Os autores agradecem ao Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi e Jeff Durban por sua revisão crítica e edição deste manuscrito. Os autores também agradecem a Allison Schwartz pelo apoio técnico.

1. Preparação da amostra de proteína
(Descreve-se um procedimento típico para extrair proteínas da cultura celular)
<ol><li>Coloque o prato de cultura de células HeLa no gelo e lave as células com soro fisiológico tris-tamponado (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspire a TBS, depois adicione 1 ml por 100 mm de tampão RIPA gelado (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% SDS) complementado com fosfatase e inibidores de protease.</li>
	<li>Raspar células aderentes do prato usando um raspador de células plásticas frias; transfira suavemente a suspensão celular para um tubo de microcentrifuge pré-cozido.</li>
	<li>Mantenha a agitação constante por 30 min a 4 °C em um rotador.</li>
	<li>Gire a 16.000 x g por 20 min em uma centrífuga pré-identificada de 4 °C.</li>
	<li>Retire suavemente o tubo da centrífuga e coloque no gelo. Transfira o supernatante para um tubo fresco mantido no gelo, e descarte a pelota.</li>
	<li>Remova um pequeno volume (10-20 μl) de lysate para realizar um ensaio proteico. Determine a concentração de proteína para cada amostra usando o kit de ensaio RC DC.</li>
	<li>Se necessário, aliquot as amostras de proteína para armazenamento a longo prazo a -20 °C. Ciclos de congelamento e degelo repetidos causam degradação proteica e devem ser evitados.</li>
	<li>Pegue cerca de 20 μg de cada amostra, adicione um volume igual de 2x Tampão amostral de Laemmli (4% SDS, 10% 2-mercaptoetanol, 20% glicerol, 0,004% azul bromofenol, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8).</li>
	<li>Aqueça cada célula em tampão de amostra a 95 °C por 5 min.</li>
	<li>Centrífuga a 16.000 x g em uma microcentrifuagem por 1 min.</li>
</ol>2. Eletroforese de gel com Géis livres de manchas (~30 min)
<ol><li>Pegue um critério TGX Qualquer gel pré-moldado sem manchas KD (um gel de formato midi), remova o pente e a fita da parte inferior do.</li>
	<li>Coloque o na célula Critério e encha a câmara tampão superior integrada com tampão de corrida de 60 ml (25 mM Tris, 190 mM de gliccina, 0,1% SDS, pH 8.3). Enxágüe os poços com tampão de corrida.</li>
	<li>Encha cada metade do tanque tampão inferior com 400 ml de tampão de corrida até a linha de enchimento marcada.</li>
	<li>Carregue as amostras de proteínas e marcadores proteicos apropriados.</li>
	<li>Coloque a tampa sobre o tanque, alinhando os plugues de banana codificados por cores com tomadas correspondentes na tampa.</li>
	<li>Execute o gel por ~30 min a 200 V ou 20 min a 300 V.</li>
</ol>3. Imagem de gel sem manchas usando o sistema Chemidoc MP para verificar a qualidade da separação da proteína (~5 min)
<ol><li>Remova o de gel da célula. Use a ferramenta de abertura de de gel na tampa Criterion Cell para abrir o e soltar o gel.</li>
	<li>Aplique um par de mililitros de água no centro da bandeja de amostras UV do imager ChemiDoc MP. Levante cuidadosamente o gel do e coloque-o na bandeja.</li>
	<li>Inicie o software Image Lab e capture a imagem em gel sem manchas(Figura 1A)com as seguintes configurações: Aplicação: gel sem manchas Tempo de ativação do gel: 1 min Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas</li>
	<li>Remova o gel da bandeja de amostra e proceda imediatamente para transferir a etapa.</li>
</ol>4. Transferência de proteína com o Sistema Turbo Trans-Blot (~10 min)
<ol><li>Abra um pacote de transferência Trans-Blot Turbo Midi PVDF; coloque a pilha inferior (que inclui a membrana) na base do de transferência.</li>
	<li>Coloque o gel em cima da membrana, coloque a pilha superior no gel e passe bolhas.</li>
	<li>Coloque a tampa na base do e gire o mostrador para bloqueá-la.</li>
	<li>Insira o na baia da mancha.</li>
	<li>Inicie a transferência selecionando um programa Turbo predefinido e escolhendo o tamanho do gel Critério (midi) e, em seguida, pressione RUN. Uma corrida típica leva apenas 7 minutos.</li>
	<li>Quando a transferência acabar, desmonte o sanduíche de manchas e coloque tanto a mancha quanto o gel em um recipiente com água deionizada.</li>
</ol>5. Imagem de gel e manchas sem manchas usando o sistema Chemidoc MP para verificar a eficiência e a qualidade da transferência de proteínas (~5 minutos)
<ol><li>Coloque o gel pós-transferência na bandeja de amostra do imager ChemiDoc MP.</li>
