use Committee (IACUC) Os procedimentos de modelos de mouse tumor pancreático de xenotransplante deve ser realizado em conformidade com as normas institucionais e nacionais (Comissão aqui Ética do Instituto de Salud Carlos III; Madrid, Espanha; Protocolo PA 34_2012). 1. Meios de Cultura <ol><li> Prepare Médio Completo. <ol><li> Suplemento de meio RPMI com 10% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina. Para 500 ml de meio RPMI adicionar 55 ml de FBS inactivado pelo calor e 6 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml, 100x). </li><li> Armazenar o meio completo a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare CSCs Médio. <ol><li> Complementar o DMEM / F12 mediu sem sorom, com 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina e 2 mM de glutamina. </li><li> Armazenar o meio de CSC a 4 ° C. B27 (1:50) e 20 ng / ml de bFGF foram recentemente adicionados ao meio antes de cada experiência. NOTA: A adição de B27 foi mostrado para aumentar a formação de esfera do tumor e manter a várias passagens de culturas esfera 32. A composição do meio é um passo crucial e tem de ser testado para cada tipo de célula em cultura. Recomendamos testes de auto-renovação e capacidade de diferenciação de esferas e analisar a expressão de marcadores CSC por citometria de fluxo (ie, CD133 + e CD44 +). </li></ol></li><li> Prepare Extracelular Fluxo de Meio de Dosagem. <ol><li> Este meio é específico DMEM basal 5030 contendo vitaminas, aminoácidos e outros suplementos, mas sem glutamina, glucose, piruvato e bicarbonato. </li><li> Para o ensaio corrente, suplementar o meio com 2 mM de glutamina, 8 mM de glicose e piruvato de sódio 2 mM a uma actividade metabólica mitocondrial completo. NOTA: A ausência de bicarbonato de sódio é essencial, a fim de medir com precisão a acidificação extracelular de células que crescem em cultura, uma vez que regulares meio contendo tampão de bicarbonato irá variações de pH durante o ensaio. Além disso, a utilização de um meio basal permite um controlo rigoroso da concentração de L-glutamina (como L-alanil-glutamina) de glucose, piruvato ou necessário para diferentes condições e / ou aplicações de ensaio de sódio. </li></ol></li></ol> 2. Sphere Forming Assay e Análise NOTA: Todos os protocolos de cultura de tecidos e manipulações deve ser realizada utilizando técnicas estéreis com grande atenção usando limpo, livre de detergente, artigos de vidro esterilizado. Antes de usar, pré-quente durante todo o meio e solução em um 37 ° C em banho-maria (como alternativa, você pode usar soluções pré-aquecido à temperatura ambiente médio e). Obter tumores PDAC humano como previamente descrito 21. <ol><li> Isolamento de CSCs de PDAC humano (Figura1) <ol><li> Em uma cabine de segurança biológica estéril transferir o tecido PDAC humano a um prato de 60 mm x 15 cultura contendo 1 mL de estéril 1X tampão fosfato salino (PBS). Picar o tumor em pedaços pequenos (1-5 mm), utilizando um bisturi e pinça estéril. </li><li> Adicionar 1 ml de estéril 1X PBS para o prato de cultura e repita o passo trituração até que o tecido está completamente dissociada, regularmente isso requer 3-4 rodadas. Transferir a suspensão de tecido (topo até um volume final de 5 ml com PBS 1X) para um tubo estéril e homogeneizar mecanicamente com um Dissociator tais como gentleMACS. </li><li> Incubar o tecido homogeneizado com colagenase (usar 2,5 mg / ml de colagenase em 1X PBS) durante 60 min a 37 ° C e, em seguida, centrifuga-se durante 5 min a 900 x g. Decantar o sobrenadante e ressuspender as pastilhas de células em 10 ml de meio completo. Filtra-se a suspensão de células através de um filtro de 40 ^ m e centrifuga-se durante 5 min a 900 x g. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender ogranular com 5 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos (-amónio cloreto de potássio-, ACK), e incuba-se a </li><li> Ressuspender o sedimento em meio CSCs, placa sobre uma placa revestida com gelatina, e incuba-se a 37 ° C durante 1 h. Este passo irá remover a maioria das células de fibroblasto que rapidamente se ligam à placa. </li><li> Remova a placa do incubador e recuperar cuidadosamente suspensão de células e quantificar o número de células (azul-negativas tripano) viáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para este efeito, misturar suavemente a suspensão e pipetar 20 ul da suspensão para um tubo Eppendorf. Adicionar 20 ul (proporção 1: 1) de azul de tripano às células no tubo de microcentrífuga e misturar bem. Pipetar cerca de 10 uL da mistura para o hemocitómetro. </li><li> Contagem de todas as células claras dentro dos quatro quadrantes de canto da câmara de contagem para contagem de células viáveis. Nota: A viabilidade e rendimento de células podem variar consideravelmente entre as amostras tumorais. Para PDAC viabilidade amostras varia regularmente between 45-70%, e pedaços de tecido a partir de uma amostra de tumor macroscópico com um diâmetro de 3-5 mm devam produzir a cerca de 5x10 6 células viáveis. </li></ol></li><li> Formação esfera Ensaio e tratamento com metformina <ol><li> Aqui o número necessário de células e adicionar o volume apropriado de meio CSCs para preparar uma concentração celular de 2000 células / ml. Não manter a suspensão de células em gelo durante não mais de 1h e bem misturada antes de chapeamento. </li><li> Adicionar 500 mL de 1X PBS para a primeira e última fileira de uma placa de 24 cavidades para a humidificação, de modo a ajudar a minimizar a evaporação forma. Semente as células em placas de células ultra-baixas de fixação a uma densidade de 2000 células por poço em 1 ml de meio de esfera do tumor (2000 células / ml). NOTA: O número de células utilizadas para ensaios de formação de esferas do tumor pode variar entre tipos de tumores. </li><li> Tratar pelo menos quatro poços com veículo (controlo negativo) e 4 poços com cada tratamento atribuído, por exemplo., 3 ​​mM de metformina. Place as células numa incubadora a 37 ° C e fornecer