Este trabalho foi financiado por doações do La Fondation Yves Cotrel de l&#39;Institut de France, Paris, França (ao Dr. Moreau), The Canadian Institutes of Health Research (PP2 conceder-99466 com o Dr. Moreau) e da Quarta Dimensão Spine LLC , New York, EUA (bolsa de pesquisa do Dr. Moreau).

Todo o procedimento é realizado sob o capô biológica estéril e todas as soluções e equipamentos que entram em contato com as células devem ser estéreis. 1. Preparação de soluções essenciais <ol><li> Preparar as soluções de acordo com a Tabela 1. </li><li> Mantenha a solução de sal equilibrada (BSS), à temperatura ambiente e todas as outras soluções a 4 ° C até ao momento da utilização. </li><li> Meios de frio aquecer a 37 ° C em banho-maria durante alguns minutos antes de usar. </li></ol> 2. Preparação e armazenamento de PBMC <ol><li> Recolha de 10 ml de sangue total em tubos de recolha tratados com EDTA para preparar duas alíquotas de PBMC usando 5 ml para cada alíquota. </li><li> Transferência de 5 ml de sangue total a partir do tubo de recolha tratados com EDTA a um tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar um volume igual de BSS e misture amostra por pipetagem suave para cima e para baixo. </li><li> Colocar 3 ml de Ficoll em dois tubos Falcon de 15 ml. </li><li> Camada cuidadosamente 4,5 mldiluído de mistura de sangue sobre o Ficoll em cada tubo. </li><li> Deixe os tubos descansar por até 5 min para favorecer uma clara separação do sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugar os tubos a 400 xg durante 30 minutos à temperatura ambiente sem travão. </li><li> Cuidadosamente remover os tubos da centrífuga de forma a não perturbar a disposição em camadas. As PBMCs são visíveis na interface BSS / Ficoll. </li><li> Colheita da camada turva de PBMC na interface dos dois tubos com uma pipeta e transferido para um novo tubo de 50 ml. </li><li> Adicionar 20 ml de meio completo. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 288 xg durante 7 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de meio suplementares. </li><li> Adicionar um volume igual de meio de congelamento. </li><li> Transferência da suspensão de células para um frasco de congelação. </li><li> Colocar o frasco de congelação num recipiente cryofreezing com isopropanol. </li><li> Armazenar o recipiente de congelamento a -80 ° C durante a noite. </li><li> Transfer as PBMC congelados alíquota a azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo. </li></ol> 3. Ensaio Funcional 1. Dia 1 <ol><li> Coloque alíquota a partir de azoto líquido, em banho de água a 37 ° C durante um minuto ou até descongelar. </li><li> Transferência da suspensão de células para um tubo de 50 ml com uma pipeta estéril. </li><li> Adicionar 15 ml de meio completo e as células para baixo girar a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Gentilmente suspender pellet celular em 1 ml de mídia PHA. </li><li> Completar o volume para 20 ml com a mesma mídia. </li><li> Tapar o tubo solto para permitir a entrada de ar. </li><li> Deixar o tubo durante a noite a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para permitir que os linfócitos quiescentes para se transformar em linfoblastos rapidamente proliferadas. </li></ol> 2. Dia 2 <ol><li> Pegue o tubo para fora da incubadora, parafuso das tampas completamente e girar as células para baixo a 200 xg por 5 minà temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Suavemente suspender sedimento celular em 1 ml de meio completo. </li><li> Completar o volume para 20 ml com a mesma mídia. </li><li> Tapar o tubo solto para permitir a entrada de ar. </li><li> Deixar o tubo durante a noite a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para expandir os números de células. </li></ol> 3. Dia 3 <ol><li> Obter o tubo para fora da incubadora, as tampas de parafuso completamente e girar para baixo as células a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o sobrenadante por aspiração. </li><li> Lave as células duas vezes com 10 ml de meio RPMI-1640 por centrifugação a 200 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Suavemente ressuspender o sedimento celular em 600 ul de meio RPMI-1640. </li><li> Medir a concentração de células e viabilidade, utilizando um contador de células automático e analisador de viabilidade. </li><li> Adicionar