Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (U54CA143906 a KGP, OJTM e R01HL101972 para OJTM) e uma Fundação de Pesquisa de Oregon Medical Cedo Clínica Investigator Award (KGP). OJTM é um Investigador Fundada American Heart Association (13EIA12630000). Agradecemos ao Dr. Eric Anderson, do Instituto do Câncer Knight para preparação de amostras de células utilizadas neste trabalho.

1. Microscópio Especificações Para a realização de imagens na forma correta o microscópio deve ter as seguintes especificações: <ol><li> Possuir tanto contraste de interferência diferencial (DIC) e de campo claro (BF) de contraste. </li><li> Já movimento do eixo z controlados por computador. </li><li> Possui uma paragem de abertura ajustável para variar a abertura numérica da lente de condensador. Uma abertura com uma regra graduada ou leitura eletrônica é necessária para saber o valor da abertura numérica. A abertura numérica que varia de 0,1 para NIQPM até 0.9 (ou superior) para HTDIC. </li><li> O microscópio deve ter um filtro de cor estreita faixa a ser utilizado para brilhante imagem de campo. Este filtro é necessário para corrigir o incremento de refração, uma facture dependente do comprimento de onda utilizado para converter fase de densidade de massa para NIQP. </li></ol> 2. Contraste de interferência diferencial (DIC) Aquisição Z-stack <ol><li> Abra o software de um Slidebookª criar um novo slide para a coleta de imagem. </li><li> Em seguida, abra a janela Focus. Na seção Conjunto de Filtros, selecione DIC. Na guia Escopo, na seção do condensador, ajuste o controle deslizante de abertura para o mais distante posição correta (aberto todo o caminho). Isto proporciona uma iluminação elevada abertura numérica e de corte aumenta óptica da amostra. </li><li> Concentre-se na amostra usando uma objetiva DIC. Ajuste a intensidade da lâmpada de halogéneo até que a amostra é facilmente visível. Para garantir que a câmera não está sendo saturado, selecione a aba Camera na Janela Foco e verifique se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa dinâmica da câmera. </li><li> Abra a janela de Captura de Imagem. Na seção Tipo de captura, marque a caixa 3D. Na seção de captura 3D, selecione o intervalo em torno do centro e voltar para o local atual </strong&gt; caixas e especificar o intervalo Z-direção, número de aviões e tamanho do passo. O intervalo Z-direção deve incorporar toda a amostra. </li><li> Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa DIC e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a imagem. </li></ol> 3. Campo Bright (BF) Aquisição Z-stack <ol><li> Uma vez que o microscópio foi concluída a coleta do Z-stack da amostra DIC, abra a janela de foco e selecione Abrir na seção Set Filter. Ajuste a barra deslizante de abertura para o mais distante posição esquerda (fechado todo o caminho) para fornecer iluminação baixa NA. </li><li> Mude o filtro microscópio de luz caminho para verde. Ajustar a intensidade de luz de halogéneo, até a amostra é visível. Certifique-se de que não há saturação da câmera selecionando o <strong&gt; guia Câmera na Janela Foco e verificar se o histograma de intensidades de pixel está dentro da faixa especificada. </li><li> Abra a janela de Captura de Imagem. As configurações de captura 3D a partir da aquisição Z-stack DIC será exibida. </li><li> Na seção Conjunto de Filtros da janela de Captura de Imagem, marque a caixa aberta e especifique o tempo de exposição. Na seção Informações da Imagem, o nome da imagem (opcional), e selecione Iniciar para iniciar a aquisição de imagens Z-stack. </li></ol> 4. Exportando Z-stack Images <ol><li> Abra uma captura Z-stack. Alterar a vista para 100%. Ajustar o histograma dos valores de pixel a serem exibidas entre 0 e o valor de pixel máximo da câmara (4,095 para 12 câmaras de bits, 65.535 