as células com 5% de CO 2 durante uma semana. NOTA: O meio não deve ser alterado, a fim de permitir a formação de esferas de tumor sem perturbações, mas pode ser complementado com factores de crescimento, numa base diária, como eles não são estáveis ​​em meio de cultura. </li><li> A cada dois dias adicionar o tratamento, por exemplo., 3 ​​mM de metformina ou do veículo a cada um dos poços. Avaliar o número de esferas de tumores formados após 5 e / ou 7 dias com a utilização de um contador de células automatizado que permite a contagem de estruturas maiores (Figura 2). NOTA: Somente as esferas do tumor com, pelo menos, 40 um deveriam ser consideradas e podem ser classificados como pequenas (40 - 80 mm) ou grande (80-120 mm), respectivamente. Os resultados podem ser ilustradas como a percentagem de esferas tumorais dividido pelo número inicial de células semeadas (por exemplo, 2.000 células). </li></ol></li><li> Passaging série de Primeira Geração Esferas de Tumor <ol&gt; <li> Após 7 dias de incubação a colheita das esferas de tumor utilizando um filtro de células de 40 ^ m e centrifugar-los durante 5 min a 900 xg à temperatura ambiente. </li><li> Dissociar o pellet de esferas tumorais para células individuais utilizando tripsina, e em seguida, expanda a suspensão de células únicas células obtido novamente por mais 7 dias, como descrito acima (ver 2.2). </li></ol></li></ol> 3. Metabolismo Análise (ROS Produção e Consumo de Oxigênio) <ol><li> ROS Produção <ol><li> Neste protocolo, temos usado carboxi-DCFDA como um exemplo para medir a produção de ROS, uma vez que é uma sonda acessível, rápida e amplamente utilizado para a detecção de ROS. No entanto, existem várias outras sondas e metodologias que podem ser utilizados para este ensaio. </li><li> Trate esferas de tumor com a metformina como descrito em 2.2 para o montante atribuído de tempo. No final do tratamento, as esferas de tumor colheita utilizando um filtro de células de 40 mm, centrifugar as células a 900 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento em 1 ml de Trypsem. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Uma vez que as células são singularizados, centrifugar a 900 x g e ressuspender as células em HBSS contendo 2,5 uM carboxi-DCFDA. Incubam-se as células durante 20 min a 37 ° C no escuro. </li><li> Antes de citometria de fluxo proteger as células manchadas de luz como carboxi-DCFDA pode ser dar resultados falsos positivos oxidado-photo. Colocar os tubos em gelo até à análise. NOTA: é carboxi-DCFDA fluorescentes após reacção com uma variedade de espécies reactivas de oxigénio e de azoto, sendo detectado em FL1 (ex-488 nm, em 520 nm..). </li></ol></li><li> Medição do consumo de oxigênio <ol><li> Para este protocolo, vamos usar o sistema Extracelular Flux Analyzer do cavalo marinho Biosciences, como um exemplo. Revestir a placa de cultura celular desejada com uma solução de 22,4 ug / ml de células e cola de tecido durante 20 min à TA. Lave os poços com água 2-3 vezes antes de semear as células. </li><li> No final do tratamento, as esferas de tumor colheita utilizando um 40 filtro de células de um, centrifugar as células a 900 xg durante 5 min e ressuspender o sedimento em 1 ml de tripsina. Incubar durante 20 min a 37 ° C. </li><li> Placa células na placa de cultura celular singularizados a uma densidade de 30.000 células / poço para uma placa de 96 cavidades (volume final: 150 uL). Ressuspender as células em meio de ensaio de consumo de oxigénio contendo 8 mM de glucose e piruvato de sódio 2 mM. </li><li> Centrifugar as células para o fundo do poço através da rotação de centrifugação até os poços 100 xg foi atingido e, em seguida, permitir que o batente de centrífuga com desligar travão. Inverta a orientação da placa e repita o processo. Transferir a placa para uma temperatura de 37 ° C, sem adição de incubadora de CO2 durante 30 min. </li><li> Ao mesmo tempo, preparar o cartucho para o ensaio. Cada poço tem 4 injetores diferentes para carregar (25 ul / portuárias): <ol><li> Port A: metformina. Para se obter uma concentração final de 3 mM no bem, preparar uma solução 8x (24 mM) como o volume final será de 175ul após a injeção de porto A. </li><li> Porto B: metformina. Para adicionar 3 mM e obter uma concentração final de 6 mM no bem, preparar uma solução de 9 x (27 mM) como o volume final será de 200 ul após a injecção de porta B. </li><li> Porta C: metformina. Para adicionar 3 mM e obter uma concentração final de 9 mM no bem, preparar uma solução 10x (30 mM) como o volume final será de 225 ul após a injecção de porta C. </li><li> Port D: rotenona 11 uM, 1 uM como para obter a concentração final no poço (11x). Nota: rotenona inibe completamente qualquer actividade mitocondrial residual. </li></ol></li><li> Calibra-se o cartucho e carregar a placa de cultura celular. Realizar o ensaio com o protocolo padrão de mistura e medição. </li><li> Calcula-se a percentagem de inibição da respiração mitocondrial total realizado por metformina como a percentagem de inibição obtida com rotenona (estabelecida como 100%). </li></ol></li></ol> 4.Xenoenxerto Modelo para o cancro do pâncreas humano em ratos imunocomprometidos NOTA: Os números suficientes de, modelos nus ou outras atímicos fêmeas mais imunocomprometidos mouse, como NOD-SCID, SCID-Bege, ou NSG para as experiências 33. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da experiência e permitir que arrefeçam até à temperatura ambiente antes da sua utilização. Para os tumores subcutâneos foi utilizado um mínimo de 4 ratos por condição com um tumor por flanco para um total de oito tumores. <ol><li> Xenoenxerto Transplantation <ol><li> Preparar a partir de peças tumorais espécimes de tecido de cancro pancreático humano. Transferência do tumor em uma placa de Petri e dissecar o tecido em pedaços pequenos (2 mm de diâmetro, ~ 8 mm3) utilizando um bisturi e pinça para segurar o tecido. Mergulhar as peças obtidas em solução de mistura de proteína gelatinosa mantido em gelo. </li><li> Anestesiar ratos usando 1-3% de isofluorano ou outros anestésicos inalados ou injetáveis. NOTA: Antes de iniciar qualquer proc cirúrgicoedure, garantir que os ratos perderam completamente a consciência, estimulando a pele abdominal ou reboca com um par de fórceps dissidentes. Aplicar pomada para evitar o ressecamento. </li><li> Uma vez que a anestesia começou a produzir efeitos, limpe a parte de trás dos ratos com contendo etanol pele anti-séptico. Administrar buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) antes da cirurgia, para garantir a analgesia pós-operatória. </li><li> Levante a pele para trás com uma pinça, faça uma 0,7-1,0 cm de comprimento incisão com tesoura micro estéreis e sem rodeios, então, preparar uma pequena bolsa subcutânea, no qual é inserido um pedaço de tecido de câncer de pâncreas derivado do paciente (~ 8 milímetros 3). </li><li> Fechar a ferida utilizando 1-2 grampos da pele. Removê-los após 7 dias. Retornar os ratos às suas gaiolas e mantê-los em uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de aquecimento até que estejam totalmente ativo novamente. </li><li> Após a implantação do tumor, os ratos monitorizar, pelo menos, duas vezes por semana para o crescimento do tumor e os sinais gerais de morbilidade resultante tal como pele enrugadas, hunched postura e imobilidade. </li><li> Uma vez que os tumores atingem um tamanho médio de 200 mm3, os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente para tratamentos respectivos. Administrar veículo ou metformina diariamente através de injeções ip (150 mg / kg BW) ou através da água potável (150 mg / kg de peso corporal) com os efeitos do tratamento comparáveis. </li><li> Monitorar a carga do tumor utilizando um calibrador e calcular o volume do tumor uma vez por semana (medição do volume do tumor = comprimento x 1/2 respiração x largura). </li><li> Sacrificar os ratos uma vez os tumores atingem 1 cm de diâmetro ou ratos começam a mostrar sinais de dor ou doença grave, conforme especificado acima. </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+and+cancer:+doses,+mechanisms+and+the+dandelion+and+hormetic+phenomena.">Metformin and cancer: doses, mechanisms and the dandelion and hormetic phenomena.</a> Cell Cycle. 9 (6), 1057-1064 (2010).</li><li>Honjo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+sensitizes+chemotherapy+by+targeting+cancer+stem+cells+and+the+mTOR+pathway+in+esophageal+cancer.">Metformin sensitizes chemotherapy by targeting cancer stem cells and the mTOR pathway in esophageal cancer.</a> Int J Oncol. 45 (2), 567-574 (2014).</li><li>Wurth, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+selectively+affects+human+glioblastoma+tumor-initiating+cell+viability:+A+role+for+metformin-induced+inhibition+of+Akt.">Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability: A role for metformin-induced inhibition of Akt.</a> Cell Cycle. 12 (1), 145-156 (2013).</li><li>Cufi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin-induced+preferential+killing+of+breast+cancer+initiating+CD44+CD24-/low+cells+is+sufficient+to+overcome+primary+resistance+to+trastuzumab+in+HER2++human+breast+cancer+xenografts.">Metformin-induced preferential killing of breast cancer initiating CD44+CD24-/low cells is sufficient to overcome primary resistance to trastuzumab in HER2+ human breast cancer xenografts.</a> Oncotarget. 3 (4), 395-398 (2012).</li><li>Lonardo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metformin+targets+the+metabolic+achilles+heel+of+human+pancreatic+cancer+stem+cells.">Metformin targets the metabolic achilles heel of human pancreatic cancer stem cells.</a> PLoS One. 8 (10), e76518 (2013).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+B27+supplement+on+promoting+in+vitro+propagation+of+Her2/neu-transformed+mammary+tumorspheres.">The effect of B27 supplement on promoting in vitro propagation of Her2/neu-transformed mammary tumorspheres.</a> J Biotech Res. 3, 7-11 (2011).</li><li>Ishizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-initiating+cells+are+rare+in+many+human+tumors.">Tumor-initiating cells are rare in many human tumors.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 279-282 (2010).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Singec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+actual+sensitivity+and+specificity+of+the+neurosphere+assay+in+stem+cell+biology.">Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology.</a> Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).</li><li>Lawson, D. A., Xin, L., Lukacs, R. U., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+characterization+of+murine+prostate+stem+cells.">Isolation and functional characterization of murine prostate stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (1), 181-186 (2007).</li><li>Seaberg, R. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+rodent+neurogenic+regions:+the+ventricular+subependyma+contains+neural+stem+cells,+but+the+dentate+gyrus+contains+restricted+progenitors.">Adult rodent neurogenic regions: the ventricular subependyma contains neural stem cells, but the dentate gyrus contains restricted progenitors.</a> J Neurosci. 22 (5), 1784-1793 (2002).</li><li>Jimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+direct+pancreatic+cancer+xenograft+model+as+a+platform+for+cancer+stem+cell+therapeutic+development.">A direct pancreatic cancer xenograft model as a platform for cancer stem cell therapeutic development.</a> Mol Cancer Ther. 8 (2), 310-314 (2009).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+'side+population'+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct 'side population' of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Miranda-Lorenzo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+autofluorescence:+a+biomarker+for+epithelial+cancer+stem+cells.">Intracellular autofluorescence: a biomarker for epithelial cancer stem cells.</a> Nat Methods. 11 (11), 1161-1169 (2014).</li></ol>