o volume apropriado de meio RPMI-1640 para se ajustar a uma concentração celular de 1,5 x 10 5 cells/20 ul. </li&gt; <li> Tratar as células com OPN recombinante (rOPN) ou de veículo (PBS) em 1,5 ml de Eppendorf. <ol><li> Transferir 100 uL de suspensão de células para dois tubos de 1,5 ml esterilizados Eppendorf. </li><li> Adicionar rOPN em um tubo para uma concentração final de 0,5 ug / ml. </li><li> Adicionar um volume igual de PBS no segundo tubo. </li><li> Misture delicadamente cada condição pipetando cima e para baixo duas vezes, utilizando um conjunto pipeta estéril de 100 ml. </li></ol></li><li> Prepare a pequena amostra de 96 poços de microplacas. <ol><li> Adicionar 5 mL de meio RPMI-1640 a cada poço. </li><li> Centrifugar a placa a 200 xg durante 3 minutos para remover quaisquer bolhas de ar. </li></ol></li><li> Semente as células não tratadas, bem como as células tratadas com rOPN ou PBS. <ol><li> Antes da transferência de células a partir de tubo de microplacas, pipetar suavemente para cima e para baixo uma vez, para assegurar uma suspensão uniforme de células. </li><li> Adicionar 40 ul de suspensão de células por poço em quadruplicado para as células não tratadas, em duplicado para rOPN PBS ou células tratadas. Refer a Figura 1 para o design. Este desenho permite que 12 pacientes a ser testado na mesma microplaca. </li><li> Deixar a placa de células sob o capô estéril durante 5 minutos para permitir que as células de repouso e se estabelecer de forma uniforme para o fundo do poço antes de colocar na incubadora. </li></ol></li><li> Incubar a placa durante 18 horas a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 para optimizar o efeito de OPN. </li></ol> 4. Dia 4 <ol><li> Executar a placa com os compostos. <ol><li> Pegue a placa de fora da incubadora e deixá-lo à temperatura ambiente por cerca de 30 min. </li><li> Prepare 1 ml de 100 mM de somatostatina e isoproterenol em meio RPMI-1640 por adição de 10 ul de solução de reserva (10 mM) em 990 ul de meio RPMI-1640. </li><li> Encha o prato composto por dispensar 20 l em poços apropriados como indicado na Figura 2. </li><li> Cubra o prato composto com um selo de pré-cortados perfurável para evitar alteração na concentração de composto devido à evaporação antesou durante a incubação no sistema à base de CDS. </li><li> Placa de carga da pilha, pontas de pipeta e placa de composto para o sistema baseado em CDS. </li><li> Nome da placa no software do aparelho baseado em CDS. </li><li> Selecione o protocolo apropriado. O protocolo editado para a classificação com PBMC é chamado de &quot;células Agonist não aderentes pequena amostra Placa RT 15 min &#39;. Vá para a caixa de protocolo e selecione este protocolo na lista de protocolos </li><li> Iniciar o protocolo clicando em &#39;Start&#39;. </li><li> O sistema de fluidos integrada adiciona simultaneamente os compostos de todos os poços por injecção de 5 uL por cavidade para se conseguir uma concentração final de 10 pM num volume total de 50 ul. </li><li> O sistema baseia-CDS recolhe automaticamente os dados para 15 minutos após a adição do composto. </li></ol></li><li> A análise dos dados <ol><li> Selecione baixas e altas faixas de freqüências para usar quando o cálculo dos valores extraídos para a nãoAs células aderentes. </li><li> Selecione a correção de deriva para corrigir a mudança linear em medidas de impedância da linha de base ao longo do tempo. </li><li> Selecione filtragem de dados para reduzir as variações na medição da resposta cinética devido ao ruído eletrônico e além composto. </li><li> Selecione o método Max-Min para o tempo de análise total. </li><li> Exportar dados para o Excel na opção de formato de placa. </li><li> Calcular delta L (ÄG) subtraindo a média da amplitude de resposta à estimulação Gi (RmGi) a partir da média da magnitude da resposta ao estímulo Gs (RMGS) utilizando a seguinte fórmula: ÄG = RmGi - RMGS </li><li> Calcula-se a percentagem do efeito de dobragem (Fe) de OPN em resposta Gi-mediada dividindo a média da amplitude de resposta à estimulação Gi na presença de OPN (RmGiOPN) com a média da amplitude de resposta para GI estimulação na presença de PBS ( RmGiPBS) utilizando a seguinte fórmula: Fe = 100 x (RmGiOPN / RmGiPBS) </li><li> Consulte Tcapaz 2 para classificar os pacientes. </li></ol></li></ol>