	<li>Inicie o software Image Lab e capture a imagem sem manchas do gel pós-transferência (Figura 1B)com as seguintes configurações: Aplicação: gel sem manchas Tempo de ativação do gel: nenhum Área de imagem: gel critério Tempo de exposição da imagem: o mesmo ao tempo de exposição para a imagem do gel pré-transferimento</li>
	<li>Remova o gel da bandeja de amostra e, em seguida, imagine a mancha(Figura 1C)com as seguintes configurações. Mantenha a mancha molhada com algumas gotas de água ou TBST ao fotografar. Aplicação: mancha sem manchas Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas</li>
	<li>Remova a membrana de manchas da bandeja de amostra e coloque-a em um recipiente com TBST (0,1% Interpol 20 em TBS).</li>
</ol>6. Incubação de anticorpos
<ol><li>Bloqueie colocando a mancha em uma solução de 3% de gêrio bovino (BSA) em TBST na temperatura da sala por 1 hora.</li>
	<li>Incubar a mancha durante a noite a 4 °C na solução contendo anticorpo primário do rato levantado contra a proteína alvo e o anticorpo primário do coelho levantado contra a segunda proteína alvo.</li>
	<li>Despeje a solução contendo o anticorpo primário. Em seguida, lave a mancha agitando em 20 ml de TBST por 5 min. Repita 4x para um total de 5 lavagens.</li>
	<li>Incubar por 1 hora na temperatura da sala na solução de anticorpos secundários contendo um anticorpo anti-rato de cabra conjugado Dylight 650 e um anticorpo dylight 549 de anti-coelho de cabra conjugado.</li>
	<li>Despeje a solução contendo o anticorpo primário. Em seguida, lave a mancha agitando em 20 ml de TBST por 5 min. Repita 4x para um total de 5 lavagens.</li>
</ol>7. Análise de imagens e dados por Software de Laboratório de Imagens- Normalização total da proteína (~5 min)
<ol><li>Adquira uma imagem fluorescente multiplexal da mancha(Figura 1E)abrindo um novo protocolo multicanal, configure três canais fluorescentes e execute o protocolo. Canal 1: Aplicação: blot Dylight 650 Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas Canal 2: Aplicação: blot Dylight 549 Área de imagem: gel critério Tempo de exposição de imagens: otimizado automaticamente para as bandas mais intensas Canal 3: Aplicação: mancha sem manchas Área de imagem: critério gel Tempo de exposição de imagem: automaticamente otimizado para as bandas mais intensas</li>
	<li>Clique no ícone De normalização da Caixa de Ferramentas de Análise e clique em Sim para detectar faixas e bandas.</li>
	<li>Selecione e use "ferramentas de faixas e bandas" para fazer ajustes nas pistas e bandas, se necessário.</li>
	<li>Selecione a imagem livre de manchas como o canal de normalização.</li>
	<li>Selecione as Ferramentas de Análise de MW e atribua as faixas padrão MW verificando as caixas abaixo delas.</li>
	<li>Para visualizar os volumes normalizados, clique na Tabela de Análise na barra de ferramentas. Todos os cálculos serão realizados automaticamente pelo software, incluindo o Fator de Normalização e Volumes Normalizados. Os valores de intensidade da banda proteica alvo são agora ajustados para a variação da carga proteica. Isso permitirá comparações precisas de proteínas-alvo entre as amostras.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aldridge, G. M., Podrebarac, D. M., Greenough, W. T., Weiler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+total+protein+stains+as+loading+controls:+an+alternative+to+high-abundance+single-protein+controls+in+semi-quantitative+immunoblotting.">The use of total protein stains as loading controls: an alternative to high-abundance single-protein controls in semi-quantitative immunoblotting.</a> J. Neurosci. Methods. 172 (2), 250-254 (2008).</li><li>Bauer, D. E., Haroutunian, V., McCullumsmith, R. E., Meador-Woodruff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+four+housekeeping+proteins+in+elderly+patients+with+schizophrenia.">Expression of four housekeeping proteins in elderly patients with schizophrenia.</a> J. Neural. Transm. 116 (4), 487-491 (2009).</li><li>Casta&#241;o, Z., Kypta, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+Proteins:+Limitations+as+References+During+Neuronal+Differentiation.">Housekeeping Proteins: Limitations as References During Neuronal Differentiation.</a> Open Neurosci. J. 2, 36-40 (2008).</li><li>Colella, A. D., Chegenii, N., Tea, M. N., Gibbins, I. L., Williams, K. A., Chataway, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal. Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Cully, T. R., Edwards, J. N., Friedrich, O., Stephenson, D. G., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+plasma+membrane+Ca-ATPase+and+stromal+interacting+molecule+1+expression+levels+for+Ca2++signaling+in+dystrophic+mdx+mouse+muscle.">Changes in plasma membrane Ca-ATPase and stromal interacting molecule 1 expression levels for Ca2+ signaling in dystrophic mdx mouse muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 303 (5), (2012).</li><li>Dittmer, A., Dittmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-actin+is+not+a+reliable+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Beta-actin is not a reliable loading control in Western blot analysis.</a> Electrophoresis. 27 (14), 2844-2845 (2006).</li><li>Dutka, T. L., Lamboley, C. R., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+carnosine+on+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+in+human+skeletal+muscle+fibers.">Effects of carnosine on contractile apparatus Ca2+ sensitivity and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in human skeletal muscle fibers.</a> J. Appl. Physiol. 112 (5), 728-736 (2012).</li><li>Elliott, S., Busse, L., Swift, S., McCaffery, I., Rossi, J., Kassner, P., Begley, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+expression+and+function+of+erythropoietin+receptors+in+the+kidney.">Lack of expression and function of erythropoietin receptors in the kidney.</a> Nephrol. Dial. Transplant. 27 (7), 2733-2745 (2012).</li><li>Eslami, A., Lujan, J., Western, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting:+Sample+Preparation+to+Detection.">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Ferguson, R. E., Carroll, H. P., Harris, A., Maher, E. R., Selby, P. J., Banks, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+proteins:+a+preliminary+study+illustrating+some+limitations+as+useful+references+in+protein+expression+studies.">Housekeeping proteins: a preliminary study illustrating some limitations as useful references in protein expression studies.</a> Proteomics. 5 (2), 566-571 (2005).</li><li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housekeeping+genes;+expression+levels+may+change+with+density+of+cultured+cells.">Housekeeping genes; expression levels may change with density of cultured cells.</a> J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 76-79 (2010).</li><li>G&#252;rtler, A., Kunz, A., Gomolka, M., Hornhardt, S., Friedl, A. A., McDonald, K., Kohn, J. E., Posch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stain-Free+Technology+as+Normalization+Tool+in+Western+Blot+Analysis.">Stain-Free Technology as Normalization Tool in Western Blot Analysis.</a> Anal. Biochem. 433 (2), 105-111 (2013).</li><li>Hagiwara, M., Kobayashi, K., Tadokoro, T., Yamamoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+SYPRO+Ruby-+and+Flamingo-stained+polyacrylamide+gels+to+Western+blot+analysis.">Application of SYPRO Ruby- and Flamingo-stained polyacrylamide gels to Western blot analysis.</a> Anal. Biochem. 397 (2), 262-264 (2010).</li><li>Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S. E., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+semiquantitative+Western+blot+technique+with+increased+quantification+range.">Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range.</a> J. Immunol. Methods. 345 (1-2), 40-48 (2009).</li><li>Jensen, R. B., Ozes, A., Kim, T., Estep, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kowalczykowski+SC+BRCA2+is+epistatic+to+the+RAD51+paralogs+in+response+to+DNA+damage.">Kowalczykowski SC BRCA2 is epistatic to the RAD51 paralogs in response to DNA damage.</a> DNA Repair. , (2013).</li><li>Lanoix, D., St-Pierre, J., Lacasse, A. A., Viau, M., Lafond, J., Vaillancourt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+proteins+in+human+placenta:+general+protein+stains+are+the+benchmark.">Stability of reference proteins in human placenta: general protein stains are the benchmark.</a> Placenta. 33 (3), 151-156 (2012).</li><li>Larkins, N. T., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influences+of+temperature,+oxidative+stress,+and+phosphorylation+on+binding+of+heat+shock+proteins+in+skeletal+muscle+fibers.">Influences of temperature, oxidative stress, and phosphorylation on binding of heat shock proteins in skeletal muscle fibers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 3 (6), (2012).