Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório McMahon por sua assistência e apoio. Esta pesquisa foi apoiada por doações de um R01 CA176839-01 NIH / NCI (a MM) e um Prêmio de Pesquisa Institucional e Acadêmico de Desenvolvimento de Carreira (IRACDA para JS).

1. Preparação de lisados ​​de células inteiras a partir de Cultura de Células <ol><li> Colocar placas de cultura de células em gelo e adiciona-PBS frio, com 5 mM de EDTA (por exemplo, 5 ml de PBS com 5 EDTA/10 mM cm 2 placas). Remover células aderentes do prato usando um raspador de células e, em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml frio. </li><li> Agregar as suspensões de células por centrifugação a baixa velocidade a 1000 rpm (230 xg) durante 5 min a 4 ° C. Colocar os tubos cónicos em gelo e o sobrenadante cuidadosamente aspirado sem perturbar o sedimento. </li><li> Lava-se a pelete com 1 ml de PBS com EDTA 5 mM e transferir a suspensão de células a uma solução fria de 1,5 ml tubo de centrifugação. Suspensão rotação rápida a 13.000 rpm (13.226 xg) por 10 segundos para sedimentar as células. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento e colocar os tubos no gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento em 25-200 ul (dependendo do tamanho da pastilha, ou seja, para 3 x 10 ~ 6 células adicionar 150 ul de tampão de RIPA) nasTampão RIPA (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, NaF 10 mM, SDS a 0,1%, desoxicolato de sódio a 0,5%, 1% de NP-40) contendo a protease adicionada de fresco e inibidores da fosfatase a uma concentração final 2x. Resumidamente vortex cada tubo e incubar a suspensão durante 20-30 minutos em gelo. Nota: existem vários tampões de lise que podem ser utilizados para extrair proteínas, que diferem na sua capacidade para solubilizar as proteínas e força do seu detergente desnaturante (SDS ou seja, Triton X-100, ou NP-40). Tampão RIPA é útil para a preparação de lisados ​​de células inteiras e perturbar interacções proteína-proteína. </li><li> Para criar uma fracção pós-nuclear, lisados ​​de centrífuga a 14.000 rpm (15.339 xg) por 5 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo, sem perturbar o sedimento e colocar tubos enriquecido-nucleares em gelo. Nota: o pellet nuclear enriquecido também pode separar o tubo ao extrair o sobrenadante. Para evitar a cobrança do pellet-enriquecido nuclear, coloque a ponta da pipeta directamente into a pelota enriquecido nuclear viscoso e desenhar-se com a pipeta, a fim de eliminá-lo. </li><li> Determinar as concentrações de proteína de cada amostra de acordo com as instruções do fabricante, utilizando tais ensaios de quantificação de proteína de BCA ou Bradford. </li></ol> 2. Preparação de amostras e Eletroforese <ol><li> Prepare cada amostra de acordo com o gráfico a seguir descritos abaixo. Como uma alternativa, β-mercaptoetanol também pode ser utilizado a uma concentração final de 2,5%. No entanto, o agente redutor deve ser adicionado a cada amostra até uma hora antes de carregar no gel. O total de contas de volume para variações de pipetagem com apenas 20 mL de cada amostra preparada carregado por poço. <table border="1"><tbody><tr><td> REAGENTES </td><td> Amostra reduzida </td></tr><tr><td> Amostra Proteína </td><td> X mL </td></tr><tr><td> 4x LDS Sample Buffer </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> 500 nM TDT Reducing Agent </td><td> 2,4 mL </td></tr><tr><td> Água Desionizada </td><td> Até 15,6 mL </td></tr><tr><td> Volume Total </td><td> 24 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Amostras de calor a 70 ° C durante 10 min. Enquanto as amostras são o aquecimento, preparar 1.000 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida (50 ml 20x MES ou MOPS tampão de corrida, mais 950 ml de água deionizada). MOPS tampão de corrida resolve proteínas de médio porte entre 14-200 kDa, enquanto MES tampão de corrida resolve proteínas de peso molecular menores entre 2-200 kDa com um pKa inferior, que permite que os MES tampão de corrida para correr mais rápido do que os MOPS 4. Assim, estes dois buffers tenham efeitos contrastantes na migração de iões no interior do gel de empilhamento, que dá origem a diferenças na separação das bandas de proteína de 4. Ponha de lado e combinar 200 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida com 500 mL de antioxidante, que serão utilizados para preencher o buffer Câmara do Min Superiorunidade de eletroforese i-Cell. </li><li> Uma vez que as amostras são terminou de aquecimento, as amostras rápidas de rotação antes de colocá-los em gelo. </li><li> Para a montagem dos pré-moldados géis Bis-Tris para a unidade Mini-Cell para eletroforese de seguir as instruções do fabricante. Nota: certifique-se cada gel é orientado de tal forma que a cassete mais curto (menor) de cada gel é voltado para dentro em direção ao buffer Core e os géis são de nível e firmemente pressionado contra o buffer do núcleo para evitar vazamento do buffer Câmara Alta. </li><li> Preencher o buffer Câmara Alta com os 200 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida contendo o antioxidante eo buffer Câmara da unidade Mini-Cell, com cerca de 600 ml de MES 1x ou MOPS tampão de corrida mais baixo. Os extras 200-300 ml de tampão de corrida pode ser guardado para uso posterior. No entanto, não é recomendado para reciclar o tampão utilizado durante a electroforese de execução como o pH e a qualidade do tampão