<ol>
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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cellular+dielectric+spectroscopy,+a+whole-cell,+label-free+technology+for+drug+discovery+on+Gi-coupled+GPCRs.">Evaluation of cellular dielectric spectroscopy, a whole-cell, label-free technology for drug discovery on Gi-coupled GPCRs.</a> J. Biomol. Screen. 12 (3), 312-319 (2007).</li><li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity.">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li><li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays.">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li><li>Akoume, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+Gi-coupled+receptor+signaling+occurs+in+adolescent+idiopathic+scoliosis.">Disrupted Gi-coupled receptor signaling occurs in adolescent idiopathic scoliosis.</a> J. Clin. Invest. , (2013).</li></ol>

Este trabalho levou a diversas patentes detidas pela University Hospital Sainte-Justine e muitos outros estão pendentes em vários países. Quarta Dimensão Spine LLC é a concessionária exclusiva do Hospital da Universidade de Sainte-Justine.

Nós descrevemos um procedimento detalhado de um teste baseado em células prognóstico para escoliose idiopática que é aplicável a células mononucleares do sangue periférico (PBMC) recém isolado ou conservado congelado por até um ano em nitrogênio líquido. Desde a utilização de PBMC recém-isoladas é complicado quando se testa grande número de indivíduos, o procedimento foi presenteado com PBMC congelados, que oferecem uma alternativa mais prática em ambiente clínico. No entanto, problemas com a acumulação de células durante o descongelamento foram encontrados quando PBMC congelados foram inicialmente utilizados, conduzindo, por vezes, a variabilidade inter-ensaio. Para maximizar ensaio reprodutibilidade, recomendamos evitar ciclo de congelamento-descongelamento e usando a amostra congelada apenas uma vez. O processo é muito simples, o que permite a detecção precisa da função da proteína Gi defeito num curto espaço de tempo. Usando este procedimento, crianças assintomáticas e com escoliose pode ser facilmente classificada para melhor prever sua evolução clínica, sem qualquer perigo para a sua saúde. HoWever, ao realizar a classificação de acordo com o grau de resposta à estimulação máxima Gi em relação aos controles saudáveis ​​12, vários requisitos para os assuntos de controle devem ser cumpridos. De fato, a fim de ter uma coorte comparação adequada, os indivíduos do grupo controle deve ser a idade e sexo do, não estar em qualquer tipo de medicação, e fornecer informações privadas, como a história individual / familiar passado médica. Estes requisitos podem constituir um obstáculo importante para o recrutamento de indivíduos controle. Por conseguinte, a realização de classificação por análise do grau de desequilíbrio entre a resposta e Gi Gs estimulação proteína no mesmo indivíduo, é ideal para eliminar a necessidade da utilização de sujeitos de controlo. A utilização do sistema à base de CDS para realizar este teste prognóstico é significativa em termos de proporcionar simultaneamente Gi-e respostas celulares mediadas Gs no mesmo ensaio. Embora muitos pacientes podem ser classificados sem amambigüidade utilizando a gama dinâmica fixa para este ensaio, um pequeno número de pacientes que apresentam valores no limite de intervalos, tal como ilustrado pelos resultados do presente relatório. Para discriminar estes indivíduos, que foram introduzidas a avaliação do efeito de OPN em resposta à estimulação Gi, demonstrando que a OPN induz um efeito diferencial em resposta celular mediada por Gi entre os três grupos funcionais. Com efeito, verificou-se que em presença de OPN, resposta a estimulação Gi aumenta em que FG1, ao mesmo tempo que diminui em FG2 e FG3, a uma maior extensão no FG2. Apesar do elevado custo de OPN, o uso desta quimioquina é essencial para distinguir os casos ambíguos, e, por conseguinte, aumentar a precisão do nosso ensaio de classificação. Contudo, este ensaio tem uma desvantagem na medida em que um mínimo de 1,5 x 10 5 células por poço, é necessário observar a resposta celular com o sistema com base em CDS sob as nossas condições experimentais. Certas amostras dos doentes não têm um número suficiente deAs células a serem testadas. Neste caso, é necessário recordar os pacientes para coleta de sangue adicional, que pode ser preocupante para as famílias e frustrante para a equipe médica e laboratorial. Estudos prospectivos são planejadas em nosso laboratório para resolver esse problema. No entanto, o protocolo actual baseia-se métodos simples e com provas dadas para preparar as células, enquanto o ensaio é automatizado usando um sistema de livre-etiqueta validado 13, 14, para monitorizar as respostas das células. A plataforma de ensaio é relativamente barata quando comparada com a plataforma genética disponível para o prognóstico de outras doenças. Além disso, o custo de todos os materiais descartáveis, incluindo os tubos de coleta de sangue, dicas, o eletrodo especial microplacas, e cônico e tubos de Eppendorf, e não é muito caro e é estimada em menos de US $ 3.000 para completar um teste para cerca de mil pacientes. Embora esta estimativa não inclui os custos de trabalho para a preparação de amostrase realização do teste, este teste permanece consideravelmente mais acessível do que as plataformas de sequenciamento de próxima geração. Notável, não é apenas a comparação de custos de plataformas genéticas, mas mais especificamente relacionadas ao campo da AIS, são os custos associados ao exame radiológico. Hoje, mais de um milhão de crianças nos EUA e cerca de 100.000 crianças no Canadá são diagnosticados com escoliose idiopática, eo custo total de diagnóstico e acompanhamento das crianças com escoliose através da exposição de raios-X é mais de 2,5 bilhões de dólares por ano na América do Norte. Assim, o nosso procedimento de ensaio de base celular que seria esperado para ser adequado para o rastreio e monitorização de crianças com escoliose idiopática, sem risco para a saúde e a custos mais baixos de rotina.