</li><li>Laurie, K. J., Dave, A., Straga, T., Souzeau, E., Chataway, T., Sykes, M. J., Casey, T., Teo, T., Pater, J., Craig, J. E., Sharma, S., Burdon, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Oligomerization+Disrupting+Mutation+in+CRY&#913;A+Associated+with+Congenital+Cataract+in+a+South+Australian.">Identification of a Novel Oligomerization Disrupting Mutation in CRY&#913;A Associated with Congenital Cataract in a South Australian.</a> , (2012).</li><li>Li, X., Bai, H., Wang, X., Li, L., Cao, Y., Wei, J., Liu, Y., Liu, L., Gong, X., Wu, L., Liu, S., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+rice+reference+proteins+for+western+blotting.">Identification and validation of rice reference proteins for western blotting.</a> J. Exp. Bot. 62 (14), 4763-4772 (2011).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">Beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> J. Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Lowe, D. A., Degens, H., Chen, K. D., Alway, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+varies+with+age+in+glycolytic+muscles+of+rats.">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase varies with age in glycolytic muscles of rats.</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 55 (3), 160-164 (2000).</li><li>Mollica, J. P., Dutka, T. L., Merry, T. L., Lamboley, C. R., McConell, G. K., McKenna, M. J., Murphy, R. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-glutathionylation+of+troponin+I+(fast)+increases+contractile+apparatus+Ca2++sensitivity+in+fast-twitch+muscle+fibres+of+rats+and+humans.">S-glutathionylation of troponin I (fast) increases contractile apparatus Ca2+ sensitivity in fast-twitch muscle fibres of rats and humans.</a> J. Physiol. 590, 1443-1463 (2012).</li><li>Murphy, R. M., Dutka, T. L., Horvath, D., Bell, J. R., Delbridge, L. M., Lamb, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ca2+-dependent Proteolysis of Junctophilin 1 and Junctophilin 2 in Skeletal and Cardiac. 591, 719-729 (2012).</li><li>Neill, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+Data+are+not+created+Equal.">All Data are not created Equal.</a> J. Clin. Invest. 119, 224 (2009).</li><li>P&#233;rez-P&#233;rez, R., L&#243;pez, J. A., Garc&#237;a-Santos, E., Camafeita, E., G&#243;mez-Serrano, M., Ortega-Delgado, F. J., Ricart, W., Fern&#225;ndez-Real, J. M., Peral, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+suitable+reference+proteins+for+expression+studies+in+human+adipose+tissue+with+relevance+to+obesity.">Uncovering suitable reference proteins for expression studies in human adipose tissue with relevance to obesity.</a> PLoS One. 7 (1), (2012).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+Pitfalls+of+Internal+Controls:+Validation+of+Reference+Genes+for+Analysis+by+qRT-PCR+and+Western+Blot+throughout+Rat+Retinal+Development.">Avoiding Pitfalls of Internal Controls: Validation of Reference Genes for Analysis by qRT-PCR and Western Blot throughout Rat Retinal Development.</a> PLoS One. 7 (8), (2012).</li><li>Romero-Calvo, I., Oc&#243;n, B., Mart&#237;nez-Moya, P., Su&#225;rez, M. D., Zarzuelo, A., Mart&#237;nez-Augustin, O., de Medina, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Ponceau+staining+as+a+loading+control+alternative+to+actin+in+Western+blots.">Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots.</a> Anal. Biochem. 401 (2), 318-320 (2010).</li><li>Said, H. M., Polat, B., Hagemann, C., Anacker, J., Flentje, M., Vordermark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+GAPDH+regulation+in+tumor-cells+of+different+origin+under+hypoxic+conditions+in-vitro.">Absence of GAPDH regulation in tumor-cells of different origin under hypoxic conditions in-vitro.</a> BMC Res. Notes. 13 (2), 8 (2009).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative western blots.</a> Exp. Anim. 60 (2), 193-196 (2011).</li><li>Welinder, C., Ekblad, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coomassie+staining+as+loading+control+in+Western+blot+analysis.">Coomassie staining as loading control in Western blot analysis.</a> J. Proteome Res. 10 (3), 1416-1419 (2011).</li><li>You, J., Hodge, C., Wen, L., McAvoy, J. W., Madigan, M. C., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+soybean+trypsin+inhibitor+as+an+external+loading+control+for+Western+blot+analysis+of+tear+proteins:+application+to+corneal+disease.">Using soybean trypsin inhibitor as an external loading control for Western blot analysis of tear proteins: application to corneal disease.</a> Exp. Eye Res. 99, 55-62 (2012).</li></ol>

Os autores, Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond e Ning Liu são funcionários da Bio-Rad Laboratories, Inc.

