Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e da Fundação George E. Hewitt comunhão (AP).

Eletroforese em gel Nota técnica: Antes de iniciar o procedimento, têm as suas amostras de proteínas pronto. Durante esta primeira etapa, as proteínas da amostra são separados de acordo com seu peso molecular por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (PAGE). O NuPAGE ® tampão de amostra LDS carregado com dodecilsulfato de lítio (LDS) mantém polipeptídeos em um estado desnaturado uma vez que a amostra de proteína foi aquecida a 70 ° C por 10 minutos. Um forte agente redutor é usado em conjunto para remover estrutura secundária e terciária (DTT, para quebrar pontes dissulfeto). Além disso, as proteínas da amostra se tornar abordados no LDS carga negativa e, portanto, mover-se através da malha de acrilamida do gel em direção ao eletrodo de carga positiva. Isto permite que a sua separação de acordo com o peso molecular (medido em kilo Daltons, kDa). Detalhadas passo a passo protocolos para a preparação da amostra eo procedimento PAGE pode ser encontrado no site Invitrogen 2, ou no NuPAGE técnicos guia 3. Dicas técnicas <ol><li> No Bis-Tris Invitrogen descontínua NuPAGE sistema de buffer, a mobilidade eletroforética das proteínas ea faixa posterior separação do gel é dependente de dois fatores: i) a concentração do gel acrylamid (com maior concentração de acrilamida, resultando em uma melhor resolução de menor peso molecular de proteínas) e ii) o íon de fuga do tampão de corrida, MOPS ou MES. Para escolher a combinação apropriada para a faixa de separação que você deseja alcançar, referem-se à migração Gel um gráfico. A espessura do gel e número de poços dependerá do volume e da quantidade de amostras que você planeja para carregar, respectivamente. </li><li> Quando você carrega suas amostras nos poços do gel, pelo menos, uma pista é reservada para um marcador de peso molecular (ou escada). Estes padrões de proteínas estão comercialmente disponíveis a partir de várias empresas e tipicamente consistem de uma mistura de proteínas manchada ter definido pesos moleculares, de modo a formar bandas visíveis que permitem acompanhar o andamento da migração. Escolha uma gama de pesos moleculares que é compatível com a resolução do gel. </li><li> Para alcançar um padrão de migração legal e até recomendamos carregar todos os poços de seu gel com um volume similar de amostra ou tampão de amostra 1X LDS. </li></ol> Transferência Nota técnica: Antes de começar a etapa de transferência, prepare o buffer de transferência (1X com metanol 10%) e pré-arrefecer a 4 ° C em uma sala fria. A fim de fazer as proteínas acessíveis a detecção de anticorpos, eles são transferidos pelo eletrobloting do gel para uma membrana de nitrocelulose. A ligação às proteínas é baseado em interações hidrofóbicas, bem como interações de carga entre a membrana e proteínas. (Polivinilideno flúor membrana (PVDF) também pode ser usado como uma alternativa. Neste caso, a membrana PVDF precisa ser pré-molhada em metanol pelo menos 30 segundos antes do uso.) Um protocolo de passo-a-passo detalhado do processo de transferência pode ser encontrada na referência 4, se você usar o Bio-Rad Mini Trans-Blot Celular transferência eletroforética, ou nas referências 2-3 se o seu laboratório está equipado com o XCell Invitrogen do II ™ Blot Módulo. Como resultado deste processo, as proteínas são expostas em uma fina camada superficial e pronto para detecção. A eficácia e uniformidade global de transferência de proteínas do gel para a membrana pode ser verificado através da coloração do Ponceau S reversível da membrana corante. Procedimento de Ponceau S coloração (opcional): <ol><li> Depois de transferir as proteínas, coloque a membrana em uma bandeja de incubação (proteínas para cima). </li><li> Adicionar o suficiente de coloração Ponceau S para cobrir a membrana e incubar pelo menos 30 segundos com agitação suave. </li><li> Enxágüe membrana com água destilada até que o fundo é clara. </li><li> Destain a membrana com água corrente destilada por 2-3 minutos. </li><li> Colocar a membrana em solução de bloqueio (veja abaixo). </li></ol> Dicas técnicas: <ol><li> Recomendamos rotulagem sua membrana com um lápis antes da transferência de proteínas, a fim de denotar o lado em que as proteínas foram expostos ea orientação de suas amostras. </li><li> Ambos coloração Ponceau S e os marcadores de peso molecular pode ser usada para cortar a membrana após a transferência para sondar as partes resultantes com diferentes anticorpos </li></ol> Imunodetecção: Nota técnica: Este procedimento imunodetecção é fornecida como uma única diretriz. Otimização podem ser necessários para cada formigaiBODY; informações específicas podem ser encontrados na maioria das folhas de dados dos anticorpos comercialmente disponíveis (por exemplo, diluição de trabalho, tempo de incubação, etc.) Durante este último processo, a proteína-alvo será detectado usando um anticorpo específico e aparecerá como uma banda no filme. A posição da banda é dependente do peso molecular da proteína-alvo, enquanto que a intensidade da banda depende da quantidade de proteína presente alvo. Normalmente, isso é conseguido após três subetapas: <ol><li> Bloqueio: Para evitar interacções não específicas do anticorpo com a membrana (o excesso de espaço na membrana é coberta com uma solução diluída de uma proteína genérico). </li><li> Sondagem: A proteína de interesse é detectada por um específico <a title="Anticorpo primário" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">anticorpo primário</a> . Depois que o anticorpo não ligado é lavado primário, a membrana é exposta a um anticorpo diferente ligada ao repórter <a title="Enzima" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">enzima</a> , <a