Agradecemos Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann e Walker Jackson para a leitura atenta do manuscrito. Os autores receberam financiamento que foi fornecido pelo Ministério da pesquisa MIWF do estado Renânia do Norte-Westfalia (SR), o BMBF-Projekträger DLR colaboração EUA-alemão em neurociência computacional (CRCNS; SR), Centros de Excelência em Doenças Neurodegenerativas (COEN; SR), e da Universidade de Bonn programa de financiamento intramural (BONFOR; SR).

1. Requisitos do Sistema <ol><li> Sistema de microscópio: boa visualização do dendrito é crucial. Se possível, use um sistema de microscópio de varredura a laser de dois fótons. Em nossos experimentos utilizamos um Scope TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, Alemanha ou um sistema de Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin equipado com um Ti: Safira ultra-pulsada do laser (Chameleon Ultra II, Coherent) e um objetivo de alto NA (60X, 0,9 NA, Olympus) para visualizar os dendritos que tinham enchido com um corante fluorescente através da pipeta patch. Embora foto-dano é pensado para ser menos intensa utilizando a digitalização em 2 de fotões, reduzir a potência do laser (abaixo de 8 MW no tecido) e os tempos de temporização (inferior a 1 ms), ou tanto quanto possível. </li><li> Uma segunda possibilidade é a de desencadear uma fonte de luz de fluorescência de campo amplo (diodo emissor de luz ou uma lâmpada fluorescente) em sincronia com a aquisição de reduzir o tempo de exposição tanto quanto possível. Temos usado um monocromador com uma fonte de luz integrada (TILLPhotônicos, Grafelfing, Alemanha) em uma Zeiss Axioskop 2 FS microscópio vertical que foi equipado com iluminação infravermelha Dodt contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Alemanha). Em nossos experimentos tempos de exposição variaram de normalmente 10 ms máx. 30 ms. </li><li> Usar um amplificador de micro-iontoforese rápido, por exemplo, um micro-sistema de iontoforese dois canais MVCS-C-02 (NPI electrónico, Tamm, Alemanha), com a compensação de capacitância rápido. Os microeléctrodos de iontoforese de ponta fina têm resistências de 25-100 mohms (crucialmente, dependendo do tamanho e da forma da ponta de pipeta), e tempos de subida rápida só pode ser alcançada se a compensação de capacitância do amplificador iontoforético está sintonizado de maneira óptima. Esta compensação rápida é necessária para aplicar os impulsos de corrente com um rápido início e curta na gama de sub-milisegundo para a pipeta iontoforético e, assim, para ejectar o transmissor com uma elevada resolução espacial no local tamanhos inferiores a 1 mícron 13. Amplificadores de iontoforese são alassim disponível a partir de várias outras empresas, que não têm testado em nosso laboratório. Estes dispositivos são de nosso conhecimento não equipada com circuito de compensação de capacitância. </li></ol> 2. Preparar soluções <ol><li> Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) e solução interna, uma vez que é necessário para o projeto experimental. A única adição à solução interna, que é necessário, é um corante fluorescente vermelho ou verde (por exemplo, 50 a 200 fiM Alexa Fluor 488 ou 594 hidrazida, Invitrogen), dependendo do equipamento óptico. Aqui, um exemplo para ACSF sacarose, que pode ser utilizada para dissecação, em mM: NaCl 60, ​​100 de sacarose, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO 3 26, CaCl 2 1, 5 MgCl 2, 20 de glicose, e para ACSF normais solução para as experiências de patch-clamp em mM: 125 de NaCl, 3 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 de MgCl2, 15 de glicose. </li><li>Carbogenize (95% O2, 5% de CO 2) todas as soluções extracelulares constantemente. </li><li> Preparar solução interna, por exemplo, em mM: 140 de K-gluconato, 7 KCl, HEPES 5-ácido, 0,5 MgCl2, 5 fosfocreatina, 0,16 EGTA, com 50-200 uM Alexa 488. </li><li> Para micro-glutamato iontoforese preparar uma solução com ácido glutâmico 150 mM e ajustar o pH para 7,0 com NaOH. Adicionar 50 -200 mM Alexa Fluor 488 ou 594 hidrazida (Invitrogen) para