Os autores agradecem ao Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi e Jeff Durban por sua revisão crítica e edição deste manuscrito. Os autores também agradecem a Allison Schwartz pelo apoio técnico.

1. Preparação da amostra de proteína
(Descreve-se um procedimento típico para extrair proteínas da cultura celular)
<ol><li>Coloque o prato de cultura de células HeLa no gelo e lave as células com soro fisiológico tris-tamponado (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspire a TBS, depois adicione 1 ml por 100 mm de tampão RIPA gelado (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% SDS) complementado com fosfatase e inibidores de protease.</li>
	<li>Raspar células aderentes do prato usando um raspador de células plásticas frias; transfira suavemente a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge pré-cozido.</li>
	<li>Mantenha a agitação constante por 30 min a 4 °C em um rotador.</li>
	<li>Gire a 16.000 x g por 20 min em uma centrífuga pré-identificada de 4 °C.</li>
	<li>Retire suavemente o tubo da centrífuga e coloque no gelo. Transfira o supernatante para um tubo fresco mantido no gelo, e descarte a pelota.</li>
	<li>Remova um pequeno volume (10-20 μl) de lysate para realizar um ensaio proteico. Determine a concentração de proteína para cada amostra usando o kit de ensaio RC DC.</li>
	<li>Se necessário, aliquot as amostras de proteína para armazenamento a longo prazo a -20 °C. Ciclos de congelamento e degelo repetidos causam degradação proteica e devem ser evitados.</li>
	<li>Pegue cerca de 20 μg de cada amostra, adicione um volume igual de 2x Tampão amostral de Laemmli (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanol, 20% glicerol, 0,004% azul bromofenol, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).</li>
	<li>Aqueça cada célula em tampão de amostra a 95 °C por 5 min.</li>
	<li>Centrífuga a 16.000 x g em uma microcentrifuagem por 1 min.</li>
</ol>2. Eletroforese de gel com Géis livres de manchas (~30 min)
<ol><li>Pegue um critério TGX Qualquer gel pré-moldado sem manchas KD (um gel de formato midi), remova o pente e a fita da parte inferior do.</li>
	<li>Coloque o na célula Critério e encha a câmara tampão superior integrada com tampão de corrida de 60 ml (25 mM Tris, 190 mM de gliccina, 0,1% SDS, pH 8.3). Enxágüe os poços com tampão de corrida.</li>
	<li>Encha cada metade do tanque tampão inferior com 400 ml de tampão de corrida até a linha de enchimento marcada.</li>
	<li>Carregue as amostras de proteínas e marcadores proteicos apropriados.</li>
	<li>Coloque a tampa sobre o tanque, alinhando os plugues de banana codificados por cores com tomadas correspondentes na tampa.</li>
	<li>Execute o gel por ~30 min a 200 V ou 20 min a 300 V.</li>
</ol>3. Imagem de gel sem manchas usando o sistema Chemidoc MP para verificar a qualidade da separação da proteína (~5 min)
<ol><li>Remova o de gel da célula. Use a ferramenta de abertura de de gel na tampa Criterion Cell para abrir o e soltar o gel.</li>
	<li>Aplique um par de mililitros de água no centro da bandeja de amostras UV do imager ChemiDoc MP. Levante cuidadosamente o gel do e coloque-o na bandeja.</li>
	<li>Inicie o software Image Lab e capture a imagem em gel sem manchas(Figura 1A)com as seguintes configurações: Aplicação: gel sem manchas Tempo de ativação do gel: 1 min Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas</li>
	<li>Remova o gel da bandeja de amostra e proceda imediatamente para transferir a etapa.</li>
</ol>4. Transferência de proteína com o Sistema Turbo Trans-Blot (~10 min)
<ol><li>Abra um pacote de transferência Trans-Blot Turbo Midi PVDF; coloque a pilha inferior (que inclui a membrana) na base do de transferência.</li>
	<li>Coloque o gel em cima da membrana, coloque a pilha superior no gel e passe bolhas.</li>