para 16 bits.). </li><li> Selecione Exibir&gt; Export&gt; Série TIFF. Isto irá exportar o Z-stack como uma série de imagens TIFF(Um para cada plano Z). Salve a série TIFF em uma pasta separada com um nome que tem um sublinhado no final (ou seja, &quot;DIC Stack 1_&quot;). Repita este procedimento com cada Z-stack DIC ou BF. </li></ol> 5. Desconto Medidas <ol><li> Abra o programa HTDIC MATLAB intitulado &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Nos termos do artigo 0 do programa HTDIC, atualize a variável diretório dependências. Copie e cole o diretório que contém o hilbert_transform_dic.m e arquivos sobel_edge_detect.m do explorador (PC) entre as aspas simples seguinte &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 do programa JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li> Na Seção 1, atualize o &quot;images_directory&quot;. Mais uma vez, copie e cole o diretório que contém as imagens através de foco na forma tif. Entre as aspas simples. Só correr SEÇÃO 1 VEZ. </li><li> Alinhamento e rotação de imagens para Hilbert transformar Run Seção 2 do código. A caixa de diálogo intitulada &quot;Definir parâmetros HTDIC&quot; irá aparecer. Cinco numbers são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem DIC da amostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), o ângulo da imagem DIC rotação necessária para realizar a transformada de Hilbert, os valores típicos são de 45 e -135. Por fim, entram na região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de uma caixa, que em seguida aparecem - valor típico é de 400. Clique em OK. </li><li> Uma imagem do plano focal DIC especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul. Posicione a caixa sobre a característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Uma vez que a caixa foi posicionada sobre a região desejada, clique duas vezes dentro da caixa. </li><li> Outra figura aparecerá agora: esta figura contém uma imagem recortada e rodado da região de interesse selecionada na etapa anterior. O contraste da imagem deve ser talcaracterísticas que escuras aparecem na esquerda, enquanto características brilhantes aparecem na direita. Arraste a caixa azul sobre a região de interesse, reformular, se necessário. </li><li> Seção 3 gera uma máscara para o cubo z pilha. Existem dois tipos de máscaras disponíveis: uma máscara retangular para criar um retângulo ao redor da célula e uma ferramenta à mão livre para delinear a célula de interesse com a mão. </li><li> Para gerar uma máscara retangular, linha 167 e descomente comentário linha 170 (comentário de uma linha para fora, colocando um &quot;%&quot; no início da linha). Executar Seção 3 do programa. Clique na imagem e arraste o mouse para começar a definir a máscara retangular. Dê um clique duplo na caixa de aceitá-lo. </li><li> Para gerar uma máscara desenhada à mão, o comentário linha 167 e linha 170 descomente e executar Seção 3. Clique e tirar a máscara desejada com o mouse. Dê um duplo clique sobre a máscara para aceitá-la. </li><li> Seção Execute 4to construir o Hilbert transformado pilha de DIC e os correspondentes imagem Pilha da área de interesse DIC.A máscara construída na Seção 3 serão aplicadas ao Hilbert transformar pilha DIC ea pilha DIC regular quando &quot;maskon&quot; está definido para 1 na linha 179. Definição &quot;maskon&quot; para 0 irá construir pilhas de imagens sem aplicar a máscara. </li><li> Execute Seção 5 para otimizar a segmentação das imagens seccionais xz transversais da região de interesse. Figura 500, produzido pelo programa, é exibida com três tipos diferentes de contraste. O sucesso do algoritmo para encontrar os limites da célula é dependente de uma combinação de a máscara usado e o valor de &quot;limiar&quot;, na linha 229 de programa. Comece com um valor de 0,5. Ajuste o valor de