pode ser alterada. </li><li> Carregar 20 ul de cada proteína SAMPle em cada poço. Se a secção da membrana em várias tiras, a fim de investigar a vários anticorpos (isto é, mais do que 2), é altamente recomendável para carregar 2-5 ul do padrão de proteínas pré-corados nos primeiros e últimos poços de cada gel como este servirá guias de corte para separar os diferentes setores da membrana, sem afetar a imagem das bandas de proteínas. </li><li> Géis executado em 200 V constante por 35 min com uma corrente esperada de 110-125 mA / gel no início e 70-80 mA por gel no final. A electroforese é completa quando o corante de rastreio migra para o fio de platina ao longo do tampão de núcleo. </li></ol> 3. Transferência de proteína Usando o Sistema Blotting iBlot seco <ol><li> Completamente separar os mini-géis por quebrar as laterais colados da cassete (pode produzir um ruído de crepitação). Descartar o prato mais curto (menor) e transferir cuidadosamente o gel a partir do (encaixados) placa mais dentro de um recipiente com água desionizada eremover a porção de espessura de pés do gel localizado na parte inferior. Nota: em casos raros, o gel pode juntar ao prato mais curto em vez do mais, encaixados prato. Neste caso, o descarte, a placa com ranhuras mais e remover a porção de espessura de pés do gel localizado na parte inferior. Em seguida, transferir cuidadosamente o gel a partir da placa mais curta à água desionizada. </li><li> Montar as pilhas de transferência do ânodo e do cátodo de acordo com as instruções do fabricante. Nota: as membranas de nitrocelulose ou PVDF, tanto fornecer alta qualidade e eficiência de transferência das proteínas e são compatíveis com a detecção fluorescente 8. No entanto, a membrana de PVDF tem uma capacidade de ligação mais elevada (240 mg / cm 3) de nitrocelulose (200 ug / cm 3) 8. </li><li> Cuidadosamente remover quaisquer bolhas ou ar preso entre o gel ea membrana, pois isso vai evitar qualquer distorção das bandas de proteínas durante a transferência. Nota: não cortar a membrana ou a transfer empilhar para ajustar seu tamanho gel, pois isso fará com que o contato direto entre o anodo eo catodo stacks. </li><li> Depois de montar corretamente as pilhas de transferência do dispositivo mancha seca, selecione o programa de tensão adequada (ou seja, Programa 3: 20 V para 7 min) e iniciar a transferência. Nota: proteínas maiores que 150 kDa tendem migrar mais lentamente e pode exigir um tempo de transferência de mais de 8-10 min. Além disso, a incubação prévia do gel em 20% de etanol, durante 5-10 min, também vai ajudar a melhorar a eficiência da transferência destas proteínas grandes. Uma vez que o programa de transferência for concluída, o dispositivo desliga-se automaticamente a corrente. É melhor remover imediatamente a membrana e prosseguir com o procedimento de bloqueio para garantir uma melhor detecção de proteínas e evitar ressecamento da membrana. </li></ol> 4. Infravermelho Detecção de Proteína Fluorescente <ol><li> Bloco de membrana (s) num mínimo de 0,8 ml / cm 2 de Odyssey tampão de bloqueio (não adicionar Tween-20) durante 1 hora oudurante a noite a 4 ° C. Membrana (s) podem também ser bloqueados com leite em pó desnatado, no entanto, isto pode provocar maior fundo e interferir com a detecção da proteína. </li><li> Incubar membrana (s) no anticorpo primário para a concentração desejada em tampão de bloqueio Odyssey com 0,1% de Tween-20 durante a noite a 4 ° C. Para a detecção de duas cores, em que dois antigénios diferentes são visualizadas na mesma mancha, os dois anticorpos primários deve ser derivado de diferentes espécies hospedeiras e adicionou-se simultaneamente para a membrana (s). Nota: antes de incubação da membrana (s) de anticorpo primário, a membrana (s) pode ser seccionado em vários pedaços, de modo a sondar para vários anticorpos (isto é, mais do que 2) na mesma membrana. </li><li> Lavar membrana (s) 3x durante 10 minutos em TBS com 0,1% de Tween-20 com agitação suave. </li><li> Incubar membrana (s) com os anticorpos secundários marcados com fluorescência, a uma diluição de 1:20000 para o canal de 700 nm e 1:6,000-1:10,000 para o canal de 800 nm, em Odyssey tampão de bloqueio com 0,1% de Tween-20 durante 30-60 minutos (a incubação da membrana (s) por mais do que 1 hora pode aumentar fundo). Proteger membrana (s) de luz. Nota: os anticorpos secundários devem ser derivada da mesma espécie do hospedeiro uma vez que cada um dos anticorpos primários e marcados com diferentes fluoróforos. </li><li> Lavar membrana (s) 3x durante 10 minutos em TBS com 0,1% de Tween-20 com agitação suave. Proteger membrana (s) de luz. </li><li> Membrana (s) pode ser seco ou armazenado em TBS ou PBS sem Tween-20 a 4 ° C até ser digitalizado e fotografada com um sistema de imagem de infravermelhos. Sinal fluorescente permanecerá estável por vários meses se devidamente protegido contra a luz. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os passos críticos na geração de alta qualidade, transferências de Western quantitativas de acordo com este protocolo, são os seguintes: 1) a medição das concentrações de proteína e 2) a preparação da amostra, 3) o bloqueio da membrana e 4) qualidade e calibre do anticorpo primário. A precisão da medição das concentrações de proteína total podem ter um impacto importante na quantificação bandas de proteínas uma vez que a sensibilidade excepcional de detecção fluoresce...