visualização. </li><li> Para iontoforese do GABA preparar uma solução 1 M de GABA e ajustar o pH a 5 com HCl 15. A este pH o GABA está carregada, então só pode ser aplicado utilizando a iontoforese. Por favor, note que o baixo pH da solução ejetado para o espaço extracelular pode efetuar-se a transmissão GABA 16,17. Proteger a solução da luz GABA e freqüentemente preparar nova solução estoque GABA, uma vez que uma solução mais velhos podem perder a sua eficácia. </li><li> Se é difícil ver os eventos GABAérgicos, aparelhagem hiGH Cl - solução interna força motriz, por exemplo, por deixar de fora de KCl, pode ajudar a visualizar os eventos GABAérgicos para ver se a iontoforese GABA está a trabalhar, no entanto para investigar integração sináptica uma força motriz fisiológico pode ser recomendada. Para a detecção geral de pequenos eventos GABAérgicos, um protocolo mostrado na Figura 8C pode ajudar. </li></ol> 3. Puxe e testar as Pipettes Iontoforese <ol><li> Em geral, puxando as pipetas certas é talvez o passo mais importante para conseguir iontoforese neurotransmissor controlada. Quando se utiliza a iontoforese em cultura de células, é possível puxar eléctrodos muito finos semelhantes a microeléctrodos afiados 10. Em experimentos de patch-clamp em fatias agudas, no entanto, estas pipetas muito finas sobre a superfície curva da fatia quando eles são reduzidos no tecido com um ângulo, o que torna impossível atingir dendritos mais profundas. </li><li> Portanto, puxe uma pipeta com uma ponta muito pequena, de modo que nenhum neurotransmitter pode vazar, mas a ponta tem de ser ainda suficientemente rígidos para penetrar no tecido (Figura 2). Por exemplo, use 150 GB F 8P pipetas classe (Science Products, Hofheim, Alemanha) e um puxador horizontal (por exemplo, um extrator DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, na Alemanha, ou um extrator P-97, Sutter Instrument Company , Novato, CA), com várias etapas, puxando para alcançar uma abertura pequena, mas também a uma curta recolector com um ângulo agudo (Figura 2 e Tabela 2). </li><li> Também é possível a utilização de pipetas de vidro de quartzo para puxar pipetas iontoforéticos 10. Estes são suposto ter melhores propriedades mecânicas e ser mais confiável, no entanto puxadores de laser especiais são necessários. Mas também é possível obter bons resultados com pipetas de vidro normais, os quais são normalmente utilizados para puxar pipetas remendo. </li><li> Teste o desempenho da pipeta e resistência em uma câmara sem tecido, antes de usá-los pela primeiratempo, uma vez que fugas de glutamato pode danificar os tecidos. </li><li> Configure o amplificador iontoforese corretamente. Em seguida, preencha a pipeta com o neurotransmissor e solução contendo corante e colocá-lo no banho (ACSF). </li><li> Compensar a capacitância (Figura 3). Normalmente pipetas muito afiada terá uma capacidade maior do que os contundentes. </li><li> Verificar a resistência da pipeta: O amplificador de micro-iontoforese usado aqui tem uma construção em característica para a medição da resistência da pipeta. Ela evoca breves pulsos de teste rectangulares, que podem ser monitorizados com um osciloscópio padrão ou uma placa de A / D ligado a um computador com o software de aquisição. Dependendo da forma e do tamanho do bico, a ponta deve ter uma resistência de entre 25-90 mohms. </li><li> Concentre-se na ponta com uma objetiva de imersão em água ou 60X 40X e mudar a imagem fluorescente e, se possível, zoom in Se os vazamentos de corante fluorescente para fora da ponteira, aplique uma pequena positivo (no caso da gluTamate) ou negativo (no caso de GABA, Figura 4) reter corrente (&lt;0,02 mA). Se isso não ajudar a cancelar o vazamento, mudar a pipeta. </li><li> Aplicar uma forte corrente passo ou utilizar o disparador manual e monitorar a ponta na imagem de fluorescência para verificar se a solução pode ser ejectado para fora da pipeta. Como mencionado acima, a polaridade do impulso de corrente é, dependendo da carga da molécula que é suposto ser ejectado. Para ejectar o glutamato é uma