	<li>Coloque a tampa na base do e gire o mostrador para bloqueá-la.</li>
	<li>Insira o na baia da mancha.</li>
	<li>Inicie a transferência selecionando um programa Turbo predefinido e escolhendo o tamanho do gel Critério (midi) e, em seguida, pressione RUN. Uma corrida típica leva apenas 7 minutos.</li>
	<li>Quando a transferência acabar, desmonte o sanduíche de manchas e coloque tanto a mancha quanto o gel em um recipiente com água deionizada.</li>
</ol>5. Imagem de gel e manchas sem manchas usando o sistema Chemidoc MP para verificar a eficiência e a qualidade da transferência de proteínas (~5 minutos)
<ol><li>Coloque o gel pós-transferência na bandeja de amostra do imager ChemiDoc MP.</li>
	<li>Inicie o software Image Lab e capture a imagem sem manchas do gel pós-transferência (Figura 1B)com as seguintes configurações: Aplicação: gel sem manchas Tempo de ativação do gel: nenhum Área de imagem: gel critério Tempo de exposição da imagem: o mesmo ao tempo de exposição para a imagem do gel pré-transferimento</li>
	<li>Remova o gel da bandeja de amostra e, em seguida, imagine a mancha(Figura 1C)com as seguintes configurações. Mantenha a mancha molhada com algumas gotas de água ou TBST ao fotografar. Aplicação: mancha sem manchas Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas</li>
	<li>Remova a membrana de manchas da bandeja de amostra e coloque-a em um recipiente com TBST (0,1% Interpol 20 em TBS).</li>
</ol>6. Incubação de anticorpos
<ol><li>Bloqueie colocando a mancha em uma solução de 3% de gêrio bovino (BSA) em TBST na temperatura da sala por 1 hora.</li>
	<li>Incubar a mancha durante a noite a 4 °C na solução contendo anticorpo primário do rato levantado contra a proteína alvo e o anticorpo primário do coelho levantado contra a segunda proteína alvo.</li>
	<li>Despeje a solução contendo o anticorpo primário. Em seguida, lave a mancha agitando em 20 ml de TBST por 5 min. Repita 4x para um total de 5 lavagens.</li>
	<li>Incubar por 1 hora na temperatura da sala na solução de anticorpos secundários contendo um anticorpo anti-rato de cabra conjugado Dylight 650 e um anticorpo dylight 549 de anti-coelho de cabra conjugado.</li>
	<li>Despeje a solução contendo o anticorpo primário. Em seguida, lave a mancha agitando em 20 ml de TBST por 5 min. Repita 4x para um total de 5 lavagens.</li>
</ol>7. Análise de imagens e dados por Software de Laboratório de Imagens- Normalização total da proteína (~5 min)
<ol><li>Adquira uma imagem fluorescente multiplexal da mancha(Figura 1E)abrindo um novo protocolo multicanal, configure três canais fluorescentes e execute o protocolo. Canal 1: Aplicação: blot Dylight 650 Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas Canal 2: Aplicação: blot Dylight 549 Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas Canal 3: Aplicação: mancha sem manchas Área de imagem: critério gel Tempo de exposição de imagem: automaticamente otimizado para as bandas mais intensas</li>
	<li>Clique no ícone De normalização da Caixa de Ferramentas de Análise e clique em Sim para detectar faixas e bandas.</li>
	<li>Selecione e use "ferramentas de faixas e bandas" para fazer ajustes nas pistas e bandas, se necessário.</li>
	<li>Selecione a imagem livre de manchas como o canal de normalização.</li>
	<li>Selecione as Ferramentas de Análise de MW e atribua as faixas padrão MW verificando as caixas abaixo delas.</li>
	<li>Para visualizar os volumes normalizados, clique na Tabela de Análise na barra de ferramentas. Todos os cálculos serão realizados automaticamente pelo software, incluindo o Fator de Normalização e Volumes Normalizados. Os valores de intensidade da banda proteica alvo são agora ajustados para a variação da carga proteica. Isso permitirá comparações precisas de proteínas-alvo entre as amostras.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

