Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Alemã de Ciência (DFG, Ro2327 / 6-1) para CRR Os autores gostariam de agradecer a S. Durry e C. Rodrigo para assistência técnica especializada, e M. Dubbert (Laboratório de Eletrônica, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia, Alemanha) para obter ajuda na implementação do controlador de célula Pockels eo interruptor HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. 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Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. 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Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes. Os autores receberam apoio financeiro permitindo Open Publication Acesso por Rapp optoeletrônicos (Wedel, Alemanha), que produz um instrumento usado no artigo de vídeo. A empresa não foi nem envolvidos nos experimentos, nem na manipulação de dados, nem na escrita manuscrita.

O presente estudo mostra que SBFI é bem adequado para dois fótons de imagem de transientes de cálcio intracelular em pequenos compartimentos celulares. Tem que se ter em mente, porém, que a eficiência quântica de SBFI é bastante baixo em 15 e relativos alterações na concentração de sódio são muito pequenas com atividade fisiológica. Assim, a medição de alta resolução de transientes de Na + em processos distintos é uma tarefa relativamente tedioso, e criação de faixas ou a média de vários ensaios, pode ser necessário para obter sinais satisfatórios. Além disso, a cinética de transientes de sódio são surpreendentemente lenta, tornando obrigatória a gravar por períodos de tempo prolongados. Esta observação corresponde àqueles em estudos anteriores, onde decaimento monoexponencial de transientes de sódio em dendrites neuronais e em astrócitos foi caracterizado por grandes constantes de tempo de decaimento no intervalo de 10 segundos à temperatura ambiente, 1,2,6. Transientes de sódio, portanto, parecem exercer uma vez co muito mais lentourse e muito maiores constantes de tempo de decaimento, em comparação com transientes de cálcio 16. Separe essas desvantagens, a imagiologia de sódio revela-se uma ferramenta valiosa para a investigação das propriedades fisiológicas de subdomínios neuronais. Por exemplo, a imagiologia de sódio pode servir para acompanhar a actividade sináptica excitatória no ou perto de sinapses activas. Porque não é essencialmente sódio tamponada 8,17, transientes sódio induzido da actividade são linearmente relacionado com uma vasta gama de libertação sináptica de glutamato aplicado exogenamente ou glutamato. Eles, portanto, representam indicadores diretos e imparciais sobre a atividade glutamatérgica neuronal. Além disso, os corantes indicadoras de sódio apresentam uma elevada K d &#39;s (da SBFI K d está na gama de 25 a 1 mM). Mesmo com as concentrações relativamente elevadas de corante intracelulares utilizados para atingir o brilho suficiente (geralmente 0,5-1 mM), a alta K d &#39;s significa que os próprios corantes não actuar como tampões para sódio. Por conseguinte, eles não se distorcem o campo de amplitude nem o tempo de transientes de sódio, o que é sempre uma preocupação quando corantes sensíveis ao cálcio são introduzidos nas células 18. Assim, pode-se presumir que os sinais detectados representam uma boa medida das mudanças &quot;reais&quot; em sódio intracelular. Seu curso lento tempo implica, então, que a velocidade de difusão intracelular de sódio nos neurônios é muito menor do que anteriormente se pensava 19. Um requisito essencial para a execução bem sucedida de experimentos que abordam as propriedades excitatórias transmissão e influxo de sódio vias sinápticas em espinhas e dendritos é a indução de uma ativação rápida e altamente localizada de estruturas pós-sinápticos. Isto pode ser obtido por aplicação rápida e local de