title="Peroxidase" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">peroxidase</a> (HRP). Este anticorpo secundário é dirigido contra a porção espécie-específicos do anticorpo primário (por exemplo, um anticorpo anti-coelho secundário irá se ligar a qualquer anticorpo de coelho de origem primária). </li><li> Detecção: Um agente quimioluminescente é usado como um substrato que fluoresce quando exposto ao HRP no anticorpo secundário. Esta reação produz luminescência no lugar e na proporção da quantidade de proteína sondado. A luz é então detectada por um filme fotográfico. </li></ol> Um procedimento passo-a-passo genérico é fornecido abaixo. Outros procedimentos detalhados podem ser encontrados no manual de Detecção Blotting ECL Plus ocidental instrução Reagentes 5 ou na maioria folha de dados que acompanham os anticorpos disponíveis comercialmente. Tempo de incubação, diluição do anticorpo, e bloqueio e soluções de lavagem tem de ser empiricamente optimizada para cada anticorpo. Imunodetecção procedimento: <ol><li> Bloqueiam a ligação não-específica pela incubação com volume suficiente de solução PBS caseína 1% para cobrir o bloqueio a membrana toda. Coloque em uma rocker por pelo menos 30 min em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Incubar a membrana com o anticorpo primário (específico para a proteína de interesse). O anticorpo primário deve ser diluído em solução de bloqueio. Para a maioria dos anticorpos, a ligação completa é alcançada após 1-2 horas de incubação à temperatura ambiente sob agitação suave. Alternativamente, a etapa de incubação pode ser realizada durante a noite a 4 ° C para aumentar a relação sinal-ruído. </li><li> Remover a solução (descartar ou manter a 4 ° C e -20 ° C para utilização repetida) e rapidamente lavar a membrana uma vez. Então 3X10 minutos com PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) à temperatura ambiente com agitação vigorosa. </li><li> Incubar a membrana com um anticorpo HRP-coupled secundário diluído em solução de bloqueio. Escolha um anticorpo que reconhece a porção IgG da espécie, onde o anticorpo primário foi levantada. A incubação é realizada durante 1 hora a temperatura ambiente sob agitação suave. </li><li> Descartar a solução rápida e lavar a membrana uma vez. Então 3X10 minutos com PBST à temperatura ambiente com agitação vigorosa. </li><li> Proceder à detecção quimioluminescente de acordo com as instruções do fabricante. Usamos a ECL Plus ocidental reagentes de detecção Blotting da GE Healthcare (ver referência 5 para obter instruções específicas). </li><li> Coloque sua membrana em saran wrap ou uma bolsa e coloque dentro de um cassete de auto-radiografia. Certifique-se para drenar qualquer excesso de líquido e remova todas as bolhas de ar. </li><li> Expor o filme fotográfico à membrana em um quarto escuro. Comece com um tempo de exposição 1 minuto e ajustar de acordo com a intensidade do sinal desejado. </li></ol> Dicas técnicas: <ol><li> Bloqueio de ligação não específica é obtido pela colocação da membrana em uma solução diluída de proteínas. Normalmente usamos caseína 1%, mas <a title="Albumina de soro bovino" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">albumina bovina</a> (BSA ~ 2%) ou não-leite em pó desnatado (~ 5%) pode ser usado como uma alternativa. </li><li> Tris-Buffered Saline (TBS) pode ser usado durante todo o procedimento em vez de PBS. Recomendamos o uso de TBS se você pretende testar o seu membrana com o anticorpo phosphospecific. </li><li> O uso de um brilho-in-the-dark autocolante (eg, Glogos Stratagene ® da Marcadores II Autorad) bateu no fundo da gaveta autoradiografia vai ajudar você a alinhar seu filme e sua membrana durante a etapa de análise. </li></ol> Análise Agora que você tem exposto o seu filme, você vai perceber que em termos práticos, nem todos os Westerns revelam proteína como uma banda de solteira. Additional bandas também podem aparecer devido à ligação não específica de anticorpos primário e secundário. Este sinal de fundo podem ser reduzidos por meio da otimização do procedimento de imunodetecção. Além disso, um controle apropriado (por exemplo, as células untransfected, siRNA células tratadas, etc) será útil para determinar a especificidade do seu anticorpo ea localização exata da proteína alvo na membrana. Após a marcação sobre o filme a posição das bandas de proteínas manchado padrão da membrana, plotar o log de cada peso molecular dos padrões de proteínas (eixo y) contra a sua mobilidade relativa correspondente (eixo-x). Mobilidade relativa (Rf) é o termo usado para a relação entre a distância a proteína passou de seu ponto de origem (parte superior do gel) em relação à distância a tintura de rastreamento ou um marcador de baixo peso molecular foi movido (a frente gel) . Determinar a linha de regressão da curva padrão para obter os valores de inclinação e intercepto y. O peso molecular desconhecido (tamanho) da sua proteína-alvo é estimado usando a sua Rf ea seguinte equação modificada: registro do peso molecular = (inclinação) (Rf de mobilidade ou da proteína-alvo) + y-intercepta (Ver referência 6 para instruções detalhadas). Aproximações nível de expressão são tomadas por comparação da intensidade da banda da proteína-alvo para que de uma proteína estrutural (por exemplo, tubulina, ou actina) ou um produto de limpeza, tais como gene GAPDH. Este assim chamado &quot;controle de carga&quot; não deve mudar entre as amostras e é revelado através de um anticorpo específico primário. A imagem pode ser analisada por densitometria para avaliar a quantidade relativa de proteína coloração e quantificar os resultados em termos de densidade óptica.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