Os autores, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond e Ning Liu são funcionários da Bio-Rad Laboratories, Inc.

O protocolo V3 sem manchas descrito acima é para multiplexagem fluorescente de manchas ocidentais. Também pode ser aplicado em manchas ocidentais usando detecção de chemiluminescente. No protocolo de manchas ocidentais fluorescentes multiplex, as imagens de manchas sem manchas são adquiridas em dois pontos de tempo: 1) logo após a transferência de proteínas; 2) na etapa de imagem fluorescente multiplex após a incubação de anticorpos. A primeira imagem livre de manchas é usada para calcular a eficiência da transferência e a segunda imagem livre de manchas é usada como controle de carregamento. Quando o método quimiomiminescente é aplicado, não é possível tomar uma imagem multiplex para os sinais de proteína sem manchas e alvo, porque o sinal quimiluminescente vai aparecer no canal livre de manchas também. Neste caso, recomendamos usar a imagem livre de manchas tirada logo após a etapa de transferência de proteínas para análise de controle de carga e normalização.
O fluxo de trabalho ocidental V3 fornece os seguintes benefícios únicos em comparação com o fluxo de trabalho tradicional da mancha ocidental que usa proteínas de limpeza como controles de carregamento:
Em primeiro lugar, o fluxo de trabalho V3 fornece um controle de carregamento prático, conveniente e mais confiável para validar as mudanças no nível da proteína de interesse. O protocolo V3 utiliza um controle total de carga de proteínas para normalizar o nível da proteína de interesse medida em cada amostra. Evita duas armadilhas de usar as proteínas de limpeza como controles de carga: imunodelocção saturada e níveis inconsistentes de expressão de proteínas de limpeza entre as amostras em determinadas condições experimentais. Passos de descascamento e remas com anticorpos direcionados contra a limpeza não são mais necessários. Usando a tecnologia sem manchas, não há necessidade de manchar e desfochar uma mancha com manchas como Coomassie ou Sypro Ruby para medição total de proteínas. Leva apenas alguns segundos para adquirir uma imagem manchada e cerca de 5 minutos para fazer a normalização total da proteína usando o software Image Lab.
Em segundo lugar, o fluxo de trabalho V3 permite que os cientistas assumam melhor controle do procedimento ocidental porque torna o procedimento mais transparente e introduz vários pontos de verificação para controle de qualidade. Com a ajuda da tecnologia sem manchas, os pesquisadores podem visualizar suas amostras de proteínas tanto no gel quanto na mancha. Os cientistas podem avaliar a integridade da amostra de proteínas (degradada ou não), qualidade de separação (precipitada ou não), eficiência de transferência e qualidade de transferência (mesmo transferência ou não). Esses pontos de verificação ajudam as pesquisas a encerrar o experimento ao ver grandes falhas no processo e evitar o tempo desperdiçado em amostras e manchas ruins. Essa tecnologia também ajuda os cientistas a avaliar se há uma quantidade significativa de perda de proteína após a desmontagem da membrana e se a mancha é adequada para rerobetar um alvo diferente 4.
Aqui estão algumas dicas para garantir boa experiência e dados de qualidade usando o fluxo de trabalho ocidental V3.
<ol><li>Imagem do gel imediatamente após a execução do gel. Não mergulhe o gel em nenhum tampão antes da primeira imagem no procedimento, pois pode lavar o composto da mancha.</li>
	<li>Use a mesma área de imagem para adquirir todas as imagens no protocolo. Isso permitirá que o software sobreponha imagens para análise de dados, como a normalização total da proteína.</li>
	<li>Mantenha o tempo de exposição consistente ao fotografar os géis pré-transferência e pós-transferência. Isso permitirá que o software meça quantitativamente a eficiência de transferência.</li>
	<li>Mantenha a membrana molhada com algumas gotas de água ou TBST ao adquirir a imagem da mancha. Isso evitará possíveis problemas de fundo sujo para detecção de proteínas de destino.</li>
	<li>Use membrana PVDF fluorescente de baixa fluorescente para multiplexar a mancha ocidental fluorescente.</li>
</ol>É importante notar que a molécula livre de manchas após a ativação uv está irreversivelmente ligada aos resíduos do triptofano. Esta modificação irreversível pode afetar potencialmente o reconhecimento de antígenos ao usar anticorpos monoclonais se o epítope contiver triptofano. Anticorpos policlonais são improváveis de serem afetados porque reconhecem vários epítopos no antígeno. Moléculas sem manchas são facilmente lavadas do gel e da membrana e, portanto, não interferirão com interações anticorpo-antígeno.
Em conclusão, o fluxo de trabalho ocidental V3 torna o processo de mancha ocidental mais rápido, mais transparente, quantitativo e mais confiável. Os pesquisadores agora podem facilmente aplicar o controle total de carga de proteínas em um experimento de mancha ocidental para tornar seus dados mais confiáveis. O fluxo de trabalho livre de manchas V3 foi adotado por vários laboratórios, e suas publicações demonstraram que os periódicos aceitam dados livres de manchas como controle de carregamento na mancha ocidental22,17,7,8,5,23,18,15.