Escoliose idiopática é uma deformidade da coluna de causa desconhecida, geralmente definida como uma curvatura lateral maior do que 10 graus, acompanhadas por uma rotação vertebral 1. A condição afeta 4% da população pediátrica e é mais comumente diagnosticado entre as idades de 9 a 13 anos 2,3,4. O diagnóstico é primariamente de exclusão e é feita somente após a exclusão de outras causas de deformidade da coluna vertebral, como a malformação vertebral, neuromuscular ou doenças sindrômicas. Tradicionalmente, a assimetria trunkal é revelado por Adams teste frente de flexão e medido com escoliômetro durante o exame físico 5. O diagnóstico pode ser confirmado por observação radiográfica da curva e a medição do ângulo, utilizando o método de Cobb 6. Uma vez diagnosticada, a principal preocupação para os médicos no tratamento de crianças com escoliose é se a curva vai progredir. Com efeito, a progressão da curva é frequentemente imprevisível eé mais freqüentemente observada entre as meninas do que em meninos 7. Se não for tratada, a curva pode progredir drasticamente, criando deformidade física significativa e até mesmo problemas cardiopulmonares. Estas manifestações se tornar fatais quando a curva for superior a 70 ° 8,9. As opções atuais de tratamento para prevenir ou impedir a progressão da curva incluem órtese e cirurgia. Em geral, se preparando é recomendada para curvas entre 25-40 °, enquanto a cirurgia é reservada para as curvas superiores a 45 ° ou que não respondem a órtese. Aproximadamente, 10% das crianças diagnosticadas com escoliose idiopática têm progressão da curva exigindo cirurgia corretiva 10. Atualmente, não existe um método comprovado ou teste disponível para identificar este grupo de doentes. Consequentemente, todas as crianças diagnosticadas são submetidos a várias radiografias ao longo de vários anos, geralmente até atingirem a maturidade esquelética. Estima-se que os doentes com escoliose típicos terãoaproximadamente 22 exames radiológicos durante um período de 3 anos 11. Devido ao risco potencial de vários exames radiográficos, as abordagens alternativas que poderiam permitir a realização do prognóstico de escoliose idiopática, sem expor as crianças à radiação ionizante são fortemente desejável. Com o intuito de atender a essa necessidade, que já desenvolveu um ensaio de triagem baseada em células como teste preditivo para identificar mais cedo as crianças assintomáticas em risco de desenvolver escoliose idiopática. O teste prevê o resultado clínico em crianças assintomáticas e afectadas pelo examinando o estado funcional de proteínas Gi e classificar as crianças em três grupos funcionais (FG1, FG2 e GF3) de acordo com o grau de resposta à estimulação máxima proteína Gi 12 medido pelo CDS sistema baseado. Este sistema é largamente utilizado para avaliar a transdução de sinal através de proteínas G em vários tipos de células 13,14,15,16. Ela produz informação sobre oresposta total integrada das células aos estímulos externos, medindo mudanças na impedância após a ativação de receptores de superfície celular. As células são semeadas em microplacas que contêm eléctrodos no fundo dos poços e o sistema aplica uma pequena voltagem que induzem correntes extracelular e intracelular. Após a injecção composto para dentro do poço, os receptores da superfície celular são estimulados e os eventos de transdução de sinal de ocorrer, conduzindo a alterações celulares que afectam o fluxo de correntes extracelulares e transcelular, e, assim, afectar a grandeza medida. Com esta abordagem, os pacientes com escoliose e crianças em maior risco de desenvolver escoliose são menos sensíveis às Gi estimulação proteína quando comparados com indivíduos saudáveis, ea classificação é baseada na porcentagem de grau de redução em relação ao grupo controle. Os intervalos de classificação são fixos entre 10 e 40% para FG3, 40 e 60% ​​para FG2, e 60 e 90% para FG1 12. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mais recentemente, tem modificações nesta abordagem, demonstrando que os três grupos funcionais podem ser claramente distinguidos de acordo com o perfil de desequilíbrio entre a resposta à estimulação Gi e Gs. Na verdade, descobrimos que a resposta à estimulação Gi predominou no FG3, enquanto nenhum desequilíbrio aparente foi observada em FG2. Em contraste, FG1 exibiu predominância da resposta à estimulação Gs. Além disso, nós fornecemos a evidência de que os pacientes pertencentes a FG2 correm mais risco de progressão para o ponto de precisar de cirurgia 17. A precisão do teste de classificação tem sido melhorada através da demonstração de um efeito diferencial da osteopontina (OPN) em resposta à estimulação Gi entre grupos funcionais. Aqui nós documentar os passos detalhados de procedimentos experimentais e analíticos deste teste funcional como atualmente realizados em nosso laboratório.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>350-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Therno Scientific Hyclone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin</td>
			<td>Invitrogen (Gibco)</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Osteopontin</td>
			<td>R&#38;D Systems, Inc</td>
			<td>1433-OP/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproterenol</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Wisent, Inc</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipette tips</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>301-06-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Eppendorf tubes</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>24-MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey small sample 96W microplate</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1026496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey tips</td>
			<td>Cybio</td>
			<td>OL3800-25-559N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut pierceable seals</td>
			<td>Excel Scientific, Inc</td>
			<td>XP-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicell XR</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>731050</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>1284</td>
			<td>Class II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CY5093570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>89032-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard light microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMIL LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51019557</td>
			<td>5% CO2 at 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellkey system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1019185</td>
			<td>CDS-based instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell-based assay protocol for the prognostic prediction of idiopathic scoliosis using cellular dielectric spectroscopy