<html> A técnica de Western blot foi desenvolvido pela primeira vez entre 1977 e 1979, a fim de criar um método melhorado para a detecção de proteínas utilizando anticorpos 1-3. Este procedimento utilizado transferência electroforética de proteínas para membranas de géis de SDS-PAGE com proteínas alvo visualizadas utilizando anticorpos secundários e detectados por auto-radiografia, a luz UV, ou um produto de reacção de peroxidase 3. Assim, estes mesmos princípios básicos são ainda largamente utilizados em protocolos actuais de Western blot. No entanto, essa técnica clássica de Western Blot não apresenta muitas desvantagens, tais como tempos lentos eletroforese funcionamento, baixa resolução e bandas de proteínas artificiais, suscetibilidade à degradação de proteínas e sensibilidade limitada, bem como má qualidade dos dados 4. Portanto, este protocolo descreve avanços significativos e melhorias para o procedimento de Western blot padrão que gera dados qualitativos e quantitativos mais precisos. &quot;&gt; O sistema de Laemmli para separar uma grande variedade de proteínas, utilizando SDS-PAGE, é o sistema de gel mais amplamente utilizado para a transferência de Western 5. Apesar da popularidade do presente sistema de transferência de Western, este método pode resultar na distorção da banda, a perda de resolução, e bandas espúrias 4. Isto pode ser uma consequência de a desaminação e a alquilação das proteínas, devido ao elevado pH (9,5) do gel de separação, a reoxidação de redução de ligações dissulfureto, devido à variação do estado redox do gel, e a clivagem de aspartil-prolil ligações peptídicas, devido ao aquecimento da proteína em tampão Laemmli (pH 5,2) 4,6. O sistema de gel de Bis-Tris, que opera a um pH neutro (7,0), proporciona benefícios significativos sobre o sistema Lamemmli. Este sistema melhora a estabilidade da proteína, minimiza modificações de proteínas, proteínas mantém no seu estado reduzido, impede aspartil-prolil clivagem durante a electroforese, e mais importante, o tempo de electroforese é executado 35 min 4,6,7. Além disso, tsistema de gel ele Bis-Tris também produz bandas nítidas e de alta resolução e separação, e aumento da sensibilidade, resultando em dados mais confiáveis ​​4. Em conjunção com o sistema de gel de Bis-Tris, o sistema de mancha seca iBlot usa força de alto campo e correntes para reduzir significativamente o tempo de transferência de proteínas dos geles para membranas de dentro 8 7 min. Este sistema de transferência é baseado no método de mancha seco que gera uma transferência mais eficiente e fiável de proteínas 8. Para uma comparação detalhada da eficácia do sistema de transferência de iBlot aos sistemas convencionais de transferência, consulte o seguinte site: <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Ele utiliza uma pilha ânodo e cátodo, que são compostas de uma matriz de gel que contém os buffers de transferência adequados, que funcionam como reservatórios de iões 8. Durante a transferência, a eletrólise da água ajuda a evitar a geração de oxigênio a partir do ânodo de cobre, resultando em uma transferência de proteína mais consistente, sem causar distorção banda 8. Além disso, este sistema de transferência também aumenta a velocidade de transferência através da redução da distância entre os eléctrodos 8. Apesar de quimiluminescência é a técnica mais comum e tradicional para a detecção de proteínas de análises de Western blot, duas cores detecção fluorescente no infravermelho melhora a sensibilidade, qualidade e precisão dos dados de Western blot. Este método de detecção utiliza excitação laser infravermelho em dois comprimentos de onda ideal, 700 nme 800 nm, para gerar uma imagem clara de dados com a maior relação sinal-para-ruído mais elevada sensibilidade e 9. Assim, duas das proteínas alvo podem ser visualizadas simultaneamente na mesma membrana utilizando a 700 nm e 800 nm canais de detecção de fluorescência. Mais importante ainda, a linearidade e gama dinâmica de fluorescência no infravermelho permite a análise quantitativa precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos 9. Além disso, este protocolo proporciona enormes vantagens e melhorias sobre a técnica de Western blot clássico, diminuindo a eletroforese e tempos de transferência desta experiência, sem comprometer a eficácia desses processos e utilizando a detecção da proteína fluorescente no infravermelho para produzir maiores dados Western blot qualitativos e quantitativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