Os autores não têm interesse competindo para divulgar.

Com o surgimento e posterior validação do conceito de CSC para muitos tumores, o campo de desenvolvimento de medicamentos ganhou novo impulso, com o potencial para o desenvolvimento de tratamentos de câncer mais eficientes e, posteriormente, redução do risco de recidiva da doença. No entanto, o campo CSC ainda está em um estado precoce e mais precisa ser alcançado em termos de compreensão origem CSC e propagação, e seu papel na formação da arquitetura tumor e promovendo metástase. Neste contexto, a utilização de ensaios de CSC e reprodutíveis significativos, bem como a interpretação de dados informado obtido representa um componente fundamental para o avanço da nossa compreensão da biologia CSC. A partir de muitas perspectivas biológica, formação esfera emergiu como um ensaio extremamente valioso; no entanto, os usuários devem estar cientes de suas limitações, a fim de interpretar corretamente os resultados experimentais. Um aspecto importante a considerar antes mesmo da avaliação da esfera formação de dados, é a origem da amostra investigada, uma vez que os resultados obtidos a partir de amostras frescas derivado de paciente pode ser significativamente diferentes dos obtidos a partir de linhas celulares de cancro estabelecidas. Clássicos ensaios de formação envolvem a esfera sementeira de células a uma densidade clonal em placas de ultrabaixo-fixação e avaliar a formação esfera na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e / ou factor de crescimento de fibroblasto básico (b-FGF) enriquecido, mas meio isento de soro de 21, 34. A composição do meio de cultura é também uma questão importante a considerar. Na nossa experiência verificou-se que o DMEM / F12 suplementado com B27, bFGF e glutamina na ausência de soro era um meio ideal para crescer, expandir-se e manter a CSC em condições indiferenciadas. Verificou-se que nestas condições de cultura (meio de suspensão e) as células expressam quantidades elevadas de marcadores de células estaminais do cancro (incluindo CD133 +, CD44 + e CD24 +) e não expressam proteínas associadas à diferenciação (CK-20 E CK-19). Um dos pressupostos fundamentais para estes ensaios é que cada esfera é clonal, ou seja, uma esfera resulta da expansão de uma única célula-tronco. No entanto, as esferas são intrinsecamente estruturas dinâmicas que são propensas a se fundir, mesmo a baixa densidade de semeadura 35. Chapeamento de células é um passo crítico no protocolo ea densidade de uma célula / poço certamente pode contornar o problema de agregação. Mas mesmo para progenitores prospectivamente ordenadas, este regularmente resulta na formação de muito baixa esfera, devido à baixa actividade de formação de esfera intrínseca e também pode ser atribuída a estimulação autócrina limitado devido aos efeitos de diluição. Na nossa experiência, observou-se que apenas 30% das células plaqueadas são capazes de formar esferas. Recomenda-se também utilizar, pelo menos, 100 células / a obtenção de resultados consistentes e reproduzíveis. Outros métodos de cultura para a CSC crescimento baseiam-se em culturas em 3D sólido ou semi-sólidos (por exemplo, com base em matrigel, colagénio ou metilcelulose). Estes métodos têm sido utilizados para limitar a mobilidade de células e agregação de células posterior 36. No entanto, cada uma dessas matrizes carrega as suas próprias limitações. Por exemplo, Matrigel é uma membrana basal solúvel isolado do Engelbreth-Holm-Swan (EHS) do tumor e, embora o extracto do tumor se assemelha ao ambiente extracelular complexo encontrada em muitos tecidos, que contém múltiplos factores de crescimento mais ou menos bem definidos, que muitas vezes presta mecanicista estudos para elementos reguladores específicos muito difícil. Outro ponto de consideração é que as funções das células-tronco de capacidades e de formação de esfera não são termos intercambiáveis ​​34. Enquanto certas células estaminais e progenitoras têm mostrado exibir falha de formação de esfera capacidade de 37, para gerar in vitro esferas não exclui função in vivo tronco / progenitoras. Por exemplo, as células estaminais quiescentes simplesmente não podem responder aos estímulos extracelulares previstos pelaseleccionado em condições de cultura in vitro. Assim, a longo prazo in vitro e na capacidade de auto-renovação vivo de populações de células purificadas, preferencialmente durante passagens em série, deve ser avaliada a fim de provar ou refutar a função das células-tronco. Neste contexto, a capacidade de propagar prospectivamente e, simultaneamente, várias populações de células estaminais e progenitoras é um aspecto crucial do ensaio de formação de esfera e torna este ensaio altamente valiosa para o campo CSC; contanto que as suas limitações são mantidos em mente para a interpretação dos dados obtidos. Os ensaios de formação de esfera têm sido amplamente utilizados para identificar células estaminais retrospectivamente com base na sua capacidade de auto-renovação e diferenciação ao nível da célula individual in vitro. A descoberta de marcadores que permitem o isolamento de células estaminais em perspectiva e a sua progénie de seu nicho in vivo permite que as propriedades funcionais de populações purificadas a ser definida. O combination de ensaio de formação de esfera e o FACS é uma estratégia eficaz para isolar as células de tecido sólido ou enriquecer subpopulações específicas de PDAC em cultura. Por exemplo, a expressão simultânea de EpCAM, CD24 e CD44 define uma subpopulação de CSCs capaz de: auto-renovação, diferenciar e iniciar um tumor, o que reflecte a heterogeneidade do tumor original. Hermann et ai. mostrou que as células CD133 + possuía capacidade proliferativa aumentada e CSC dispõe de 15. Outros marcadores também têm sido utilizados para a caracterização das CSCs: expressão (1-desidrogenase aldeído) ALDH- 1 está associada com células altamente tumorigénicas em 38 cancro do pâncreas; células capazes de excluir o corante de ADN Hoechst 33342, população lado nomeado (SP) células, têm a capacidade comprovada para iniciar tumores 39. Recentemente, nós mostramos que um compartimento subcelular autofluorescência caracteriza uma população distinta de células humanas com traços exclusivos CSC em diferentes tipos de tumores40. Apesar de nenhum destes marcadores parece caracterizar selectivamente uma população pura das CSCs, combinações de marcadores mais complexos e mais precisa de ser utilizado para purificar FACS populações de células mais refinados. Muitas questões ainda permanecem sobre o papel preciso de CSCs na origem, progressão, e resistência a drogas de tumores. Por exemplo, uma maneira de abordar a questão de evolução clonal para definir se e como um único CSC inicia um tumor, poderia ser a de analisar amostras de pacientes em diferentes estágios da doença, e especificamente seguir os números de CSCs durante e após o tratamento. Ao responder a estas perguntas, podemos fazer progressos significativos do nosso conhecimento de CSCs em tumores sólidos e desenvolver terapias medicamentosas para prevenir a progressão do tumor e, em última análise recaída.

Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) é um dos tumores sólidos mais agressivos. É atualmente o 4º morte mais comum relacionada com o cancro na sociedade ocidental e está previsto para subir para a 2ª causa mais freqüente dentro da próxima década (~ 400 mil mortes por ano no mundo) 3 .No momento do diagnóstico de 90% dos pacientes apresentam com doença avançada, que tem uma sobrevivência de menos de 5% de 5 anos. Esta taxa de sobrevivência foi decepcionante manteve-se inalterada nos últimos 50 anos, apesar de as actividades de investigação cada vez mais intensivos 4. Dos restantes 10% dos pacientes que têm, potencialmente, a doença &quot;curável&quot; através de ressecção cirúrgica, 80% morrerão de reincidência no prazo de 5 anos. Por muitos anos o padrão de cuidados para a doença avançada tem sido monoterapia gemcitabina, mas isso só confere uma vantagem de sobrevivência marginal 5. Pequenas melhorias na sobrevivência a curto prazo foram alcançados pela adiçãode erlotinib 6 ou 7 capecitabina, no entanto, o benefício de sobrevivência é na ordem de semanas com a sobrevivência global mediana ainda ~ 6 meses. Recentemente, resultados mais encorajadores surgiram para gemcitabina / paclitaxel nab 8 ea combinação FOLFIRINOX regime 9,10. Estas terapias melhorar a sobrevida média por uns modestos 2 e 4 meses, respectivamente, mas são altamente tóxicos e sobreviventes a longo prazo ainda são uma rara exceção. Embora o tratamento oferece o potencial de melhoria, estes são regimes tóxicas a que muitos pacientes não respondem ou mostram apenas melhorias incrementais na sobrevida global. Como consequência, há uma necessidade urgente para complementar as terapias actuais e desenvolver novos, abordagens terapêuticas multimodais mais prováveis. Tumor Heterogeneidade É cada vez mais evidente que a heterogeneidade câncer não está confinada somente à distinta evolutiva subclones within cada tumor 11, mas também accionado por fenotípica e heterogeneidade funcional e plasticidade dentro de cada sub-clone 12. As chamadas células-tronco cancerosas (CSCs) ou células promotoras de tumor são responsáveis ​​pela heterogeneidade intraclonal 13-16. Especificamente, CSCs representam um subconjunto de células de câncer, para que nós e outros forneceram evidências conclusivas, até a única célula, que representam a raiz da doença, dando origem a todas as progênies diferenciadas dentro de cada subclone câncer 17. Mais importante ainda, estas células são essenciais para o comportamento metastático e também representam uma fonte importante para a recidiva da doença após o tratamento, mesmo com drogas relativamente eficazes, capazes de induzir a regressão do tumor inicial (por exemplo, paclitaxel nab) 15,18-20. É importante notar que CSCs não representam necessariamente bona fide células-tronco, nem eles surgem a partir de células-tronco do tecido em muitos casos, mas eles têm acquired certas características das células-tronco. A maior parte destes são funcionalmente definidos, por exemplo CSCs estão equipados com a capacidade de auto-renovação indefinido o que os torna resistentes à quimioterapia convencional, e mostram aumento da capacidade de invasão, que promove a actividade metastática. Os fenótipos funcionais células-tronco cancerígenas O fenótipo funcional de CSCs é baseada na sua capacidade de se auto-renovar, que podem ser testados in vitro, utilizando a formação de esfera de série e ensaios de formação de colónia, respectivamente. Ainda mais importante, os CSCs capazes de auto-renovação urso em tumorigenicidade in vivo que podem ser testadas por diluição limitante em ensaios in vivo como a leitura funcional final, de preferência, durante o transplante de série exclusiva indicativo de tumorigenicidade de longo prazo. Além disso, existe uma grande heterogeneidade no interior do compartimento do CSC, com uma subpopulação distinta de CSCs ostentam a capacidade exclusiva para dar origem a metástases que não é apenas umconseqüência direta de sua exclusiva em tumorigenicity vivo. Na verdade, CSCs metastastitic adquirir a capacidade de iludir o tumor primário, anoikis sobreviver e, eventualmente, translocam e sementes locais secundários. Estas capacidades funcionais avançados podem ser ensaiados in vitro usando ensaios de invasão modificados e in vivo, utilizando ensaios de metástases. Segmentação células-tronco cancerosas Nós e outros forneceram evidências convincentes de que os tratamentos com foco na massa tumoral de células diferenciadas PDAC, mesmo em combinação com agentes de direccionamento do estroma, não têm um grande impacto sobre a progressão do tumor e resultado subsequente a menos que combinado com uma estratégia de segmentação CSC-21, 22. Assim, com base nas funções essenciais de CSCs na progressão da doença e resistência à terapia, estas células deve significar um componente essencial para qualquer nova abordagem de tratamento 18,20, mas irá exigir um conhecimento muito mais completa of a maquinaria reguladora de CSCs. Embora CSCs e suas progênies mais diferenciados suportar estados idênticos terra genéticas em relação a alterações genéticas, CSCs apresentam expressão genética distinta e, portanto, epigenetically determinado perfis que módulos share com células-tronco pluripotentes. A maioria dos genes envolvidos na geração de células-tronco pluripotentes induzidas (Nanog, OCT3 / 4, Klf4, Sox2) não só foram ligados ao câncer, mas a sua expressão é praticamente restrito ao compartimento de CSCs. Além disso, a relevância funcional dos CSCs por experiências de perda de função usando ferramentas genéticas para o direcionamento de CSCs já estabeleceu firmemente o conceito de CSC para vários tipos de câncer 23-25. Embora a maioria destas abordagens são baseadas em modelos de ratos e, portanto, não são facilmente transferíveis para a clínica, eles não fornecem prova-de-conceito para o potencial relevância clínica da segmentação CSCs em combinação com células tumorais em massa. Estudando células-tronco cancerosas Em Vitro identificar seu calcanhar de Aquiles A fim de identificar novos modos e clinicamente aplicável para o direccionamento CSCs, as suas características são regularmente estudada in vitro e a formação de esfera é amplamente utilizado neste contexto. Originalmente desenvolvido para o estudo de biologia das células estaminais normais, incluindo a auto-renovação e diferenciação da capacidade, este ensaio foi depois adaptado para estudar CSCs in vitro e tem sido utilizado para investigar os CSCs isoladas de PDAC 20. Descobrimos que as esferas tumorais formados a partir de células humanas primárias PDAC suportar todas as características distintas de CSCs, portanto, indicando que eles contêm bona fide 21 CSCs pancreáticas. Assim, o ensaio esfera tumor representa uma ferramenta poderosa para a tela para terapias mais eficazes in vitro, mas os resultados precisam ser melhor avaliadas em mais rigorosos ensaios in vivo. Com efeito, os dados gerados com este ensaio in vitro deverá ser tratado com grande cuidado, pois the ensaio pode ser sujeito a erros significativos. Protocolos altamente padronizados, incluindo contagem automatizada de esferas formadas, devem ser estabelecidos para garantir que os dados reprodutíveis e preditiva. Neste contexto, recentemente utilizado este ensaio para a tela CSCs pancreáticas derivados de um conjunto diversificado de PDACs humanos primários e mostrou que estas células são altamente vulneráveis ​​a reprogramação metabólica pela metformina composto anti-diabético. Anteriormente, tinha sido demonstrado metformina para inibir a expansão de células de cancro através da activação indirecta de quinase ativada por AMP proteína (AMPK) e a subsequente inibição de sinalização da mTOR 26, resultando na síntese de proteínas reduzida e a proliferação de células 27. Em adição a estes efeitos sobre a população de tumores grandes quantidades, nós e outros descobriram que a metformina é capaz de atacar e eliminar efectivamente a subpopulação CSCs numa série de tumores sólidos, tais como cancro da mama, cancro do esófago, o glioblastoma e o cancro do pâncreas 28-31 &lt;/ Sup&gt;. Assim, a metformina representa uma nova estratégia terapêutica promissora e segura para vários tipos de câncer com necessidade médica não atendida atualmente. Além disso, utilizando a formação de esfera, como um meio de enriquecer para os CSCs, que mostrou que os efeitos primários da metformina sobre CSCs pancreáticas foi independente da activação de AMPK e confiou na sua toxicidade mitocondrial modesta (através da inibição do complexo I), o que aparentemente foi letal para o subconjunto de CSCs somente. Para este último, fomos capazes de avaliar o seu consumo de oxigênio e produção de ROS mitocondrial celular como indicadores de toxicidade da droga a nível celular. Posteriormente, esses dados in vitro poderia ser validados em modelos pré-clínicos de mouse e de fato resultou em 31 sobrevivência significativamente prolongada. A metodologia aqui apresentada permite a rápida geração de perfis de sensibilidade aos fármacos para os CSCs, incluindo estudos sobre os seus efeitos sobre o metabolismo do CSC. Nós agora fornecer prorrogado detalhes experimentais sobre o utilizado complementar in vitro e em procedimentos in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Counting Chamber/Hemocytometer&#160;</td>
			<td>Hausser Scientific Co</td>
			<td>3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement</td>
			<td>Roche Innovatis</td>
			<td>AG CASY Model TTC 45,60,150 &#956;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes&#160;</td>
			<td>Miltenyi Co</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Ultra-low Attachment Plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm tissue culture dishes&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL polypropylene conical tube&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml sterile tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 120.086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes, 10 cm dishes&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>300600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ul Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton Syringe Co</td>
			<td>81075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin solution, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metformin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D150959-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200 mM, 100X&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mM Sodium Pyruvate solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Assay medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>100965-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution, 0.05%&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement 50x&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fibroblast Growth Factor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium/F12&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1x Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2&#39;,7&#39;-DichlorofluoresceinDiacetate)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>C-369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70% (vol/vol)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane</td>
			<td>IsoVet, Braun</td>
			<td>571105.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>35620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Sterile Cotton tipped applicator</td>
			<td>&#160;Puritan medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>102416-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF96e Extracellular Flux analyzer</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with CO2 input&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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			<td>Micro scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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			<td>Curved forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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			<td>Splinter forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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			<td>Caliper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying pancreatic cancer stem cell characteristics for developing new treatment strategies

Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) contém um subconjunto de células estaminais cancro exclusivamente tumorigénicas (CSCs) que foram mostrados para dirigir a iniciação do tumor, metástase e resistência à radio- e quimioterapia. Aqui nós descrevemos uma metodologia específica para a cultura de CSCs pancreáticas humanas primárias como esferas tumorais em condições independente de ancoragem. As células são cultivadas em condições não-aderentes isentas de soro, a fim de enriquecer para os CSCs enquanto suas progênies mais diferenciadas não sobrevivem e proliferam durante a fase inicial após a sementeira de células individuais. Este ensaio pode ser utilizado para estimar a percentagem de CSCs presentes numa população de células tumorais. Tanto o tamanho (que pode variar 35-250 micrómetros) e número de esferas tumorais formados representa a actividade de CSC abrigava tanto em populações em massa de células cancerosas em cultura ou recentemente colhidas e digeridos tumores 1,2. Utilizando este ensaio, verificou-se recentemente que a metformina ablates seletivamente pancreatic CSCs; uma descoberta que foi posteriormente confirmada pelos demonstrando expressão diminuída de genes / marcadores de superfície associada à pluripotência e reduziu em tumorigenicity vivo de células tratadas com metformina. Como etapa final para desenvolvimento pré-clínico que tratou ratinhos com tumores estabelecidos com metformina e encontrou sobrevivência significativamente prolongada. Os estudos clínicos que testam o uso de metformina em pacientes com PDAC estão actualmente em curso (por exemplo, NCT01210911, NCT01167738 e NCT01488552). Mecanicamente, descobrimos que a metformina induz a uma crise energética fatal em CSCs, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e reduzir a potencial transmembrana mitocondrial. Em contraste, não-CSCs não foram eliminadas pelo tratamento com metformina, mas reversível foram submetidos a paragem do ciclo celular. Portanto, nosso estudo serve como um exemplo de sucesso para o potencial de formação in vitro esfera como ferramenta de triagem para identificar compostos que potencialmente alvo CSCs, mas esta técnica exige ainda mais in vitro e in vivo de validação para eliminar falsos descobertas.