Este protocolo detalha o procedimento experimental e analítico para um ensaio baseado em células desenvolvido em nosso laboratório como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática em crianças assintomáticas e afetados. O ensaio consiste na avaliação do estado funcional das proteínas Gi e Gs em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por espectroscopia dielétrica celular (CDS), utilizando um instrumento baseado em CDS automatizado, bem como a classificação das crianças em três grupos funcionais (FG1 , FG2, FG3) no que diz respeito ao perfil de desequilíbrio entre o grau de resposta a Gi Gs e proteínas de estimulação. A classificação é ainda confirmada pelo efeito diferencial da osteopontina (OPN) em resposta à estimulação Gi entre os grupos ea progressão grave da doença é referenciado por FG2. Aproximadamente, um volume de 10 ml de sangue é necessário para extrair PBMC por gradiente de Ficoll-e as células são então armazenadas em azoto líquido. O número adequado de PBMCs para realizar o ensaio é obtido após dois dias de cultura de células. Essencialmente, as células são primeiro incubadas com phytohemmaglutinin (PHA). Após 24 horas de incubação, o meio é substituído por um meio de cultura isento de PHA durante mais 24 horas adicionais antes da sementeira celular e tratamento de OPN. As células são então espectroscopicamente selecionados para suas respostas a somatostatina e isoproterenol, que, respectivamente, ativam proteínas Gi e Gs através de seus receptores cognatos. Ambos somatostatina e isoproterenol são injectados simultaneamente com um sistema de fluidos integradas e respostas das células são monitorizados durante 15 min. O ensaio pode ser realizado com PBMC frescos ou congelados e que o processo for concluído dentro de 4 dias.

A viabilidade das células foi comparável entre todas as amostras com valores consistentes na gama de 86 e 96%. Em contraste, foram observados elevados variações no número de células entre as amostras (Tabela 3). Das 32 amostras utilizadas, dois tiveram número insuficiente de células e não foram classificados. Um exemplo dos resultados da classificação funcional de acordo com o grau de desequilíbrio entre Gi e sinalização Gs é mostrado na Figura 3. O eixo vertical desta figura está dividida em três secções, que delimitam os grupos funcionais, com gamas dinâmicas estabelecidas como&gt; 10 para FG3, entre 10 e -10 para FG2, e, finalmente, &lt;-10 para FG1. Entre 30 pacientes testados aqui, 14, 6 e 5 pacientes foram claramente classificados em FG3, FG2 e FG1, respectivamente, enquanto cinco pacientes, nomeadamente 345, 353, 370, 371, e 382, ​​estavam no limite de intervalos. A avaliação do efeito de OPN em resposta à estimulação Gi revelou que a OPN um aumento da resposta em papacientes 353 e 371. Em contraste, a resposta foi reduzida em mais de 50% em doentes 345 e 382 e pelo menos de 50% em paciente de 370 a seguir ao tratamento rOPN. Assim, de acordo com os nossos critérios de classificação (Tabela 2), fomos capazes de categorizar os pacientes 353 e 371 em FG1, os pacientes 345 e 382 em FG2 e paciente 370 em FG3. Em paralelo, todos os pacientes foram selecionados para a sua resposta ao estímulo da proteína Gi e comparados aos controles. Como esperado, todos os pacientes eram menos sensíveis do que os indivíduos controle e pacientes classificados no mesmo grupo funcional pelo nosso novo procedimento apresentaram níveis semelhantes de resposta máxima (Figura 5). Além disso, a disparidade entre os pacientes de cada grupo funcional foi consistente com a nossa gama clássica de classificação 12, validando nosso novo procedimento. A classificação de um grande grupo de pacientes com escoliose regularmente seguido em nossa clínica especial em Sainte-Justine Hospital revelou que os trêsgrupos funcionais foram distribuídas de maneira semelhante entre os casos moderados, enquanto o FG2 predominou nos casos graves (Figura 6), a identificação de pacientes classificados para este grupo funcional como um maior risco de progressão da doença grave e indicando que este teste de classificação podem ser úteis no prognóstico de escoliose idiopática. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5"> Solução A </td><td> D-glucose anidra </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> CaCl 2 2H 2 O </td><td> 0,05 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,98 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5,4 mM </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 145 mM </td></tr><tr><td> Solução B </td><td> NaCl </td><td> 140 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Solução salina equilibrada (BSS) </td><td> Solução A </td><td> 1 volume </td></tr><tr><td> Solução B </td><td> 9 de volume </td></tr><tr><tdrowspan = &quot;3&quot;&gt; mídia completa </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td rowspan="3"> Meios complementares </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Mídia Congelamento </td><td> RPMI-1640 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40% </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20% </td></tr><tr><td rowspan="4"> Mídia PHA </td><td> RPMI-1640 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Antibióticos antimicótico </td><td> 1% </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> Fito-hemaglutinina </td><td> 