O protocolo V3 sem manchas descrito acima é para multiplexagem fluorescente de manchas ocidentais. Também pode ser aplicado em manchas ocidentais usando detecção de chemiluminescente. No protocolo de manchas ocidentais fluorescentes multiplex, as imagens de manchas sem manchas são adquiridas em dois pontos de tempo: 1) logo após a transferência de proteínas; 2) na etapa de imagem fluorescente multiplex após a incubação de anticorpos. A primeira imagem livre de manchas é usada para calcular a eficiência da transferência e a segunda imagem livre de manchas é usada como controle de carregamento. Quando o método quimiomiminescente é aplicado, não é possível tomar uma imagem multiplex para os sinais de proteína sem manchas e alvo, porque o sinal quimiluminescente vai aparecer no canal livre de manchas também. Neste caso, recomendamos usar a imagem livre de manchas tirada logo após a etapa de transferência de proteínas para análise de controle de carga e normalização.
O fluxo de trabalho ocidental V3 fornece os seguintes benefícios únicos em comparação com o fluxo de trabalho tradicional da mancha ocidental que usa proteínas de limpeza como controles de carregamento:
Em primeiro lugar, o fluxo de trabalho V3 fornece um controle de carregamento prático, conveniente e mais confiável para validar as mudanças no nível da proteína de interesse. O protocolo V3 utiliza um controle total de carga de proteínas para normalizar o nível da proteína de interesse medida em cada amostra. Evita duas armadilhas de usar as proteínas de limpeza como controles de carga: imunodelocção saturada e níveis inconsistentes de expressão de proteínas de limpeza entre as amostras em determinadas condições experimentais. Passos de descascamento e remas com anticorpos direcionados contra a limpeza não são mais necessários. Usando a tecnologia sem manchas, não há necessidade de manchar e desfochar uma mancha com manchas como Coomassie ou Sypro Ruby para medição total de proteínas. Leva apenas alguns segundos para adquirir uma imagem manchada e cerca de 5 minutos para fazer a normalização total da proteína usando o software Image Lab.
Em segundo lugar, o fluxo de trabalho V3 permite que os cientistas assumam melhor controle do procedimento ocidental porque torna o procedimento mais transparente e introduz vários pontos de verificação para controle de qualidade. Com a ajuda da tecnologia sem manchas, os pesquisadores podem visualizar suas amostras de proteínas tanto no gel quanto na mancha. Os cientistas podem avaliar a integridade da amostra de proteínas (degradada ou não), qualidade de separação (precipitada ou não), eficiência de transferência e qualidade de transferência (mesmo transferência ou não). Esses pontos de verificação ajudam as pesquisas a encerrar o experimento ao ver grandes falhas no processo e evitar o tempo desperdiçado em amostras e manchas ruins. Essa tecnologia também ajuda os cientistas a avaliar se há uma quantidade significativa de perda de proteína após a desmontagem da membrana e se a mancha é adequada para rerobetar um alvo diferente 4.
Aqui estão algumas dicas para garantir boa experiência e dados de qualidade usando o fluxo de trabalho ocidental V3.
<ol><li>Imagem do gel imediatamente após a execução do gel. Não mergulhe o gel em nenhum tampão antes da primeira imagem no procedimento, pois pode lavar o composto da mancha.</li>
	<li>Use a mesma área de imagem para adquirir todas as imagens no protocolo. Isso permitirá que o software sobreponha imagens para análise de dados, como a normalização total da proteína.</li>
	<li>Mantenha o tempo de exposição consistente ao fotografar os géis pré-transferência e pós-transferência. Isso permitirá que o software meça quantitativamente a eficiência de transferência.</li>
	<li>Mantenha a membrana molhada com algumas gotas de água ou TBST ao adquirir a imagem da mancha. Isso evitará possíveis problemas de fundo sujo para detecção de proteínas de destino.</li>
	<li>Use membrana PVDF fluorescente de baixa fluorescente para multiplexar a mancha ocidental fluorescente.</li>
</ol>É importante notar que a molécula livre de manchas após a ativação uv está irreversivelmente ligada aos resíduos do triptofano. Esta modificação irreversível pode afetar potencialmente o reconhecimento de antígenos ao usar anticorpos monoclonais se o epítope contiver triptofano. Anticorpos policlonais são improváveis de serem afetados porque reconhecem vários epítopos no antígeno. Moléculas sem manchas são facilmente lavadas do gel e da membrana e, portanto, não interferirão com interações anticorpo-antígeno.