corrente negativa e para o GABA uma corrente positiva (Figura 4). </li><li> Bolhas de ar na pipeta que o bloco de ejeção de tinta e transmissor, pode ser apuradas através da aplicação de uma alta corrente de ejeção várias vezes. </li><li> Tomados em conjunto, se não houver nenhum vazamento visível e ejecção teste foi bem sucedido, a capacitância de compensação e iniciar a experiência. </li><li> Cuidado: Uma vez que a compensação de capacitância é conseguido através de um circuito de realimentação, este circuito pode ultrapassar ou oscilar, se for overcompensated. Com cuidado, use a configuração de discagem para a compensação de capacitância. </li><li> Dependendo da estabilidade puxador é por vezes necessário para ajustar as definições puxador ao longo do tempo, uma vez que o filamento pode ter mudado propriedades. No entanto, uma vez que, se uma boa pipeta é concebido, que pode ser usado para vários dias. Portanto, depois de terminada a experiência armazenar a pipeta iontoforético em um recipiente fechado, sem danificar a ponta. </li><li> Para a próxima experimento encher a pipeta com a solução de neurotransmissor, aplicar vários pulsos ejetar fortes para limpar a ponta e, em seguida, verificar se as propriedades (por exemplo, resistência) mudança significativa. Em seguida, compensar a capacitância e usar novamente a pipeta. Não use uma única pipeta com soluções diferentes neurotransmissores. </li></ol> 4. Prepare as fatias de cérebro <ol><li> Se micro-iontoforese é usado pela primeira vez definitivamente preparar as fatias após o estabelecimento de um programa de trabalho do extrator de forma fiável. </li> &lt;procedimentos li&gt; Perform anestesia e decapitação, em conformidade com as diretrizes de cuidados de animais da sua instituição ou autoridade local. </li><li> Após a remoção do cérebro, transferi-lo para ACSF gelado de sacarose (ver protocolo 2.1). </li><li> Cortar a região de interesse em fatias de espessura adequada (por exemplo, 300 mm). </li><li> Incubar as fatias em ACSF sacarose a 35 ° C durante 30 min. Em seguida, transferi-los para uma câmara de retenção submersa contendo ACSF normal, à temperatura ambiente. </li><li> Durante a preparação e a experiência carbogenize ACSF em torno das fatias com 95% de O2, 5% de CO 2. </li></ol> 5. Estabelecer uma gravação de célula inteira <ol><li> Posicionar a pipeta iontoforese (s) já perto da superfície fatia antes de remendar uma célula, a fim de evitar o posicionamento de longa duração, após o que estabelece o modo de célula inteira. </li><li> Puxe uma baixa resistência remendo pipeta (3-5 mohms), preenchê-lo com o dYE contendo solução interna e aplicar a pressão positiva para a pipeta (30 - 60 mbar). </li><li> Entre no banho e abordagem da célula sob a orientação visual (contraste Dodt infravermelho ou dois contraste da imagem gradiente fóton). </li><li> Monitorar a resistência da pipeta com um pulso de teste (por exemplo, -10 mV, 20 ms) no modo de fixação de tensão. Ao tocar no tecido corrigir o potencial de deslocamento. </li><li> Aproxime-se do celular e empurre a ponta da pipeta até uma &quot;covinha&quot; pode ser visto claramente. Imediatamente após a libertação de pressão da pipeta, aplicam-se 40 - 60 mbar de pressão negativa e mudar o potencial da membrana a -65 mV. </li><li> Quando a corrente de retenção atinge valores abaixo de 100 pA, solte a pressão negativa. </li><li> Depois de estabelecer um selo giga (resistência&gt; 1 GÊ), ruptura da membrana com um curto, forte sucção da pipeta ou breve sobrecompensação do circuito de compensação de capacitância. </li><li> Dependendo do modo (fixador de tensão ou corrente) é necessáriapara o projeto experimental, compensar de forma adequada. </li><li> Iniciar a trazer a pipeta iontoforético para a sua posição final. Se uma descrição mais detalhada de como executar com sucesso as gravações patch clamp é necessário, existem vários excelentes diretrizes disponíveis 18,19. </li></ol> 6. Coloque o Pipeta iontoforético e gerar um potencial iontoforético Postsynaptic <ol><li> Em geral, os eventos podem ser evocados