A mancha ocidental é uma técnica muito útil9, no entanto, há dois grandes desafios com a mancha ocidental: processo intensivo de longa e trabalho e qualidade dos dados. Um protocolo tradicional requer cerca de 2 dias. Envolve muitas etapas, incluindo preparação de amostras, fundição de gel, eletroforese e transferência de proteínas, bloqueio de membrana seguido de incubação de anticorpos, imagem e muitas vezes descascando, reprobing e, finalmente, análise de dados. Ao longo desse processo, não há ferramentas confiáveis e flexíveis para o controle de processos. Como tal, erros podem ser introduzidos a cada etapa, e esses erros têm o potencial de gerar artefatos de dados; portanto, os controles de carregamento são essenciais na mancha ocidental para identificar e corrigir os erros. O controle de carregamento é geralmente feito verificando o nível de proteína de uma proteína de referência em cada amostra para ver se ela é igualmente apresentada. As pessoas geralmente usam proteínas de limpeza, como β-actin, β-tubulin, GAPDH, como controle de carga. 
A qualidade dos dados de manchas ocidentais depende do controle de carregamento confiável. Mas há duas preocupações legítimas ao usar proteínas de limpeza para controles de carregamento: 1) a imunodesinação à base de anticorpos das bandas de proteínas de limpeza são frequentemente saturadas e, portanto, não se pode distinguir as diferenças de carregamento entre as amostras30; 2) o nível de expressão proteica de limpeza pode variar nas amostras em determinadas condições experimentais , por exemplo, tratamento siRNA, morte celular, diferenciação celular, etc.11,28,3,6,10,21. Devido a essas preocupações, as revistas científicas estão exigindo agora que "para comparações quantitativas, reagentes apropriados, controles e métodos de imagem com faixas de sinal lineares devem ser usados" (Diretriz da Natureza). Da mesma forma, editores do Journal of Clinical Investigation estão pedindo controles de carregamento mais confiáveis24. Por essas razões, uma proteína de limpeza precisa ser validada para ser usada como controle de carga. Primeiro, é preciso certificar-se de que ele é medido na faixa dinâmica linear do método de imunodeseção14,29. Em segundo lugar, é preciso ter certeza de que se expressa consistentemente em todas as amostras26,31,25,19,20.
Uma solução alternativa para um controle de carregamento confiável é usar a medição total da proteína a partir da mancha. Alguns pesquisadores mancharam as manchas com manchas totais de proteínas, como Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S e tecnologia livre de manchas, para medir o sinal total de proteína em cada pista como controle de carga16,20,13,27,1,4,12. O controle total de carga de proteínas evita as armadilhas associadas às proteínas de limpeza. Primeiro, é um verdadeiro reflexo da quantidade de proteína carregada para cada amostra. Em segundo lugar, a mancha de proteína total apresenta excelente alcance dinâmico linear na faixa de carga comum para análise de manchas ocidentais (10-50 μg de proteína de uma célula complexa) e diferencia com precisão a diferença de carga entre as amostras12.
A tecnologia sem manchas é um novo método de coloração total de proteínas onde um composto único é misturado em solução de gel de acrilamida e distribuído uniformemente no gel fundido. Após a eletroforese ser concluída, o gel é exposto à luz UV por um mínimo de 1 min para que o composto da mancha reaja com os resíduos do triptofano na proteína. As proteínas tornam-se excitáveis sob a luz UV para dar um forte sinal fluorescente que pode ser visualizado e quantificado em um imager habilitado sem manchas, como o sistema De MP ChemiDoc. O composto livre de manchas em si, no entanto, não absorve a luz UV, resultando em baixo fundo da imagem do gel. A modificação dos resíduos do triptofano é irreversível e as proteínas podem ser visualizadas não apenas no gel, mas também na mancha a qualquer momento após a transferência de proteínas.
A tecnologia sem manchas é aplicada no V3 Western Workflow (Figura 1) para lidar com as principais reclamações sobre o fluxo de trabalho tradicional, especialmente as preocupações com o uso de proteínas de limpeza como controles de carregamento. Usando este fluxo de trabalho, pode-se: 1) executar um gel em cerca de 20-30 min, 2) verificar a integridade da amostra e a qualidade da separação de proteínas em 5 minutos após a execução do gel; 3) transferir proteínas em 3-10 min; 4) verificar quantitativamente a eficiência da transferência; e 5) mais importante, validar mudanças no nível da proteína de interesse utilizando controle total de carga de proteínas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