Metformina seletivamente alvos CSCs do pâncreas O primeiro analisou os efeitos funcionais do tratamento com metformina sobre a capacidade in vitro de auto-renovação de CSCs. Para esta finalidade, foi realizada utilizando ensaios de formação de esfera células pancreáticas humanas primárias cancerosas isoladas a partir de tecidos durante a cirurgia de ressecção PDAC. Observou-se que a metformina diminuiu fortemente o tamanho das esferas formadas (Figura 1A). Este foi provavelmente através da inibição da expansão de progênies de CSC, que ainda representam a maior parte das células encontradas em esferas como eles só são enriquecidos para CSCs. Com efeito, as esferas mais longos são cultivadas sem passagem das mais extensa a expansão de progênies mais diferenciadas será. Assim, descobrimos metformina para diminuir significativamente o número de esferas, na verdade, formadas independentemente do seu tamanho, ocorrendo de uma maneira dependente da dose o que sugere uma forte inibição da capacidade de auto-renovação de CSCs (dados não mostrados). Descobrimos que a metformina a 3 mm diminuiu significativamente o número de esferas formadas (Figura 1B). A fim de estudar mais rigorosamente os efeitos a longo prazo da metformina sobre a capacidade de auto-renovação das CSCs, que subsequentemente passadas as primeiras esferas formadas em esferas secundárias e terciárias. Apesar de apenas esferas primárias foram tratados com metformina, a formação de esferas na segunda e terceira passagens foi drasticamente e cada vez mais reduzida, o que implica o tratamento com metformina tinha efectivamente eliminado irreversivelmente a maioria das CSCs (Figura 1C). Assim, os nossos dados mostraram efeitos de tratamento significativos da metformina sobre a capacidade de auto-renovação das CSCs pancreáticos primários e, portanto, encorajou-nos a realizar mais mecanicista, bem como estudos in vivo. Metformina Inibe mitocondrial consumo de oxigênio e induz a produção de ROS Desde metformin foi mostrado que actua como um veneno mitocondrial por inibição da actividade do complexo I parcialmente, ao lado que examinou os efeitos agudos da metformina sobre o consumo de oxigénio celular em células derivadas de esfera. Para este propósito, seleccionámos duas células derivadas de tumores primários PDAC representativos e medido o consumo de oxigénio ao longo do tempo a seguir à injecção sequencial de 3 mM de metformina (três injecções) e 1 pM com rotenona (uma injecção). Como mostrado na Figura 2A, a injecção metformina induziu uma diminuição rápida e dependente da dose no consumo de oxigénio, a qual variou consideravelmente entre os diferentes tumores. Calculou-se a actividade mitocondrial residual mediante tratamento com metformina por injecção de rotenona, um complexo inibidor potente I, o qual é capaz de inibir completamente o consumo de oxigénio mitocondrial. Sensibilidade à metformina em termos de consumo de oxigénio mitocondrial correlacionada com a sua capacidade para induzir a produção de ROS definido como um deslocamento da média da popumento após o tratamento com metformina (Figura 2B, painel da esquerda), que pode ser facilmente quantificada (Figura 2B, painel da direita). Como esperado, as células primárias que foram mais sensíveis à inibição do consumo de oxigénio também mostrou o maior aumento na produção de ROS mediante o tratamento com metformina. Assim, estes metabólicas experimentos in vitro demonstram que as metas de metformina CSCs inibindo sua dependência na função mitocondrial, resultando em um aumento subsequente na produção de ROS mitocondrial e, eventualmente, indução de apoptose. Metformina Plateia PDAC Progressão In Vivo Finalmente estudaram os efeitos da metformina in vivo utilizando xenoenxertos de tecidos derivados de doentes com diferentes PDAC. Observou-se uma redução significativa na progressão do tumor para os ratinhos tratados com metformina, em comparação com o grupo de controlo, mas os tumores não completamente DISAppeared (Figura 3). Posteriormente, durante o seguimento a longo prazo todos os tumores eventualmente recaída sugerindo resistência metformina de células sobreviventes a fase inicial do tratamento. No entanto, o tratamento com metformina, mesmo quando aplicada como único agente, prolongou significativamente a sobrevivência em todos os ratos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig1.jpg" /> Figura 1. A metformina seletivamente Alvos da CSCs. (A) A metformina diminuiu o tamanho das esferas. Imagens representativas de esferas obtidas após o tratamento com as doses indicadas de metformina para 7 dias (painel da direita). Quantificação de tamanho esfera (n≥6) (painel esquerdo), os números indicados no eixo das abscissas representar tumor individual. (B) A capacidade de formação de esfera na presença ou ausência de metformina durante 7 dias (n≥6), os números indicados em abcissaseixo representar tumor individual. (C) gráfico Representante da CSC capacidade de auto-renovação em esferas secundárias e terciárias de células de câncer pancreático primários. As esferas foram apenas tratados durante a formação esfera primeira geração para um total de 7 dias (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig2.jpg" /> Figura 2. O tratamento com metformina inibe consumo de oxigênio e induz a produção de ROS. (A) além de metformina inibe o consumo de oxigênio (OCR) de células derivadas de esfera. Duas esferas secundárias PDAC diferentes foram tratados com metformina e mudanças de OCR foram medidos por análise de fluxo extracelular. Rotenona injecção foi utilizado como um controlo para o consumo total de OCR mitocondrial.Eixo dos X representa a taxa de consumo de oxigénio em pmol de oxigénio / hora normalizados pelo teor de proteína em cada poço. esferas (B) PDAC utilizados em A, foram tratados durante 8 h com a metformina e a produção de ROS foi determinada por citometria de fluxo utilizando-carboxi DCFDA. À esquerda, o fluxo representante citometria parcelas. Certo, resumo dos dados de três experiências independentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52801/52801fig3.jpg" /> Figura 3. A metformina Plateia PDAC Progressão In Vivo. Dois diferentes tecidos de xenotransplante PDAC foram implantadas em ratinhos imunocomprometidos e tratamento foi alocado depois foi verificado take tumor inicial. Os ratinhos foram tratados com metformina (MET) é adicionada à água potável (150 mg / kg de corpo weilutar; com base em 5 ml de consumo de água por dia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52801/52801fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K visualizações.  Spanish National Cancer Research Center. Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