As técnicas de Western blot que foram originalmente estabelecidas no final de 1970 ainda estão ativamente utilizado hoje. No entanto, este método tradicional de transferência Western tem vários inconvenientes que incluem a resolução de baixa qualidade, bandas espúrias, diminuição da sensibilidade, e a integridade da proteína pobre. Os avanços recentes têm melhorado drasticamente inúmeros aspectos do protocolo padrão de Western blot para a produção de dados qualitativos e quantitativos mais elevados. O sistema de gel de Bis-Tris, uma alternativa ao sistema convencional de Laemmli, gera uma melhor separação e resolução de proteínas, mantém a integridade da proteína, e diminui a electroforese para um tempo de corrida de 35 min. Além disso, o sistema de mancha seca iBlot, melhora drasticamente a eficácia e velocidade de transferência da proteína para a membrana em 7 min, o que está em contraste com os métodos de transferência de proteína tradicionais que são muitas vezes mais ineficaz com tempos de transferência longas. Em combinação com estas modificações altamente inovadores, proteínas detection usando resultados de imagem fluorescente infravermelhos em maior qualidade, mais precisos e dados consistentes em comparação com a técnica de Western blot padrão de quimiluminescência. Esta tecnologia pode detectar simultaneamente dois antigénios diferentes sobre a mesma membrana, pela utilização de duas cores de corantes de infravermelho próximo, que são visualizadas em diferentes canais fluorescentes. Além disso, a linearidade e ampla gama dinâmica de imagiologia fluorescente permite a quantificação precisa de bandas de proteínas, tanto fortes e fracos. Assim, este protocolo descreve as principais melhorias para o método de Western blot clássico, em que esses avanços aumentar significativamente a qualidade dos dados, reduzindo consideravelmente o tempo do experimento de desempenho.

Duas cores de fluorescência no infravermelho detecta bandas tanto fortes e fracos sobre a mesma membrana, com o aumento da sensibilidade e a maior relação sinal-para-ruído para produzir imagens nítidas de Western blot. Os resultados típicos gerados por duas cores detecção de Western blot visualizado em ambos os 700 nm e 800 nm canais fluorescentes são exemplificados nas Figuras 1 e 2. O Western blot superior na Figura 1 mostra o concomitante (overlay) detecçã...

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The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Este protocolo explora os mais recentes avanços na realização de análises de Western blot. Estas novas modificações empregar um sistema de gel de Bis-Tris com uma electroforese em tempo de execução de 35 minutos, uma seco do sistema de transferência de mancha de 7 min, e a detecção da proteína fluorescente no infravermelho e de imagem que gera uma maior resolução, qualidade, sensibilidade, e precisão melhorada de dados ocidentais.

O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.9K visualizações.  University of California, San Francisco.  Este protocolo explora os mais recentes avanços na realização de análises de Western blot. Estas novas modificações empregar um sistema de gel de Bis-Tris com uma electroforese em tempo de execução de 35 minutos, uma seco do sistema de transferência de mancha de 7 min, e a detecção da proteína fluorescente no infravermelho e de imagem que gera uma maior resolução, qualidade, sensibilidade, e precisão melhorada de dados ocidentais. 

Vídeo: The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Biologia

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Indução cirúrgica da hidropisia endolinfática por obliteração do ducto endolinfático

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Floral-Dip Transformação de linho (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Método de Avaliação de efeitos de uma gama de comprimentos de onda e intensidades de Terapia da Luz Vermelha / near-infrared sobre o estresse oxidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

Imaging o tráfego intracelular de APP com GFP fotoactivável

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...