Em conclusão, o fluxo de trabalho ocidental V3 torna o processo de mancha ocidental mais rápido, mais transparente, quantitativo e mais confiável. Os pesquisadores agora podem facilmente aplicar o controle total de carga de proteínas em um experimento de mancha ocidental para tornar seus dados mais confiáveis. O fluxo de trabalho livre de manchas V3 foi adotado por vários laboratórios, e suas publicações demonstraram que os periódicos aceitam dados livres de manchas como controle de carregamento na mancha ocidental22,17,7,8,5,23,18,15.

A mancha ocidental é uma técnica muito útil9, no entanto, há dois grandes desafios com a mancha ocidental: processo intensivo de longa e trabalho e qualidade dos dados. Um protocolo tradicional requer cerca de 2 dias. Envolve muitas etapas, incluindo preparação de amostras, fundição de gel, eletroforese e transferência de proteínas, bloqueio de membrana seguido de incubação de anticorpos, imagem e muitas vezes descascando, reprobing e, finalmente, análise de dados. Ao longo desse processo, não há ferramentas confiáveis e flexíveis para o controle de processos. Como tal, erros podem ser introduzidos a cada etapa, e esses erros têm o potencial de gerar artefatos de dados; portanto, os controles de carregamento são essenciais na mancha ocidental para identificar e corrigir os erros. O controle de carregamento é geralmente feito verificando o nível de proteína de uma proteína de referência em cada amostra para ver se ela é igualmente apresentada. As pessoas geralmente usam proteínas de limpeza, como β-actin, β-tubulin, GAPDH, como controle de carga. 
A qualidade dos dados de manchas ocidentais depende do controle de carregamento confiável. Mas há duas preocupações legítimas ao usar proteínas de limpeza para controles de carregamento: 1) a imunodesinação à base de anticorpos das bandas de proteínas de limpeza são frequentemente saturadas e, portanto, não se pode distinguir as diferenças de carregamento entre as amostras30; 2) o nível de expressão proteica de limpeza pode variar nas amostras em determinadas condições experimentais , por exemplo, tratamento siRNA, morte celular, diferenciação celular, etc.11,28,3,6,10,21. Devido a essas preocupações, as revistas científicas estão exigindo agora que "para comparações quantitativas, reagentes apropriados, controles e métodos de imagem com faixas de sinal lineares devem ser usados" (Diretriz da Natureza). Da mesma forma, editores do Journal of Clinical Investigation estão pedindo controles de carregamento mais confiáveis24. Por essas razões, uma proteína de limpeza precisa ser validada para ser usada como controle de carga. Primeiro, é preciso certificar-se de que ele é medido na faixa dinâmica linear do método de imunodeseção14,29. Em segundo lugar, é preciso ter certeza de que se expressa consistentemente em todas as amostras26,31,25,19,20.
Uma solução alternativa para um controle de carregamento confiável é usar a medição total da proteína a partir da mancha. Alguns pesquisadores mancharam as manchas com manchas totais de proteínas, como Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S e tecnologia livre de manchas, para medir o sinal total de proteína em cada pista como controle de carga16,20,13,27,1,4,12. O controle total de carga de proteínas evita as armadilhas associadas às proteínas de limpeza. Primeiro, é um verdadeiro reflexo da quantidade de proteína carregada para cada amostra. Em segundo lugar, a mancha de proteína total apresenta excelente alcance dinâmico linear na faixa de carga comum para análise de manchas ocidentais (10-50 μg de proteína de uma célula complexa) e diferencia com precisão a diferença de carga entre as amostras12.
A tecnologia sem manchas é um novo método de coloração total de proteínas onde um composto único é misturado em solução de gel de acrilamida e distribuído uniformemente no gel fundido. Após a eletroforese ser concluída, o gel é exposto à luz UV por um mínimo de 1 min para que o composto da mancha reaja com os resíduos do triptofano na proteína. As proteínas tornam-se excitáveis sob a luz UV para dar um forte sinal fluorescente que pode ser visualizado e quantificado em um imager habilitado sem manchas, como o sistema De MP ChemiDoc. O composto livre de manchas em si, no entanto, não absorve a luz UV, resultando em baixo fundo da imagem do gel. A modificação dos resíduos do triptofano é irreversível e as proteínas podem ser visualizadas não apenas no gel, mas também na mancha a qualquer momento após a transferência de proteínas.