1% </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Essencialsoluções. <table border="1"><tbody><tr><td> Intervalos dinâmicos com ÄG </td><td> Grupos Funcionais </td><td> Intervalos dinâmicos com Fe </td></tr><tr><td> ÄG &lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> Fe&gt; 100% </td></tr><tr><td> -10 &lt;ÄG &lt;10 </td><td> FG2 </td><td> Fe &lt;50% </td></tr><tr><td> ÄG&gt; +10 </td><td> FG3 </td><td> 50% &lt;Fe &lt;95% </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Categorização de grupos funcionais de acordo com faixas dinâmicas estabelecidas com ÄG e Fe. <table border="1"><tbody><tr><td> Pacientes </td><td> Viabilidade (%) </td><td> A concentração das células (x 10 6 / ml) </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88,7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90,5</td><td> 13,6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94,4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94,3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94,2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94,6 </td><td> 8,52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91,2 </td><td> 0,82 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90,3 </td><td> 8,92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92,6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91,3 </td><td> 12,75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86,9 </td><td> 7,62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91,2 </td><td> 7,51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90,3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95,1 </td><td> 16.94 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92,3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89,4 </td><td> 7,67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93,5 </td><td> 7,84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86,5 </td><td> 2.2 </td><td> Número insuficiente de células </td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92,6 </td><td> 15,69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93,4 </td><td> 10,9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92,5 </td><td> 19,93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88,8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93,9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92,9 </td><td> 15,67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93,1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93,6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ Td&gt; <td> 92,6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91,1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93,9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92,1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92,9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89,1 </td><td> 7,73 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3. Viabilidade por cento e a concentração das células, como determinado utilizando um contador de células automático e analisador de viabilidade. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> Figura 1. Design para a semeadura de células. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> Figura 2.Projete para a distribuição de compostos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> Figura 3. Faixa dinâmica da classificação funcional usando o sistema baseado em CDS. Gráfico ilustra valores do grau de desequilíbrio entre as respostas a Gi e Gs estimulação obtida em PBMC de pacientes com escoliose idiopática. Os valores foram medidos pelo sistema baseado em CDS em resposta a 10 uM de somatostatina e isoproterenol. Cada ponto representa a ÄG de ambas as respostas em duplicado. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> Figura 4. Efeito de rOPN em resposta à estimulação de PBMC Gi. As células foram de soro de fome durante 18 horas na presença ou ausência de 0,5 ug / ml rOPN e depois estimuladas com 10<html> 56; M de somatostatina para iniciar a resposta celular mediada por Gi. Os dados do gráfico foi gerado a partir de impedância máxima, mínima e correspondem à média de resposta em duplicado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> Figura 5. Estado funcional da proteína Gi em PBMC de controle e assuntos scoliostic. PBMCs de sujeitos de controlo e de doentes com escoliose foram expostos a concentrações crescentes de somatostatina para estimular proteínas Gi através de receptores de somatostatina endógena. A resposta celular foi medida por um sistema baseado em CDS como descrito na secção do processo. As curvas foram geradas a partir de máxima mínima impedância. Cada curva representa a regressão não-linear. Os dados foram normalizados para a resposta máxima em células de indivíduos de controlo e cada ponto corresponde à média de resposta em duplicado./ 50768/50768fig5large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> Figura 6. Distribuição dos grupos funcionais entre os diferentes fases de escoliose. Um grande grupo de pacientes com escoliose com 794 moderados (curvaturas entre 10-44 °) e 162 casos graves (curvatura maior que 45 °) regularmente acompanhados no Hospital Sainte-Justine, foram classificados de acordo com seu grau de desequilíbrio entre a resposta a Gi e Gs estimulação. As respostas foram medidas pelo sistema baseado em CDS em resposta a 10 uM de somatostatina e isoproterenol.