limiar e execute novamente esta seção do programa até o delineamento adequado é alcançado em uma das colunas. </li><li> Se o delineamento foi o melhor na coluna 1, use a Seção 6 para determinar o volume usando uma imagem segmentação DIC. Se a coluna 2 deu os melhores resultados, execute Seção 7 para determinar o volume da célula a partir de imagens DIC Hilbert-transformada. Se a coluna 3 gave os melhores resultados, executar Section 8 para determinar o volume usando Fourier filtrada imagens DIC Hilbert-transformada. </li><li> O volume medido da amostra, relatado em mM cúbico (fl) é apresentado no título da Figura 600, 700, ou 800 produzido pelo programa, dependendo de qual a medição de volume é escolhido. </li></ol> 6. Medidas de Massa <ol><li> Abra o programa NIQPM MATLAB intitulado &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Nos termos do artigo 0 do programa NIQPM, atualizar o local de três diretórios necessários para executar o programa. Estes são o &quot;dependencies_directory,&quot; o &quot;brightfield_directory,&quot; e o &quot;dic_directory.&quot; </li><li> Em seguida, execute Seção 1. Esta seção do código gera um campo brilhante imagem Cubo do campo cheio de todo o conjunto de imagens. Só correr SEÇÃO 1 VEZ. </li><li> Em seguida, execute Seção 2. A caixa de diálogo intitulada &quot;Definir parâmetros NIQPM&quot; irá aparecer. Quatro números são exigido do usuário: o número de plano focal onde a imagem de campo claro daamostra está em foco, resolução lateral (mm / pixel na imagem), a resolução axial (isto é 0,1 para a aquisição de imagem em 0,1 mM passos axiais), e a região de tamanho interesse, este parâmetro define o comprimento de um lado de um caixa que vai aparecer posteriormente - um valor típico é 200. Clique em OK. </li><li> Uma imagem do plano focal de campo claro especificada pelo número de plano focal irá aparecer com uma caixa azul. <ol><li> Se a imagem não está em foco, clique duas vezes na caixa azul e reprise Seção 2, certifique-se de ajustar o número de plano focal na caixa de diálogo. </li><li> Se a imagem está em foco, arraste a caixa azul ao redor da imagem e redimensioná-lo, selecionando os nós da caixa e arrastando-os quando necessário. Posicione a caixa em torno da característica de interesse, por exemplo, uma célula. A caixa não precisa ser quadrado. Clique duas vezes dentro da caixa para aceitá-la. </li></ol></li><li> Em seguida, executar o ponto 3 para a construção de uma pilha de imagens de campo brilhante foi colhido para a região de emjuro. </li><li> Para gerar a imagem DIC pseudo mapa de fase, e as comparações com a imagem DIC verdadeira imagem e campo claro, correr Seção 4. </li><li> Com o pseudo DIC e imagens verdadeiras DIC tão semelhantes quanto possível, o mapa de densidade de massa, a massa total, e um histograma da densidade celular pode ser determinada através da execução secção 5a ou 5b. Seção 5a realiza detecção boarder automatizada do campo - otimizar &quot;limite&quot; na linha 300 - valores típicos variam entre 0,1-1. Execute novamente nesta seção, conforme necessário para otimizar o valor do limite. Seção 5b realiza a determinação da massa, etc depois que o usuário define a célula de interesse. </li></ol>

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Os autores não têm interesses financeiros no trabalho apresentado.

Em geral, NIQPM é uma técnica de difração limitada validado no caminho comprimentos ópticos que vão ,25-44,7. Validação foi realizada em n = 1,596 esferas de poliestireno que variam em diâmetro 0,11-9,8 mM suspenso em Fluoromount G (dados não mostrados). As células possuem comprimentos de caminho óptico que variam de cerca de 0-7. Ao medir a distribuição da densidade de uma amostra pode-se achar que a imagem do pseudo DIC parece bem, enquanto o mapa de densidade possui indeseja...