A mancha ocidental é uma técnica de laboratório muito útil e amplamente adotada, mas sua execução é desafiadora. O fluxo de trabalho é frequentemente caracterizado como uma "caixa preta" porque um experimentalista não sabe se foi realizado com sucesso até o último de várias etapas. Além disso, a qualidade dos dados de manchas ocidentais às vezes é desafiada devido à falta de ferramentas eficazes de controle de qualidade em vigor em todo o processo de mancha ocidental. Aqui descrevemos o fluxo de trabalho ocidental V3, que aplica tecnologia livre de manchas para lidar com as principais preocupações associadas ao protocolo tradicional de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite aos pesquisadores: 1) executar um gel em cerca de 20-30 min; 2) visualizar a qualidade da separação da amostra dentro de 5 minutos após a execução do gel; 3) transferir proteínas em 3-10 min; 4) verificar quantitativamente a eficiência da transferência; e, mais importante, 5) para validar mudanças no nível da proteína de interesse usando controle total de carga de proteínas. Esta nova abordagem elimina a necessidade de descascar e repiar a mancha para proteínas de limpeza como β-actin, β-tubulin, GAPDH, etc. O fluxo de trabalho livre de manchas V3 torna o processo de mancha ocidental mais rápido, transparente, mais quantitativo e confiável.