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Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

Um protocolo estruturada é apresentado para um ensaio de base celular como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática usando espectroscopia dieléctrica celular (CDS). O ensaio pode ser realizado com as células mononucleares do sangue periférico frescos ou congelados (PBMC) e o procedimento for concluído no prazo de 4 dias.

Baseado em celular Protocolo Ensaio para a predição prognóstica de escoliose idiopática Usando celular dielétrica Espectroscopia

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

cell-based-assay-protocol-for-prognostic-prediction-idiopathic

Research

JoVE Journal

Medicine

10.5K visualizações.  Sainte-Justine University Hospital Research Center.  Um protocolo estruturada é apresentado para um ensaio de base celular como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática usando espectroscopia dieléctrica celular (CDS). O ensaio pode ser realizado com as células mononucleares do sangue periférico frescos ou congelados (PBMC) e o procedimento for concluído no prazo de 4 dias. 

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An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative short-term and long-term effects on the mother. Prior to women undergoing surgery, can we predict who is at risk for developing significant postoperative pain and potentially prevent or minimize its negative consequences? These are the fundamental questions that a team from the University of Washington, Stanford University, the Catholic University in Brussels, Belgium, Santa Joana Women's Hospital in S&atilde;o Paulo, Brazil, and Rambam Medical Center in Israel is currently evaluating in an international research collaboration. The ultimate goal of this project is to provide optimal pain relief during and after cesarean section by offering individualized anesthetic care to women who appear to be more 'susceptible' to pain after surgery.
A significant number of women experience moderate or severe acute post-partum pain after vaginal and cesarean deliveries. 1 Furthermore, 10-15% of women suffer chronic persistent pain after cesarean section. 2 With constant increase in cesarean rates in the US 3 and the already high rate in Brazil, this is bound to create a significant public health problem. When questioning women's fears and expectations from cesarean section, pain during and after it is their greatest concern. 4 Individual variability in severity of pain after vaginal or operative delivery is influenced by multiple factors including sensitivity to pain, psychological factors, age, and genetics. The unique birth experience leads to unpredictable requirements for analgesics, from 'none at all' to 'very high' doses of pain medication. Pain after cesarean section is an excellent model to study post-operative pain because it is performed on otherwise young and healthy women. Therefore, it is recommended to attenuate the pain during the acute phase because this may lead to chronic pain disorders. The impact of developing persistent pain is immense, since it may impair not only the ability of women to care for their child in the immediate postpartum period, but also their own well being for a long period of time.
In a series of projects, an international research network is currently investigating the effect of pregnancy on pain modulation and ways to predict who will suffer acute severe pain and potentially chronic pain, by using simple pain tests and questionnaires in combination with genetic analysis. A relatively recent approach to investigate pain modulation is via the psychophysical measure of Diffuse Noxious Inhibitory Control (DNIC). This pain-modulating process is the neurophysiological basis for the well-known phenomenon of 'pain inhibits pain' from remote areas of the body. The DNIC paradigm has evolved recently into a clinical tool and simple test and has been shown to be a predictor of post-operative pain.5 Since pregnancy is associated with decreased pain sensitivity and/or enhanced processes of pain modulation, using tests that investigate pain modulation should provide a better understanding of the pathways involved with pregnancy-induced analgesia and may help predict pain outcomes during labor and delivery. For those women delivering by cesarean section, a DNIC test performed prior to surgery along with psychosocial questionnaires and genetic tests should enable one to identify women prone to suffer severe post-cesarean pain and persistent pain. These clinical tests should allow anesthesiologists to offer not only personalized medicine to women with the promise to improve well-being and satisfaction, but also a reduction in the overall cost of perioperative and long term care due to pain and suffering. On a larger scale, these tests that explore pain modulation may become bedside screening tests to predict the development of pain disorders following surgery.

An Experimental Paradigm for the Prediction of Post-Operative Pain PPOP

Diffuse noxious inhibitory control, temporal summation and wound hyperalgesia testing are demonstrated in the obstetric patient. These tests evaluate inhibitory and excitatory mechanisms of pain processing and are here utilized to evaluate endogenous analgesia at different time-points during pregnancy and the peripartum period to help reveal individual s risk for persistent pain.

Um paradigma experimental para a Previsão da dor pós-operatória (PPOP)

Many women undergo cesarean delivery without problems, however some experience significant pain after cesarean section. Pain is associated with negative ...

Medicina

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

High-throughput Citometria de Fluxo Ensaio Celular para detectar anticorpos em N-metil-D-aspartato ou dopamina-2 Receptor em Soro Humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentre Formação: Um Ensaio Celular para Determinar o Potencial oncogénica de um Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da Aguda de Radiação Ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently inhibit viral replication, they have no direct effect on the expression of viral proteins transcribed from a viral covalently closed circular DNA (cccDNA). As high viral antigen load may play a role in this chronic and HBV-related carcinogenesis, the goal of HBV treatment is to eradicate viral proteins. HBV regulatory protein X (HBx) binds to the host DNA damage-binding protein 1 (DDB1) protein to degrade structural maintenance of chromosomes 5/6 (Smc5/6), resulting in activation of viral transcription from cccDNA. Here, using a split luciferase complementation assay system, we present a comprehensive compound screening system to identify inhibitors of the HBx-DDB1 interaction. Our protocol enables easy detection of interaction dynamics in real time within living cells. This technique may become a key assay to discover novel therapeutic agents for treatment of HBV infection.

Here, we present a method for screening anti-hepatitis B viral agents that inhibit the HBx-DDB1 interaction using a split luciferase assay system. This system allows easy detection of protein-protein interactions and is suitable for identifying inhibitors of such interactions.

Identificação de inibidores da interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

Quantification of Optic Nerve Cross Sectional Area on MRI: A Novel Protocol using Fiji Software

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic nerve cross-sectional assessment and quantification using 3 T MRI for image acquisition and ImageJ's Fiji software for image processing quantification. Image acquisition was performed using 3 T MRI, with proper instructions for the patient to ensure straight fixation during imaging. A T2-weighted fat suppressed sequence was used. A coronal cut taken 3 mm behind the globe and perpendicular to the optic nerve axis should be uploaded to the software. Using the threshold function, the white matter area of the optic nerve is selected and quantified, thus, eliminating inter-individual measurement bias. We also described the normal limits for the optic nerve cross-sectional area according to age, based on previously published literature. We used the described protocol to assess optic nerve of a suspected glaucoma patient. The optic nerve cross-sectional area was found to be within the normal limits, a finding further confirmed via optical coherence tomography of the optic nerve.

We provided a detailed protocol for a standardized method of optic nerve assessment and quantification using MRI, utilizing a widely available imaging sequence, and open access software for image analysis. Following this standardized protocol would provide meaningful data for comparison between different patients and different studies.

Quantificação da Área Transversal do Nervo Óptico na Ressonância Magnética: Um novo protocolo usando o software Fiji

Optic nerve assessment is an important aspect of glaucoma diagnosis and follow-up. This project describes a protocol for a unified methodology of optic ...