O uso de microscopia óptica é agora onipresente na investigação de organismos celulares. Devido ao seu baixo de absorção e de espalhamento fraco propriedades endógenas mais visível do espectro óptico, as células não afetam fortemente a amplitude de ondas ópticas atravessando-los e, assim, aparecer semitransparente quando fotografada com microscópios de campo brilhante padrão. Amostras celulares, no entanto, diminuir ondas ópticas viajam através deles de uma forma que é linearmente relacionada com a quantidade de densidade de massa local em uma determinada região do espaço através do qual a luz viaja. A utilização desse intervalo de tempo heterogêneo ou perfil &quot;fase&quot; de ondas ópticas transmitidos através espécimes microscópicas foi descrita pela primeira vez em 1935 por Frits Zernike 1 e experimentalmente realizado por Zernikein 1942 2. Zernike foi agraciado com o prêmio Nobel em 1953 por essa conquista. Zeiss comercializado esta modalidade em 1945 3. Em 1955, Smith e NomarskGostaria de apresentar o seu trabalho inicial sobre o uso de 4 e 5 de teoria de interferência diferencial contraste (DIC) de microscopia, uma modalidade que utiliza o gradiente espacial de fase como um mecanismo de contraste. DIC foi comercializado por Zeiss em 1965in estreita colaboração com Nomarski 6. Em 1981, dois laboratórios demonstraram a primeira célula viva imagens DIC registada com a incorporação de câmaras de vídeo para o trem óptica do microscópio DIC 7, 8. A era das imagens de células vivas nasceu. Desde essa altura, a execução de ambos de contraste de fase e DIC em microscópios comerciais tem sido largamente inalterada. Estes métodos são utilizados principalmente por biólogos para produzir imagens de células para fins qualitativos: o monitoramento da morfologia, rastreamento de estruturas subcelulares e investigações de dinâmica da membrana 9. Estas técnicas são qualitativa na sua configuração de &quot;off-the-shelf&quot; tanto como fase e DIImagens c são funções arbitrárias da intensidade da fonte de luz, as configurações óptica iluminação, e ganho da câmera CCD, gama e configurações de exposição. Uma pequena legião de físicos e engenheiros ópticos tem se esforçado para fazer exames de imagem comerciais quantitativa. Entre os primeiros esforços foram duas cartas à natureza em 1952 e 1953, em que o médico que virou biofísico Robert Barer demonstrado o uso de microscopia de fase para determinar a massa seca celular das células estimando mudanças de fase através destes tipos de células utilizando um microscópio de fase disponível comercialmente 10, 11. O campo tem desenvolvido uma infinidade de técnicas ao longo dos anos seguintes com base em torno de três mecanismos básicos de contraste sem rótulo: microscopia de fase 10,11, microscopia DIC 12-17, 18-22 e brilhante campo para determinar óptico caminho de comprimento, fase em massa densidade, índice de refração, e volume celular. No Parállel, uma grande coleção de instrumentos ópticos personalizados também têm sido desenvolvidos desde os anos 1950, e fizeram de longo alcance medições ópticas que vão desde aplicações em crescimento do parasita 23, para documentar o ciclo celular 24 para investigar a dinâmica da membrana das células vermelhas do sangue 25. Em particular, nos últimos dez anos tem visto uma riqueza de microscopia quantitativa sem rótulo na forma de microscopia de fase difração de 26, microscopia tomográfica fase 27, microscopia holográfica digital 28, sensível microscopia de coerência óptica fase 29, microscopia de interferência de luz espacial 30, Hilbert fase microscopia 31, e microscopia de fase quantitativa 32. Apesar de seus sucessos coletivos, estes instrumentos não tenham sido divulgadas ao maior campo de pesquisadores biológicos, devido, principalmente, à sua instrumentação complexa e requisitos computacionais. Aqui nós describe o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo claro e imagens DIC. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC), para determinar o volume. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica. As condições de imagem necessários para a sua realização bem sucedida estão dentro do âmbito do funcionamento normal da maioria dos microscópios disponíveis comercialmente. Além disso, os algoritmos de pós-processamento são estáveis, rápido e robusto - tendo sido implementado em MATLAB usando transformada de Fourier rápida algoritmos (FFT) com base, sempre que possível. NIQPM é um método para reconstruir fase e a densidade de massa integrada axialmente de celespécimes intracelular de imagens de campo claro. Soma desta densidade de massa integrada axialmente ao longo da área da amostra dá o teor de matéria seca total da amostra. O protocolo NIQPM baseia-se nas bases experimentais definidas por Paganin Nugent e 18, 19 - em que foi demonstrado que o perfil de fase de uma célula pode ser reconstruído a partir das imagens da amostra através do foco de campo brilhante - e o trabalho teórico de Frank , Altmeyer e Wernicke 20 - na resolução dos modelos de ondas paraxiais de forma eficiente com base em FFT. A ligação da fase com a densidade de massa seca é baseado no trabalho por Barer 10, 11 e Popescu 