iontoforéticos em locais definidos, dependendo da experiência desejada, por exemplo, a uma dendrite espinhoso para glutamato de micro-iontoforese, no eixo dendrítica, soma ou segmento inicial do axónio para o GABA micro-iontoforese. </li><li> Aproxime-se da célula-se a cerca de 1 mM distância, sem tocá-lo. Depois de atingir a posição de interesse, é fundamental que não neurotransmissor está vazando e que a capacitância pipeta é compensado corretamente. </li><li> Se se aproximar da célula com uma pipeta cheia glutamato iontoforéticoe provoca a despolarização detectável do potencial de membrana, ajustar a actual se possível manter ou mudar a pipeta. </li><li> Aplicar negativos curtos impulsos de corrente, a partir de zero e aumentar a corrente sistematicamente (por exemplo, 0,1-0,4 ms, 0,01-1 uA pulsos). Isso ajuda a descobrir em qual faixa o atual iontophoretic evoca as respostas desejadas no experimental específico set-up. </li><li> Se não houver resposta detectável, levante a pipeta várias centenas de micrómetros e aplicar uma forte corrente de ejecção (&gt; 0,1 mA) para limpar a ponta. Ajuste a compensação de capacitância, a abordagem da célula, e tente novamente. </li><li> Se ainda não houver resposta, reduzir a corrente de reter. Tenha muito cuidado com as configurações de discagem uma vez que este procedimento pode causar a liberação do neurotransmissor descontrolada. Portanto, monitorar constantemente a gravação para detectar respectivas alterações no potencial de membrana. </li><li> Se é difícil detectar eventos GABAérgicos, pode ser útil usar umn composição da solução interna rendendo em um alto Cl - força motriz. Para alcançar este objectivo, reduzir o Cl - concentração da solução de pipeta (ver secção protocolo 2.6.). Isto irá resultar em acontecimentos GABAérgicos maiores em potencial de membrana em repouso, devido a uma força motriz superior. </li><li> Em alternativa, injecta-se etapas correntes longas, resultando em membranas possibilidades potenciais de -100 mV a -48 mV (Figura 8C). Com este protocolo o Cl - força motriz é aumentada em potenciais hiperpolarizados causando uma resposta GABA despolarização. </li><li> Também é possível utilizar o protocolo de injecção de corrente passo para determinar o potencial dos acontecimentos evocados, o que ajuda a determinar a natureza dos eventos GABAérgica reversão. Vazamento de GABA é mais difícil de detectar do que o vazamento de glutamato. Neste caso, um controlo constante da resistência de entrada pode ajudar, quando a pipeta cheia GABA é abordado. Se a resistência de entrada diminui, a corrente pode reter be aumento ou uma pipeta diferente deve ser usado. </li><li> Como experiências de controlo para iontoforese glutamato, sugerimos a 2 + experimento de imagem de Ca, usando 200 uM OGB-1 e não na solução de EGTA a pipeta para visualizar o influxo de cálcio local que pode ser causada por vazamento de glutamato. </li><li> Em geral, para conseguir uma resposta estável, é muito importante ter uma pipeta mecanicamente estável para evitar desvios ao longo do tempo. Tração pode ser causada por alterações da temperatura, por conseguinte, recomenda-se ligar o equipamento, pelo menos, meia hora antes das medições para evitar desvio térmico. Não se esqueça de usar bons selos de cartucho no suporte da pipeta ea dica é realmente fixo. O suporte propriamente dito pode ser adicionalmente fixado com fita de Teflon, além disso, ter a certeza de que não há tensão nos cabos do headstage ou manipulador, que é também uma fonte potencial de deriva. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui vamos explicar como aplicar rápida micro-iontoforese de neurotransmissores para investigar a integração sináptica em dendritos. Esta técnica tem sido utilizada com êxito para estudar a transmissão sináptica glutamatérgica e GABAérgicos em diferentes regiões do cérebro, in vitro e in vivo, 9,20-22. Micro-iontoforese tem sido usada há mais de 60 anos, mas nos primeiros anos era usado principalmente para se candidatar localmente neurotransmissores e drogas em escalas de tempo ...