A tecnologia sem manchas é aplicada no V3 Western Workflow (Figura 1) para lidar com as principais reclamações sobre o fluxo de trabalho tradicional, especialmente as preocupações com o uso de proteínas de limpeza como controles de carregamento. Usando este fluxo de trabalho, pode-se: 1) executar um gel em cerca de 20-30 min, 2) verificar a integridade da amostra e a qualidade da separação de proteínas em 5 minutos após a execução do gel; 3) transferir proteínas em 3-10 min; 4) verificar quantitativamente a eficiência da transferência; e 5) mais importante, validar mudanças no nível da proteína de interesse utilizando controle total de carga de proteínas.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>567-8093 </td>
 <td>Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4157 </td>
 <td>Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clarity Western ECL Substrate, 500 ml </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-5061</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Criterion Cell </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>165-6100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-4155</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChemiDoc MP System </td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>170-8280</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

v3 stain-free workflow for a practical, convenient, and reliable total protein loading control in western blotting

A mancha ocidental é uma técnica de laboratório muito útil e amplamente adotada, mas sua execução é desafiadora. O fluxo de trabalho é frequentemente caracterizado como uma "caixa preta" porque um experimentalista não sabe se foi realizado com sucesso até o último de várias etapas. Além disso, a qualidade dos dados de manchas ocidentais às vezes é desafiada devido à falta de ferramentas eficazes de controle de qualidade em vigor em todo o processo de mancha ocidental. Aqui descrevemos o fluxo de trabalho ocidental V3, que aplica tecnologia livre de manchas para lidar com as principais preocupações associadas ao protocolo tradicional de manchas ocidentais. Este fluxo de trabalho permite aos pesquisadores: 1) executar um gel em cerca de 20-30 min; 2) visualizar a qualidade da separação da amostra dentro de 5 minutos após a execução do gel; 3) transferir proteínas em 3-10 min; 4) verificar quantitativamente a eficiência da transferência; e, mais importante, 5) para validar mudanças no nível da proteína de interesse usando controle total de carga de proteínas. Esta nova abordagem elimina a necessidade de descascar e repiar a mancha para proteínas de limpeza como β-actin, β-tubulin, GAPDH, etc. O fluxo de trabalho livre de manchas V3 torna o processo de mancha ocidental mais rápido, transparente, mais quantitativo e confiável.

1. Avaliação da integridade da amostra, qualidade de separação de proteínas e eficiência de transferência com imagens de gel sem manchas.
O extrato de proteína das células HeLa foi separado a 300 V por 20 minutos em um gel sem manchas Criterion AnyKD TGX de 18 poços. As amostras de proteína foram carregadas 3x em quatro quantidades diferentes (Faixas 1-3, 40 μg; Pistas 4-6, 30 μg; Pistas 7-9, 20 μg; Pistas 10-12, 10 μg). O gel foi ativado sob luz UV por 1 min. A Figura 2A mostra a imagem em gel adquirida logo após a separação da proteína. A integridade da amostra de proteínas (por exemplo, a degradação) e a qualidade da separação(por exemplo, precipitação proteica) podem ser avaliadas visualmente com esta imagem em gel. As proteínas foram então transferidas por 7 minutos para uma membrana de nitrocelulose usando Trans-Blot Turbo. A Figura 2B mostra a imagem sem manchas do gel pós-transferência. Ambas as imagens foram adquiridas com o mesmo tempo de exposição (6,8 seg). As faixas 3 e 12 foram selecionadas para medir a eficiência da transferência. Usando a ferramenta de volume no software Image Lab, uma caixa retangular (azul) foi desenhada para cobrir as faixas 3 e 12 em ambas as imagens em gel. O cálculo baseado nos valores de volume dessas caixas indicou que a eficiência de transferência de ambas as pistas foi de 80% (Figura 2C). Neste experimento, o gel AnyKD TGX foi selecionado para estudar proteínas-alvo de pequeno a médio porte e não foi otimizado para a transferência de grandes proteínas. Otimizar a eficiência de transferência exigiria o uso de gel percentual mais baixo (por exemplo, 4-20%) e/ou um ajuste do tempo de transferência para facilitar a transferência de grandes proteínas. 2. O controle total de carga de proteínas sem manchas é uma alternativa confiável ao controle de carregamento de limpeza em manchas ocidentais para quantificar uma pequena mudança no nível de proteína de interesse.