33. Informações volumétrica podem ser obtidas a partir de imagens por meio de DIC-focagem sob condições de iluminação elevados de NA que permitem o corte óptico da amostra ao longo do eixo óptico. Hilbert transformar processamento nas pilhas de imagens DIC aumenta muitoalgoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. Isto origina trabalho com Arinson et al. Embora 34 foram introduzidos os dois métodos de filtragem de Fourier para aumentar o contraste e um método de detecção de borda à base de Sobel para análise volumétrica automatizada de amostra. Temos também validado HTDIC anteriormente em esferas de poliestireno que variam em tamanho desde o limite de difração de até 20 m de diâmetro 36. Embora ambos NIQPM e HTDIC são tecnologicamente acessíveis devido ao seu desenvolvimento em microscópios comerciais, os métodos são fundamentalmente limitada pela configuração das próprias microscópios de hardware. As limitações primárias de estas técnicas são duas vertentes: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais, devido à tradução de todo o estágio da amostra ao invés de apenas a lente objetiva, Limita actualmente a investigação de fenómenos mais rápidos do que cerca de um quadro / minuto, e, por outro, os efeitos de difracção de restringir a utilidade de NIQPM e HTDIC para objectos que variam em tamanho desde 0,2 até 10 e 20 um de diâmetro, respectivamente. Assim, a amostra e sua dinâmica de tempo associados de interesse deve atender determinado tamanho e restrições temporais para permitir a utilização destes métodos em instrumentos típicos &quot;off-the-shelf&quot;. Empolgante, a maioria das amostras celulares fixos são prontamente investigadas com estes métodos. Uma visão geral do NIQPM e protocolos HTDIC são apresentados na Figura 1. Na Figura 2 ilustramos imagem ideal e de qualidade inferior por meio de foco em condições de baixa e alta iluminação NA tanto para campo claro e imagens DIC. Figuras 3 e 4 demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQPM destacando implementações bem sucedidas e mal sucedidas. <strong&gt; A Figura 5 ilustra os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem HTDIC e demonstra a aplicação óptima do algoritmo para determinar o volume celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Descreve-se o uso de um microscópio ótico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo brilhante e diferencial interferência imagens de contraste. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC) para determinar volume. NIQPM baseia-se um modelo simplificado de propagação da onda, denominado aproximação paraxial, com três suposições: baixa abertura numérica (NA) de iluminação, a dispersão fraca, e fraca absorção de luz pela amostra. Felizmente, as amostras celulares não coradas satisfazer estes pressupostos e baixa iluminação NA é facilmente alcançada em microscópios comerciais. HTDIC é usado para obter informações volumétrica a partir de imagens através de foco DIC sob alta ilumin NAcondições ation. Iluminação elevada NA permite melhor corte da amostra ao longo do eixo óptico. Transformada de Hilbert da transformação na imagem DIC empilha aumenta muito algoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica utilizando microscópios &quot;off-the-shelf&quot;. Existem duas limitações básicas destes métodos: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais ab-roga atualmente a investigação dos fenômenos mais rápido do que um frame / minuto, e em segundo lugar, os efeitos de difração de restringir a utilidade da NIQPM e HTDIC a objetos de 0,2 até 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) um de diâmetro, respectivamente. Assim, os espécimes e o seu tempo associado dinâmica de interesse deve satisfazer certos restrições de tamanho e temporais, para permitir o uso de tais métodos. Empolgante, a cellula mais fixor espécimes são prontamente investigadas com estes métodos.

Iluminação amostra correta durante a aquisição de imagem através de foco é fundamental para o sucesso da implementação do NIQPM um ​​nd algoritmos HTDIC. Na Figura 2 ilustramos baixa e alta iluminação NA sob tanto DIC e brilhante contraste campo para uma esfera de poliestireno ea linha de células de adenocarcinoma colorretal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I e 2K demonstrar imagem ideal para NIQPM. Figuras 2F, 2H, 2N, e 2P...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K visualizações.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Bioengenharia

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Em síntese in vitro de Nativo, Espaçamento fibroso Long e Colágeno Espaçamento segmentar Longo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imageamento óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted Plasma Membrane entrega de um hidrofóbica Carga encapsulado em um cristal líquido nanopartículas Transportador

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabricação e caracterização de espectros ópticos de tecido contendo Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realização de vários modos de imagem com um microscópio de fluorescência

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...