Os neurónios no sistema nervoso central receber uma variedade de entradas sinápticas em seus processos dendríticos finas e ramificadas 1. Ali, a maioria das entradas dendríticas excitatórios são mediadas por sinapses glutamatérgicas. Estes sinapses pode ser activado de um modo espacialmente distribuídos, resultando na integração linear pós-sináptico excitatório de potenciais pós-sinápticos (EPSPS). Se as sinapses são activados simultaneamente e em proximidade espacial do dendrito, estas entradas excitatórias podem ser integrados supra-linearmente e gerar picos dendrítica 2-5. Além disso, a integração das entradas excitatórios depende da localização da entrada na árvore dendrítica. Os sinais que chegam à região tufo distal são muito mais atenuada do que entradas proximais, devido ao cabo de filtragem 6. No hipocampo, entradas distantes para os dendritos apicais de tufos são geradas por uma região do cérebro diferentes do que aqueles em proximal dendrites 7. Uma pergunta interessante é, portanto, como a entrada sináptica é processado por diferentes compartimentos dendríticas e se a integração dendrítica regula a influência desses insumos em camadas sobre a ativação neuronal em diferentes maneiras. Não só as propriedades funcionais, as características morfológicas da dendrite, a localização ea aglomeração das entradas estão a afectar a integração dendrítica de entradas excitatórios, também as entradas inibidores adicionais de terminais GABAérgicos crucial determinar a eficácia das sinapses glutamatérgicas 8,9. Estes diferentes aspectos da integração sináptica pode ser idealmente investigada utilizando neurotransmissor micro-iontoforese, o que permite a aplicação espacialmente definido de diferentes neurotransmissores para domínios dendríticas. Nós demonstramos aqui como estabelecer com sucesso micro-iontoforese de glutamato e GABA para investigar integração de sinal em neurónios. Para esta aplicação, de ponta finapipetas cheias de alta resistência, com soluções concentradas de neurotransmissores são utilizados. Estas pipetas estão posicionadas perto da membrana exterior da célula, onde os receptores de neurotransmissores estão localizados. É necessária uma boa visualização das ramificações dendríticas. Este é melhor conseguido usando corantes fluorescentes, que são introduzidos através da pipeta patch. Em seguida, um muito curto (&lt;1 ms) impulso de corrente (no intervalo de 10 - 100 nA) é usado para ejectar as moléculas carregadas neurotransmissores. Com estes pulsos curtos e compensação da capacitância efectiva, potenciais pós-sinápticos ou as correntes podem ser evocados com alta precisão espacial e temporal, o que significa que a localização da entrada excitatória é precisamente conhecida. O glutamato de micro-iontoforese pode activar sinapses em um raio definido, que é menor do que 6 um, como mostrado (Figura 1 9), mas também é possível chegar a resolução sinapse único 10-12. Heine, M., et ai </em&gt; mostraram que a resolução espacial dos micro-iontoforese rápido pode mesmo ser ajustado para detectar tamanhos abaixo de 0,5 um, o que é mais pequeno do que o local tamanhos obtidos regularmente com uncaging dois fotões do glutamato 13. Com micro-iontoforese rápido é facilmente possível usar dois ou mais pipetas iontoforéticos e colocá-los em locais diferentes, mesmo distantes na árvore dendrítica. Deste modo, a integração de eventos excitatórios, incluindo aqueles a partir de diferentes vias, pode ser investigada. Também é possível utilizar um glutamato e uma pipeta cheia iontoforético GABA ao mesmo tempo. Deste modo, o efeito da inibição GABAérgica em locais diferentes em relação à entrada de excitação (no caminho, a inibição fora do caminho) pode ser estudada. Além disso, o impacto da inibição por interneurónios objectivo domínios neuronais específicos, como os dendritos distais, soma ou axónios 14, pode ser investigado utilizando iontoforese GABA. Em neurônios cultivados, micro-iontoforese rápida oferece a oportunidade de investigate distribuição sinapse único e os aspectos elementares da comunicação sináptica em neurônios em muito mais detalhe 10,11. Neste artigo, demonstram em pormenor a forma de estabelecer iontoforese glutamato e GABA para uso em fatias cerebrais agudas, que permite a investigação de integração sináptica de entradas excitatórios e inibitórios na dependência da localização de entrada, as forças de entrada e de temporização, sozinho ou em interacção. Vamos apontar as vantagens e limitações dessa técnica e como solucionar problemas com sucesso.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