1. Avaliação da integridade da amostra, qualidade de separação de proteínas e eficiência de transferência com imagens de gel sem manchas.
O extrato de proteína das células HeLa foi separado a 300 V por 20 minutos em um gel sem manchas Criterion AnyKD TGX de 18 poços. As amostras de proteína foram carregadas 3x em quatro quantidades diferentes (Faixas 1-3, 40 μg; Pistas 4-6, 30 μg; Pistas 7-9, 20 μg; Pistas 10-12, 10 μg). O gel foi ativado sob luz UV por 1 min. A Figura 2A mostra a imagem em gel adquirida logo após a separação da proteína. A integridade da amostra de proteínas (por exemplo, a degradação) e a qualidade da separação(por exemplo, precipitação proteica) podem ser avaliadas visualmente com esta imagem em gel. As proteínas foram então transferidas por 7 minutos para uma membrana de nitrocelulose usando Trans-Blot Turbo. A Figura 2B mostra a imagem sem manchas do gel pós-transferência. Ambas as imagens foram adquiridas com o mesmo tempo de exposição (6,8 seg). As faixas 3 e 12 foram selecionadas para medir a eficiência da transferência. Usando a ferramenta de volume no software Image Lab, uma caixa retangular (azul) foi desenhada para cobrir as faixas 3 e 12 em ambas as imagens em gel. O cálculo baseado nos valores de volume dessas caixas indicou que a eficiência de transferência de ambas as pistas foi de 80% (Figura 2C). Neste experimento, o gel AnyKD TGX foi selecionado para estudar proteínas-alvo de pequeno a médio porte e não foi otimizado para a transferência de grandes proteínas. Otimizar a eficiência de transferência exigiria o uso de gel percentual mais baixo (por exemplo, 4-20%) e/ou um ajuste do tempo de transferência para facilitar a transferência de grandes proteínas. 2. O controle total de carga de proteínas sem manchas é uma alternativa confiável ao controle de carregamento de limpeza em manchas ocidentais para quantificar uma pequena mudança no nível de proteína de interesse.
MCM-7 é um fator de replicação de licenciamento de DNA, o nível que diminui em 20-50% nas linhas celulares linfoblasteroides (LCL) após o tratamento de irradiação. Neste experimento, as culturas de linha linfórica tratada por lymphoblastóide (LCL) foram separadas em um gel sem manchas Criterion AnyKD TGX de 12 poços. O gel foi ativado por 1 min sob luz UV e transferido pela Trans-Blot Turbo para uma membrana PVDF para imunoblotação. A proteína de limpeza GAPDH (verde) foi sondada com um anticorpo de coelho (Cell Signaling Technology, EUA, 1:2.500) e um anticorpo anti-coelho de cabra conjugado Dylight 549 (Rockland, EUA, 1:20.000). A proteína de interesse MCM-7 (vermelho) foi sondada usando um anticorpo de rato (Abcam, EUA, 1:1.000) e um anticorpo anti-rato de cabra conjugado Dylight 649 (Rockland, 1:10.000).
A Figura 3A mostra uma imagem fluorescente multiplex de proteínas totais (azuis), MCM-7 (vermelho) e GAPDH (verde) detectadas em quatro amostras de LCL tratadas de controle e irradiação. Figura 3B é uma imagem livre de manchas da mesma mancha que mostra os padrões totais de proteína em cada amostra (30 μg). O software de laboratório de imagens selecionou as faixas de amostra (caixas azuis) para medir o MCM-7, GAPDH e o volume total de proteínas em cada pista. Os níveis de MCM-7 foram normalizados tanto em relação à medição total de proteínas livres de manchas quanto contra gapdh. Os níveis de proteína MCM-7 normalizados foram analisados estatisticamente e o volume médio da faixa proteica MCM-7 e o desvio padrão (n=4) são apresentados no gráfico (Figura 3C). Ambos os métodos de normalização revelaram uma pequena diminuição (cerca de 25%) nos níveis de proteína MCM-7 após o tratamento de irradiação. Os dados com a normalização total da proteína apresentaram um desvio padrão menor do que o do GAPDH como controle de carregamento.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figura 1. V3 Western Workflow. O fluxo de trabalho V3 é retratado na coluna esquerda em 4 passos. Os principais instrumentos e reagentes utilizados no fluxo de trabalho são mostrados a cada etapa. O tempo estimado para cada etapa também está incluído. A coluna direita mostra que um mínimo de 4 imagens podem ser geradas no fluxo de trabalho V3. Descreve-se o uso de cada pedaço de dados. As imagens sem manchas do gel de pré-transferência, do gel pós-transferência e da mancha (A, B, C) não podem ser geradas facilmente com as técnicas tradicionais de manchas ocidentais; Essas imagens e dados fornecem informações importantes e pontos de verificação ao longo do procedimento para melhorar o controle e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho da mancha ocidental. Os sinais proteicos alvo podem ser capturados em uma imagem de mancha quimiuminescente(D)se um anticorpo secundário conjugado por HRP foi aplicado na detecção ou em uma imagem de mancha fluorescente(E)se multiplexar a mancha ocidental fluorescente foi realizada para detectar mais de uma proteína alvo simultaneamente na mesma mancha. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figura 2. Imagens livres de manchas de géis de pré-transferência e pós-transferência no fluxo de trabalho ocidental V3 para avaliar a integridade da amostra, a qualidade da separação e a eficiência da transferência. (A) Imagem sem manchas de gel pré-transferimento. (B) Imagem sem manchas de gel pós-transferência. (C) Medição da eficiência da transferência de proteínas.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figura 3. Comparando a medição total de proteínas sem manchas com a imunodesetocção GAPDH como controles de carga para normalizar o nível de proteína de interesse. (A) Imagem fluorescente da mancha ocidental. (B) Imagem de mancha livre de manchas. (C) Níveis de proteína MCM-7 normalizados. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

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V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3 workflow é um procedimento de mancha ocidental usando géis livres de manchas. A tecnologia sem manchas permite aos pesquisadores visualizar a qualidade da separação de proteínas, verificar a eficiência da transferência e, o mais importante, validar a mudança na proteína de interesse usando a quantificação total da proteína como um controle de carregamento confiável.

Fluxo de trabalho livre de manchas V3 para um controle prático, conveniente e confiável de carregamento total de proteínas em blotting ocidental

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K visualizações.  Bio-Rad Laboratories. V3 workflow é um procedimento de mancha ocidental usando géis livres de manchas. A tecnologia sem manchas permite aos pesquisadores visualizar a qualidade da separação de proteínas, verificar a eficiência da transferência e, o mais importante, validar a mudança na proteína de interesse usando a quantificação total da proteína como um controle de carregamento confiável.

Vídeo: V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Biologia

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

O Ladder Rung Walking Tarefa: um sistema de pontuação e sua aplicação prática.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Um fluxo de trabalho Análise Quantitativa de Fitness

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

Um método prático e inovador para extrair DNA genômico de Kits de coleta de sangue para Preservação Plasma Protein

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Um Guia Prático para Phylogenetics para não especialistas

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...