glutamato ou agonistas de glutamato na vizinhança directa de uma coluna ou um dendrito pelo fotólise de compostos em gaiolas. Flash fotólise faz dama não mecanicamentege o tecido, é livre de artefatos de movimento e está bem estabelecido para a investigação de questões relacionadas (por exemplo, a sinalização local de cálcio). O diâmetro da mancha de 1,5 um foi uncaging no plano xy. Uncaging perto de um sinal de sódio espinhoso dendrito induzida em ambas as espinhas e a dendrite pai. Considerando que os sinais tendem a ser maior nas espinhas mais próximas ao local uncaging, as amplitudes do dendrito pai e espinhas mais longe ainda eram bastante semelhantes aos imediações do local uncaging. Uncaging foi realizada durante 300 mseg, durante o qual as correntes internas aumento na amplitude. Glutamato Uncaged poderia ter difundido no tecido durante o mesmo período de tempo, ativando os receptores de glutamato ionotrópicos e influxo de sódio em regiões dendríticas e espinhas mais longe do local uncaging. Um problema intrínseco que ocorre quando se utiliza um laser de UV para a fotólise de compostos engaiolados administradas através da solução do banho de célulasé &quot;filtragem interior&quot;. Devido à elevada taxa de absorção da gaiola, a luz UV é atenuada fortemente ao longo do caminho do objectivo para o local de estimulação 20,21. Uma maneira possível de evitar isso é a perfusão local com a gaiola que está restrito apenas ao sítio de estimulação, o qual, além disso, diminui a quantidade de composto necessária para enjaulado um mínimo. Em comparação com uncaging UV a laser de varredura-mediada, quase-infra-vermelho de dois fotões uncaging 22 é espacialmente mais precisa, principalmente porque a exactidão da estimulação é aumentada no eixo z. Por outro lado, devido à pequena secção transversal de gaiolas vulgarmente utilizados para os comprimentos de onda mais longos, como empregues com excitação de dois fotões, ou uma elevada concentração do composto em gaiolas ou muito elevada, são necessárias intensidades de luz potencialmente fototóxicos. Além disso, dois fótons uncaging exige um investimento muito maior no equipamento; entre outros, um laser de IR adicional além dos componentes ópticos, é necessário,. Ambos SBFI e MNI-glutamato são excitáveis ​​na faixa de comprimento de onda idênticas. Isto pode levar a uma indesejada interdependência de laser de UV e uncaging SBFI ou laser imagem IR e MNI-glutamato, o que resulta no branqueamento de SBFI pelo flash uncaging e / ou um uncaging contínua de glutamato por o feixe de luz infravermelha. No entanto, como mostrado na Figura 6C, nem um flash UV, por si só, nem a imagem de vários fótons causado tais efeitos recíprocos, nas condições experimentais. Sistemas de flash de UV semelhantes ao descrito aqui são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios e outros podem ser relativamente facilmente incorporado em qualquer microscópio de imagem multi-fotão existente. Ele oferece a vantagem de que o feixe de laser para fotólise pode ser posicionado livremente no campo de visão. Além disso, o sistema permite um reposicionamento rápido e automático do feixe de laser e o volume de libertação, respectivamente, no campo de visão durante uma experiência. Our modificação simplifica e melhora o posicionamento preciso do local uncaging, de modo a que os quadros do software de imagem pode servir para ajustar quadros de imagem e uncaging congruentemente. Tomados em conjunto, de células inteiras de patch-clamp e imagem multi-fotão de sódio em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging luz UV-induzido de glutamato, permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Pode, assim, servem para analisar as propriedades de transmissão sináptica excitatória e de sinais de sódio em neurónios pós-sinápticos no tecido intacto.