Um dos interesses fundamentais da neurociência é compreender a integração dos insumos excitatórios e inibitórios ao longo da estrutura muito complexa da árvore dendrítica, que eventualmente leva à produção neuronal de potenciais de ação no axônio. A influência de diversos parâmetros espaciais e temporais da entrada sináptica específica na saída neuronal está atualmente sob investigação, por exemplo, a atenuação dependente da distância das entradas dendríticas, a interação local-dependente de insumos espacialmente segregadas, a influência da inibição GABAergig na integração excitatório, linear e modos de integração não-lineares, e muitos mais. Com o rápido micro-iontoforese de glutamato e GABA é possível investigar precisamente a integração temporal e espacial da excitação glutamatérgica e inibição GABAérgica. Requisitos técnicos críticos são ou uma lâmpada fluorescente triggered, diodo emissor de luz (LED), ou dois fótons scanning microscópio para visualizar ramificações dendríticas sem introduzir significativa da foto-dano do tecido. Além disso, é muito importante ter um amplificador de micro-iontoforese que permite a compensação de capacitância rápido de pipetas de alta resistência. Outro ponto crucial é que nenhum transmissor é involuntariamente divulgado pela pipeta durante o experimento. Uma vez estabelecida, esta técnica vai fazer sinais fiáveis ​​e reproduzíveis com um elevado neurotransmissor e especificidade de localização. Comparado ao glutamato e GABA uncaging, iontoforese rápida permite a utilização de ambos os transmissores, ao mesmo tempo mas em locais distantes, sem limitação para o campo de visão. Há também vantagens em comparação à estimulação elétrica focal de axônios: com micro-iontoforese a localização do local de entrada é definitivamente conhecido e é certo que só o neurotransmissor de interesse é liberada. No entanto, tem de ser considerado que, com micro-iontoforese apenas opostsynapse é ativado e os aspectos pré-sinápticos de liberação de neurotransmissores não são resolvidos. Neste artigo, vamos demonstrar como configurar o micro-iontoforese em experimentos fatia do cérebro.

Uma abordagem simples para determinar a distribuição espacial da iontoforese é para retrair a pipeta iontoforético gradual do dendrito, mantendo constante o glutamato ejectado. Descobrimos que a extensão espacial de um micro-estimulação iontoforético tinha um diâmetro de cerca de 12 mM (Figura 1, que mostra o raio). Como profundamente no tecido a iontoforese pode ser utilizada dependerá da rigidez da pipeta. No entanto, as pipetas iontoforéticos necessários para as experiências em fatias <s...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Neste artigo, apresentamos rápido micro-iontoforese de neurotransmissores como uma técnica para investigar a integração de sinais de pós-sinápticos com alta precisão espacial e temporal.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K visualizações.  University of Bonn. Neste artigo, apresentamos rápido micro-iontoforese de neurotransmissores como uma técnica para investigar a integração de sinais de pós-sinápticos com alta precisão espacial e temporal.

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-loading: Uma ferramenta útil para examinar a extensão da Gap Coupling Tracer junção entre neurônios da retina

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Neurociência

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI Simulator CyberMotion: Implementação de um simulador de movimento Novela Caminho para Investigar Integração multisensorial em Três Dimensões

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

A indução de um Estado Isoeléctrico cérebro para investigar o impacto da endógena Synaptic Activity na excitabilidade neuronal<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...