O procedimento sugerido aqui usa um gel Bis-Tris com MES tampão de corrida como um exemplo de desnaturação PAGE utilizando o sistema de eletroforese Invitrogen NuPAGE Novex. Além disso, este sistema de gel pré-cast permite a separação de proteínas sob desnaturação ou não desnaturante condições, bem como acomoda uma ampla gama de pesos moleculares (1-200 kDa para os géis Bis-Tris para 36-400 kDa para o Tris- géis de acetato). Dependendo da sua experiência, você pode optar por seguir apenas uma parte da técnica de western-bl...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blot (ou immunoblotting) é um procedimento padrão de laboratório permitindo que pesquisadores para verificar a expressão de uma proteína, determinar a quantidade relativa das proteínas em diferentes amostras e analisar os resultados da co-imunoprecipitação experimentos. Neste método, uma proteína-alvo é detectado com um anticorpo específico primária em uma dada amostra de homogeneizado de tecido ou extrato. Separação de proteínas de acordo com o peso molecular é obtida através de desnaturação SDS-PAGE. Após a transferência para uma membrana, a proteína-alvo é sondado com um anticorpo primário específico e detectados por quimioluminescência. Desde sua primeira descrição, a técnica de western-blotting passou por várias melhorias, incluindo a pré-cast géis e user-friendly equipamento. Em nosso laboratório, optou-se por utilizar o sistema de eletroforese comercialmente disponíveis NuPAGE da Invitrogen. É um pH neutro inovadoras, descontínua SDS-PAGE, pré-moldados sistema de mini-gel. Este sistema apresenta várias vantagens sobre a técnica de Laemmli tradicionais, incluindo: i) uma vida útil mais longa dos géis pré-moldados que variam de 8 meses a 1 ano; ii) uma ampla gama de separação pesos moleculares 1-400 kDa, dependendo do tipo de gel utilizados, e iii) maior versatilidade (variação de porcentagem de acrilamida, o tipo de gel, e da composição iônica do tampão de corrida). O procedimento descrito neste artigo utiliza o vídeo Bis-Tris sistema tampão descontínuo com 4-12% Bis-Tris gradiente géis e MES tampão de corrida, como uma ilustração de como realizar um western blot usando o sistema de eletroforese Invitrogen NuPAGE. Em nosso laboratório, temos obtido bons resultados e reprodutível para várias aplicações bioquímicas usando este método western-blotting.

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Este artigo técnico descreve um procedimento de western-blotting usando o padrão disponível comercialmente NuPAGE sistema de eletroforese Mini-Gel da Invitrogen.

Western Blotting Usando o Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K visualizações.  University of California, Irvine (UCI). Este artigo técnico descreve um procedimento de western-blotting usando o padrão disponível comercialmente NuPAGE sistema de eletroforese Mini-Gel da Invitrogen.

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Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Indução cirúrgica da hidropisia endolinfática por obliteração do ducto endolinfático

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Biologia

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: Preparação de amostras para detecção

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

Imagem e Reconstrução 3D de Estruturas cerebrovasculares em Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Diferenciação de camundongos neonatos pele derivadas de células-tronco em células germinativas semelhantes<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

Fluxo de trabalho livre de manchas V3 para um controle prático, conveniente e confiável de carregamento total de proteínas em blotting ocidental

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

O mais rápido na Cidade Ocidental: um toque contemporâneo na Análise clássico Western Blot

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern quantitativa fluorescente Western Blotting com estratégias de resolução de problemas

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...