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Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Transplante de Células-tronco Estratégias para a Restauração da disfunção cognitiva causada pela radioterapia craniana

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Medicina

Evaluation of Cancer Stem Cell Migration Using Compartmentalizing Microfluidic Devices and Live Cell Imaging

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major obstacle for improving patient outcomes is the poor understanding of mechanisms underlying cellular migration associated with aggressive cancer cell invasion, metastasis and therapeutic resistance1. Glioblastoma Multiforme (GBM), the most prevalent primary malignant adult brain tumor2, exemplifies this difficulty. Despite standard surgery, radiation and chemotherapies, patient median survival is only fifteen months, due to aggressive GBM infiltration into adjacent brain and rapid cancer recurrence2. The interactions of aberrant cell migratory mechanisms and the tumor microenvironment likely differentiate cancer from normal cells3. Therefore, improving therapeutic approaches for GBM require a better understanding of cancer cell migration mechanisms. Recent work suggests that a small subpopulation of cells within GBM, the brain tumor stem cell (BTSC), may be responsible for therapeutic resistance and recurrence. Mechanisms underlying BTSC migratory capacity are only starting to be characterized1,4.
Due to a limitation in visual inspection and geometrical manipulation, conventional migration assays5 are restricted to quantifying overall cell populations. In contrast, microfluidic devices permit single cell analysis because of compatibility with modern microscopy and control over micro-environment6-9.
We present a method for detailed characterization of BTSC migration using compartmentalizing microfluidic devices. These PDMS-made devices cast the tissue culture environment into three connected compartments: seeding chamber, receiving chamber and bridging microchannels. We tailored the device such that both chambers hold sufficient media to support viable BTSC for 4-5 days without media exchange. Highly mobile BTSCs initially introduced into the seeding chamber are isolated after migration though bridging microchannels to the parallel receiving chamber. This migration simulates cancer cellular spread through the interstitial spaces of the brain. The phase live images of cell morphology during migration are recorded over several days. Highly migratory BTSC can therefore be isolated, recultured, and analyzed further. 
Compartmentalizing microfluidics can be a versatile platform to study the migratory behavior of BTSCs and other cancer stem cells. By combining gradient generators, fluid handling, micro-electrodes and other microfluidic modules, these devices can also be used for drug screening and disease diagnosis6. Isolation of an aggressive subpopulation of migratory cells will enable studies of underlying molecular mechanisms.

A compartmentalizing microfluidic device for investigating cancer stem cell migration is described. This novel platform creates a viable cellular microenvironment and enables microscopic visualization of live cell locomotion. Highly motile cancer cells are isolated to study molecular mechanisms of aggressive infiltration, potentially leading to more effective future therapies.

Avaliação do Câncer de Migração Stem Cell Usando compartimentar dispositivos microfluídicos e imagens de células vivas

In the last 40 years, the United States invested over 200 billion dollars on cancer research, resulting in only a 5% decrease in death rate. A major ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Processamento de tecido primário do tumor cerebral para Ensaios de Células Tronco e Fluxo de Classificando

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Modelo ortotópico bioluminescente de progressão do câncer de pâncreas

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

Enriquecimento para resistente à quimioterapia do cancro do ovário células-tronco de linhas de células humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput caracterização de células-tronco adultas modificadas para liberação de fatores terapêuticos como estratégia de neuroproteção

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local recurrence and distant metastasis. One hypothesis to explain this recurrence is the presence of cancer stem-like cells (CSCs) that present inherent chemo- and radio-resistance. In order to develop new therapeutic strategies, it is necessary to have experimental models that validate the effectiveness of targeted treatments and therefore to have reliable methods for the identification and isolation of CSCs. To this end, we present a protocol for the isolation of CSCs from human HNSCC cell lines that relies on the combination of two successive cell sortings performed by fluorescence activated cell sorting (FACS). The first one is based on the property of CSCs to overexpress ATP-Binding Cassette (ABC) transporter proteins and thus exclude, among others, vital DNA dyes such as Hoechst 33342. The cells sorted with this method are identified as a &#34;side population&#34; (SP). As the SP cells represent a low percentage (&#60;5%) of parental cells, a growing phase is necessary in order to increase their number before the second cell sorting. The next step allows for the selection of cells that possess two other HNSCC stem cell characteristics i.e. high expression level of the cell surface marker CD44 (CD44high) and the over-expression of aldehyde dehydrogenase (ALDHhigh). Since the use of a single marker has numerous limitations and pitfalls for the isolation of CSCs, the combination of SP, CD44 and ALDH markers will provide a useful tool to isolate CSCs for further analytical and functional assays requiring viable cells. The stem-like characteristics of CSCs was finally validated in vitro by the formation of tumorispheres and the expression of &#946;-catenin.

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

Radiation Treatment of Organotypic Cultures from Submandibular and Parotid Salivary Glands Models Key In Vivo Characteristics

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with radiotherapy. Experimental approaches to understanding mechanisms of salivary gland dysfunction and restoration have focused on in vivo models, which are handicapped by an inability to systematically screen therapeutic candidates and efficiencies in transfection capability to manipulate specific genes. The purpose of this salivary gland organotypic culture protocol is to evaluate maximal time of culture viability and characterize cellular changes following ex vivo radiation treatment. We utilized immunofluorescent staining and confocal microscopy to determine when specific cell populations and markers are present during a 30-day culture period. In addition, cellular markers previously reported in in vivo radiation models are evaluated in cultures that are irradiated ex vivo. Moving forward, this method is an attractive platform for rapid ex vivo assessment of murine and human salivary gland tissue responses to therapeutic agents that improve salivary function.

Using three-dimensional organotypic cultures to visualize morphology and functional markers of salivary glands may provide novel insights into the mechanisms of tissue damage following radiation. Described here is a protocol to section, culture, irradiate, stain, and image 50&#8211;90 &#956;m thick salivary gland sections prior to and following exposure to ionizing radiation.

Tratamento de radiação de culturas organotypic de glândulas salivares submandibulares e parótidas modelos chave in vivo características

Hyposalivation and xerostomia create chronic oral complications that decrease the quality of life in head and neck cancer patients who are treated with ...