A Real-World High-Intensity Interval Training Protocol for Cardiorespiratory Fitness Improvement

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, few studies have tested the efficiency of HIIT protocols in a &#34;real world&#34; setting, e.g., HIIT protocols designed for outdoor spaces without specialized equipment. This study presents a &#34;real world&#34; training protocol, named &#34;beep training&#34;, and compares the efficiency of a HIIT regiment versus a traditional long-duration Moderate-Intensity Continuous Training (MICT) regiment using this beep training protocol on VO2 max of overweight untrained men. Twenty-two subjects performed outdoor running with MICT (n = 11) or HIIT (n = 11). Cardiorespiratory fitness was assessed before and after training protocols using a metabolic analyzer. Both training protocols were performed 3 days a week for 8 weeks using the Beep Test results. The MICT group performed the exercise program at 60%-75% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax) and with a progression of the distance of 3,500-5,000 m. The HIIT group performed the interval exercise with 7-10 bouts of 200 m at 85%-100% of the maximum speed of the 20 m shuttle test (Vmax), interspersed with 1 min of passive recovery. Although the HIIT group presented a significantly lower training volume than the MICT group (p &#60; 0.05) after 8 weeks of beep training, HIIT was superior to MICT in improving VO2 max (MICT: ~4.1%; HIIT: ~7.3%; p &#60; 0.05). The &#34;real world&#34; HIIT regiment based on beep training protocol is a time-efficient, low-cost, and easy-to-implement protocol for overweight untrained men.

This study presents a low-cost and easy-to-implement "real world" high-intensity interval training (HIIT) protocol for scientific research and discusses its efficiency for cardiorespiratory fitness.

Um protocolo de treinamento intervalado de alta intensidade do mundo real para melhoria do condicionamento cardiorrespiratório

High-Intensity Interval Training (HIIT) has emerged as an interesting time-efficient approach to increase exercise adherence and improve health. However, ...

Network Pharmacology Prediction and Metabolomics Validation of the Mechanism of Fructus Phyllanthi against Hyperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug against hyperlipidemia in Traditional Chinese Medicine (TCM) and Indian Medicine theories, however the potential mechanism requires further exploration. The present research aims to reveal the mechanism of FP against hyperlipidemia based on an integrated strategy combining network pharmacology prediction with metabolomics validation. A high-fat diet (HFD)-induced mice model was established by evaluating the plasma lipid levels, including total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C). Network pharmacology was applied to find out the active ingredients of FP and potential targets against hyperlipidemia. Metabolomics of plasma and liver were performed to identify differential metabolites and their corresponding pathways among the normal group, model group, and intervention group. The relationship between network pharmacology and metabolomics was further constructed to obtain a comprehensive view of the process of FP against hyperlipidemia. The obtained key target proteins were verified by molecular docking. These results reflected that FP improved the plasma lipid levels and liver injury of hyperlipidemia induced by a HFD. Gallic acid, quercetin, and beta-sitosterol in FP were demonstrated as the key active compounds. A total of 16 and six potential differential metabolites in plasma and liver, respectively, were found to be involved in the therapeutic effects of FP against hyperlipidemia by metabolomics. Further, integration analysis indicated that the intervention effects were associated with CYP1A1, AChE, and MGAM, as well as the adjustment of L-kynurenine, corticosterone, acetylcholine, and raffinose, mainly involving tryptophan metabolism pathway. Molecular docking ensured that the above ingredients acting on hyperlipidemia-related protein targets played a key role in lowering lipids. In summary, this research provided a new possibility for preventing and treating hyperlipidemia.

The present protocol describes an integrated strategy for exploring the key targets and mechanisms of Fructus Phyllanthi against hyperlipidemia based on network pharmacology prediction and metabolomics verification.

Predição de Farmacologia de Rede e Validação Metabolômica do Mecanismo de Fructus Phyllanthi contra Hiperlipidemia

Hyperlipidemia has become a leading risk factor for cardiovascular diseases and liver injury worldwide. Fructus Phyllanthi (FP) is an effective drug ...

Descoberta de biomarcadores não invasivos para proteômica lacrimal usando LC-MS

A Protein Suspension-Trapping Sample Preparation for Tear Proteomics by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for several ocular diseases and conditions. The suspension trapping column has been reported to be an efficient and user-friendly sample preparation workflow for the broad application of downstream proteomic analysis. Yet, this strategy has not been well-studied in the analysis of human tear proteome. The present protocol describes an integrated workflow from clinical human tear samples to purified peptides for non-invasive tear protein biomarker research using mass spectrometry, which provides insights into disease biomarkers and monitoring when combined with bioinformatics analysis. A protein suspension trapping sample preparation was applied and demonstrated the discovery of tear proteome with fast, reproducible, and user-friendly procedures, as a universal, optimized sample preparation for human tear fluid analysis. In particular, the suspension trapping procedure outperformed in-solution sample preparation in terms of peptide recovery, protein identification, and shorter sample preparation time.

Autor em destaque: Avançando na análise do fluido lacrimal usando um protocolo padronizado para pesquisa proteômica 

This protocol describes a method for collecting tear samples using Schirmer strips and an integrated quantitative workflow for discovering non-invasive tear protein biomarkers. The suspension trapping sample preparation workflow enables fast and robust tear sample preparation and mass spectrometric analysis, resulting in higher peptide recovery yields and protein identification than standard in-solution procedures.

Preparação de amostra de suspensão de proteínas para proteômica lacrimal por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...