MCM-7 é um fator de replicação de licenciamento de DNA, o nível que diminui em 20-50% nas linhas celulares linfoblasteroides (LCL) após o tratamento de irradiação. Neste experimento, as culturas de linha linfórica tratada por lymphoblastóide (LCL) foram separadas em um gel sem manchas Criterion AnyKD TGX de 12 poços. O gel foi ativado por 1 min sob luz UV e transferido pela Trans-Blot Turbo para uma membrana PVDF para imunoblotação. A proteína de limpeza GAPDH (verde) foi sondada com um anticorpo de coelho (Cell Signaling Technology, EUA, 1:2.500) e um anticorpo anti-coelho de cabra conjugado Dylight 549 (Rockland, EUA, 1:20.000). A proteína de interesse MCM-7 (vermelho) foi sondada usando um anticorpo de rato (Abcam, EUA, 1:1.000) e um anticorpo anti-rato de cabra conjugado Dylight 649 (Rockland, 1:10.000).
A Figura 3A mostra uma imagem fluorescente multiplex de proteínas totais (azuis), MCM-7 (vermelho) e GAPDH (verde) detectadas em quatro amostras de LCL tratadas de controle e irradiação. Figura 3B é uma imagem livre de manchas da mesma mancha que mostra os padrões totais de proteína em cada amostra (30 μg). O software de laboratório de imagens selecionou as faixas de amostra (caixas azuis) para medir o MCM-7, GAPDH e o volume total de proteínas em cada pista. Os níveis de MCM-7 foram normalizados tanto em relação à medição total de proteínas livres de manchas quanto contra gapdh. Os níveis de proteína MCM-7 normalizados foram analisados estatisticamente e o volume médio da faixa proteica MCM-7 e o desvio padrão (n=4) são apresentados no gráfico (Figura 3C). Ambos os métodos de normalização revelaram uma pequena diminuição (cerca de 25%) nos níveis de proteína MCM-7 após o tratamento de irradiação. Os dados com a normalização total da proteína apresentaram um desvio padrão menor do que o do GAPDH como controle de carregamento.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Figura 1. V3 Western Workflow. O fluxo de trabalho V3 é retratado na coluna esquerda em 4 passos. Os principais instrumentos e reagentes utilizados no fluxo de trabalho são mostrados a cada etapa. O tempo estimado para cada etapa também está incluído. A coluna direita mostra que um mínimo de 4 imagens podem ser geradas no fluxo de trabalho V3. Descreve-se o uso de cada pedaço de dados. As imagens sem manchas do gel de pré-transferência, do gel pós-transferência e da mancha (A, B, C) não podem ser geradas facilmente com as técnicas tradicionais de manchas ocidentais; Essas imagens e dados fornecem informações importantes e pontos de verificação ao longo do procedimento para melhorar o controle e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho da mancha ocidental. Os sinais proteicos alvo podem ser capturados em uma imagem de mancha quimiuminescente(D)se um anticorpo secundário conjugado por HRP foi aplicado na detecção ou em uma imagem de mancha fluorescente(E)se multiplexar a mancha ocidental fluorescente foi realizada para detectar mais de uma proteína alvo simultaneamente na mesma mancha. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Figura 2. Imagens livres de manchas de géis de pré-transferência e pós-transferência no fluxo de trabalho ocidental V3 para avaliar a integridade da amostra, a qualidade da separação e a eficiência da transferência. (A) Imagem sem manchas de gel pré-transferimento. (B) Imagem sem manchas de gel pós-transferência. (C) Medição da eficiência da transferência de proteínas.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Figura 3. Comparando a medição total de proteínas sem manchas com a imunodesetocção GAPDH como controles de carga para normalizar o nível de proteína de interesse. (A) Imagem fluorescente da mancha ocidental. (B) Imagem de mancha livre de manchas. (C) Níveis de proteína MCM-7 normalizados. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

Watch this Scientific Journal Video about V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting at JoVE.com

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

V3 workflow é um procedimento de mancha ocidental usando géis livres de manchas. A tecnologia sem manchas permite aos pesquisadores visualizar a qualidade da separação de proteínas, verificar a eficiência da transferência e, o mais importante, validar a mudança na proteína de interesse usando a quantificação total da proteína como um controle de carregamento confiável.

Fluxo de trabalho livre de manchas V3 para um controle prático, conveniente e confiável de carregamento total de proteínas em blotting ocidental

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K visualizações.  Bio-Rad Laboratories. V3 workflow é um procedimento de mancha ocidental usando géis livres de manchas. A tecnologia sem manchas permite aos pesquisadores visualizar a qualidade da separação de proteínas, verificar a eficiência da transferência e, o mais importante, validar a mudança na proteína de interesse usando a quantificação total da proteína como um controle de carregamento confiável.