As recentes melhorias nas técnicas de microscopia óptica, como a microscopia multi-fotão têm permitido o estudo de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, estas técnicas são agora amplamente utilizados para analisar os sinais elétricos relacionadas com a atividade dos neurônios, bem como sinais concomitantes de cálcio em pequenos compartimentos subcelulares, ou seja, em dendrites finas e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio em dendritos e espinhas, que possuem propriedades que são largamente inexplorado. Tais sinais podem ser analisados ​​por dois fotões imagiologia de sódio intracelular ([Na +] i) que permite a medição em linha de [Na +] i transitórios durante períodos prolongados sem branqueamento significativo corante ou foto-dano 1,2. Para imagiologia de [Na +] i </sub&gt;, apenas alguns corantes indicador químico estão disponíveis, por exemplo, Corona Verde ou Asante Natrium Verde 3,4. A sonda fluorescente mais usada para Na + imagem é isophthalate benzofuran- (SBFI) de ligação de sódio. É uma medida proporcional, corante UV-animado semelhante ao conhecido corante sensível ao cálcio com fura-2, e tem sido empregada para imagiologia convencional de Na +, em muitos tipos de células (por exemplo, 5,6). Existem diferentes possibilidades de excitar o corante e coleta de sua fluorescência. Se a alta resolução temporal (ou seja, uma taxa de quadros alta de imagem) é necessária em combinação com a informação espacial, SBFI pode ser animado com uma lâmpada xenon arco ou um dispositivo de alta potência diodo emissor de luz (LED) e sua emissão detectada com uma carga de alta velocidade dispositivo -coupled (CCD) 7,8. Para resolução espacial máxima profunda no tecido, microscopia de varredura a laser multi-fotão é o método de escolha 9. A relativamente baixa efficie quantumNCY de SBFI exige concentrações relativamente elevadas de corante (0,5-2 mM), e o carregamento directo de forma a membrana impermeável de SBFI através de um microeléctrodo afiada 10 ou remendo pipeta 1. Usando SBFI, trabalho anterior realizado em fatias de tecido agudas do hipocampo de roedores demonstraram transientes de sódio relacionadas com a actividade em dendritos e espinhas de neurônios piramidais CA1 que são causadas principalmente pelo influxo de sódio através ionotrópico receptores NMDA 1,2. Para o estudo das propriedades de tais sinais de sódio locais em mais detalhe, a activação específica de receptores pós-sinápticos, por aplicação de agonistas do receptor é um método bem adequada de escolha. Para imitar a atividade pré-sináptica e liberação do transmissor, a aplicação deve ser relativamente breve e focada para permitir estimulação local. Isto, no entanto, provou ser um grande desafio em tecido intacto. Aplicação de pressão local de agonistas do receptor utilizando uma pipeta de ponta fina permite ap muito focalcação, mas hospeda o risco potencial para a produção de movimento da estrutura de interesse (por exemplo, como um dendrito ou espinhas dendríticas), e, portanto, impede a imagem de alta resolução. A adequação da iontoforese de substâncias neuro-ativa depende de suas propriedades elétricas e altas amplitudes atuais podem produzir artefatos celulares também. Uma maneira de contornar esses obstáculos é o emprego de compostos fotoativados e sua fotólise. Basicamente, dois princípios diferentes são usados ​​para a foto-ativação de substâncias enjaulados: I) Wide-campo do flash fotólise 11 e II) uncaging focal empregando módulos de digitalização em combinação com lasers 12. Enquanto todo o campo de flash fotólise é utilizada para activar grandes regiões de interesse, por exemplo, uma célula inteira, uncaging focal é utilizado para estimular especificamente pequenos compartimentos celulares. No presente estudo, nós demonstramos um procedimento de célula inteira de patch-clamp e multi-pimagiologia de sódio Hoton em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging induzida por luz UV de glutamato, o que permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Microscopia de fluorescência multi-fotão permitiu a análise de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, é amplamente utilizada para estudar sinais de cálcio relacionadas com a actividade em pequenos compartimentos subcelulares, como dendritos e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio pós-sinápticos, as propriedades dos quais são compreendidos apenas marginalmente. Aqui, nós descrevemos um método para a célula inteira patch-clamp combinado e imagem de sódio multi-fotão em micro domínios celulares de neurônios centrais. Além disso, apresentamos um procedimento modificado de ultra-violeta (UV) uncaging -Light-induzida do glutamato, o que permite a ativação confiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Para este fim, as gravações de célula completa foram realizados em cornu Ammonis subdivisão 1 (CA1) neurónios piramidais em fatias de tecido aguda dahipocampo do rato. Os neurônios foram preenchidos com o corante fluorescente SBFI sensível ao sódio através do patch-pipeta, e multi-fotão excitação de SBFI permitiu a visualização dos dendritos e espinhas adjacentes. Para estabelecer uncaging focal induzida por UV, vários parâmetros, incluindo a intensidade da luz, o volume afectada pelo feixe uncaging UV, o posicionamento do feixe, bem como a concentração do composto testado foram engaiolados e optimizado. Nossos resultados mostram que a perfusão local com glutamato enjaulado (MNI-glutamato) e seu resultado UV-uncaging focal em correntes de entrada e transientes de sódio nos dendritos e espinhas. Curso de tempo e de amplitude dos dois sinais de correntes de entrada e de sódio correlacionar com a duração do impulso de uncaging. Além disso, os nossos resultados mostram que os sinais de cálcio intracelular são bloqueados na presença de agentes bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos, demonstrando que são mediados por influxo de sódio que esta via. Em resumo, o método fornece uma ferramenta fiável para oinvestigação dos sinais de sódio intracelular induzida por activação do receptor focal em tecido cerebral intacto.

No presente estudo, nós demonstramos um método de microscopia multi-fotão de dinâmica de sódio celulares com o corante fluorescente SBFI dependente de sódio em neurónios piramidais CA1 do rato aguda fatias de tecido de hipocampo. Além disso, mostramos como combinar esta técnica de imagem com uncaging baseada no escaneamento a laser de compostos neuro-ativo (por exemplo, o glutamato enjaulado) e seu direcionamento preciso para micro-domínios celulares. Carregando os neurónios com SBFI através da pipeta patch-activada a visualização de toda a célula, incluindo dendrites finas e espinhas adjacentes, empregando múltiplos fotões de excitação (Figura 6A, B, D e figura 7A). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 sinais de sódio e correntes sinápticas induzidas por fotólise de glutamato enjaulado. (A) Maximimagem de projeção al de um neurônio CA1 piramidal carregado com SBFI via pipeta de patch (PP). A caixa indica a área mostrada ampliada em B. LP indica a posição e orientação da pipeta para a perfusão local de glutamato enjaulado. (B) de projecção de alta potência máxima de uma pilha de secções ópticas de uma dendrite com espinhas dendriticas adjacentes. As pilhas de secções ópticas sofreu z-alinhamento e deconvolução. A cruz vermelha indica a região alvo do feixe uncaging. A linha pontilhada laranja delineia a região de interesse a partir do qual a emissão de fluorescência foi registada. A caixa indica a área mostrada ampliada em D. (C) Esquerda: sinal de sódio (linha superior) e somático interior atual (linha inferior) induzida por fotólise de glutamato enjaulado (indicado pelo flash amarelo). A linha vermelha representa um ajuste dos dados experimentais. A área cinzenta representa o período em que o flash uncaging (300ms) obstruiu a imagem de fluorescência SBFI Direito.: Sem pré-perfusão com glutamato enjaulado, o mesmo-flash UV nem provocou uma mudança na emissão SBFI, nem uma corrente para dentro (D) À esquerda:. Imagem de alta potência do dendrito e adjacente espinhas, conforme esboçado na B. Ao lado, a mesma imagem com valores de cinza invertidos. As linhas tracejadas indicam as regiões de interesse, em que a emissão de fluorescência foi registado. A cruz vermelha indica a localização do feixe uncaging direita:. Transientes sódio induzida por fotólise-lampejo de UV de glutamato enjaulado. Traço azul: sinais de sódio no dendrito; traço vermelho: resposta média de três espinhas adjacentes ao local uncaging; traço verde: resposta média de três espinhas distantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a> Após a perfusão local com Cagedglutamato, a aplicação de um flash de UV perto de uma dendrite resultou numa diminuição transitória na emissão de fluorescência de SBFI, reflectindo um aumento na concentração de cálcio intracelular (Figura 6C, D e Figura 7B). Ao mesmo tempo, uma corrente de influxo foi registada a soma (Figura 6C e a Figura 7B). Aumentando a duração do flash de UV resultou no aumento da amplitude de ambos os provocada correntes para dentro e os sinais de sódio (dados não mostrados), indicando que o sistema foi bem dentro da sua gama dinâmica e que as respostas celulares nem uncaging nem estavam saturados. Aplicação de um aparelho de lampejo de UV de duração idêntica ou mais fatias para que não havia sido pré-perfusão com glutamato enjaulado, nunca provocou alterações na fluorescência SBFI nem correntes de entrada, indicando que estes sinais são devido à uncaging de glutamato (Figura 6C). Além disso, estes resultados mostram que nenhum dos componentes interdependência imaging- e observa-se u uncagingnder nossas condições experimentais. Sinais de sódio também pode ser detectado nas espinhas dendríticas (Figura 6D). Enquanto nós não tentou realizar a estimulação de uma única coluna apenas com glutamato uncaging, amplitudes de pico tende a ser um pouco maior em lombadas próximas ao local uncaging, enquanto que as espinhas mais longe mostrou alterações de fluorescência praticamente idênticas às do dendrito pai (Figura 6D). Por fim, estudou-se o caminho para o influxo de sódio em dendritos e espinhas em resposta a uncaging de glutamato. Para este fim, utilizou-CNQX e APV, que são bloqueadores selectivos para os sódio-permeável, os receptores do glutamato ionotrópicos do AMPA- e subtipo NMDA-, respectivamente. Os nossos resultados mostram que os sinais de sódio intracelular induzida pelo glutamato e as correntes somáticas eliciados foram omitidos na presença destes bloqueadores (Figura 7B). Após a lavagem para fora dos bloqueadores, os sinais são recuperados. Isso demonstra that uncaging de glutamato ativa os receptores de glutamato ionotrópicos em neurônios piramidais CA1, que medeiam o influxo de sódio em dendritos e espinhas, resultando em transientes de cálcio intracelular ea correntes de entrada. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figura 7 Perfil farmacológico de sinais de sódio evocadas e correntes de entrada. (A) cheio de SBFI CA1 piramidal neurônio com o patch pipeta (PP) ligado à soma (B) À esquerda:. Transitória de sódio e atual somática induzida por foto-ativação de glutamato enjaulado em um dendrito e espinhos anexados Center:. Perfusão com o Os bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos CNQX e APV inibe tanto o sinal de sódio e a corrente de influxo induzido por uncaging direita:. Ao wash-out dos bloqueadores, os sinais são restaurados. Os represen linha vermelhats um ajuste dos dados experimentais. A área cinza representa o período em que o flash uncaging (300 ms) obstruiu a imagem de SBFI fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K visualizações.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato. 

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imagem óptica de neurônios no gânglio de Caranguejo Stomatogastric com Tensão sensível Corantes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Neurociência

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Um Método para High Fidelity Optogenetic Controle de Individual Piramidal neurônios<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de gravação, Sensorial Campo Mapping, e cultivando neurônios identificados nos Sanguessuga, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogatório funcional do Adulto Hypothalamic Neurogenesis com Focal Radiológica Inibição

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurônios olfativos obtida através Nasal Biópsia Combinada com Laser-Capture Microdissection: Uma Abordagem Potencial para tratamento estudo Response em Transtornos Mentais

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imagem 3-D e Análise de Neurônios Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Com<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Rotulagem Balística de Neurônios Piramidais em Fatias Cerebrais e na Cultura Celular Primária

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...