Este trabalho foi apoiado por uma Lundbeck Líder do Grupo Bolsa Júnior para LNN. PWW reconhece o apoio financiamento da concessão de Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá (NSERC). Agradecemos também o dinamarquês Molecular Bioimaging Center na Universidade do Sul da Dinamarca para o acesso à fiação microscopia disco.

Aquisição de proteínas marcadas com EGFP da membrana do plasma para análise CCI pode ser feito num microscópio de epifluorescência, uma configuração TIRF ou num microscópio de disco giratório definido para adquirir imagens da membrana de interesse. O tamanho do pixel de câmara, assim como o tempo entre os quadros de imagem é necessária para a análise. Sequências de imagens de 100-1,200 quadros em uma taxa de quadros de 4-30 Hz pode ser usado para a análise. Durante a aquisição, é importante para manter a membrana no foco durante toda a duração da imagem e o foco sobre uma fracção de membrana plana, em que a fluorescência é uniformemente distribuída. Movendo-se vesículas, projetando-se regiões de membrana e organelas celulares podem ser cortadas para fora no final do processo de análise. O tempo de aquisição deve ser escolhido de modo que não há nenhuma deriva ou movimento da célula. Para obter os scripts de código CCI para MATLAB, entre em contato com Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). A primeira vez que o código CCI é usado, MAT abertoLAB e clique arquivo, caminho, em seguida, definir, em seguida, clique em adicionar com subpastas e localize a pasta no computador em que o código CCI está localizado. Em seguida, clique em OK, salvar e fechar. Agora continue com a análise de culturas descritos nos próximos pontos. 1. Importe a sequência de imagens de interesse em um programa de análise de imagem como TIFF Stack Salve o arquivo com o nome: stack1.tif. <ol><li> Selecione uma região retangular de interesse (ROI) na parte plana da membrana excluindo organelas celulares móveis e salientes regiões de membrana. O tamanho do corte é escolhido de forma que as estatísticas suficientes são gerados para o bem k 2 parcelas. </li><li> Cortar a região e salvar a cultura como um arquivo TIFF em uma pasta apropriada. Se existem várias culturas a partir do mesmo filme, usar um incremento de número, por exemplo &quot;stack1crop.tif&quot;, &quot;stack1crop2.tif&quot;, &quot;stack1crop3.tif&quot;. </li><li> Coloque a pasta que contém as culturas locaisno computador, e não em um servidor, ao fazer a análise CCI. </li></ol> 2. Importam as culturas para a Análise de Software One by One para executar a análise de <ol><li> Abrir MATLAB e digite &quot;icsgui&quot; na janela de comando e pressione ENTER. ICS GUI é o nome do executável para o programa de interface gráfica do usuário espectroscopia de correlação de imagem. </li><li> Na GUI do ICS, clique na guia &quot;CCI&quot;. Uma captura de tela da janela de análise é mostrado na Figura 1. </li><li> Encontre a pasta com o nome da pasta &quot;código MATLAB&quot; e vá até o arquivo com o nome do arquivo &quot;Scripts&quot; e abrir este clicando duas vezes nele. Como alternativa, clique o botão direito no arquivo e selecione &quot;abrir com MATLAB&quot; ou ir para o arquivo, aberto em MATLAB e abra o arquivo scripts. Este arquivo é chamado de Editor. </li><li> No rolo Editor para &quot;CCI carregar dados conjuntos&quot;, em seguida, copiar ou nome do arquivo tipo e localização da pasta na linha de comando, que começacom img = por exemplo, &quot;C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif&quot;. Na linha de comando abaixo a localização da pasta definir o número de quadros a serem analisados ​​- por exemplo, [1:500]. Use as mesmas configurações para todos os filmes consecutivos na série de dados. Se houver desvio de foco em quadros posteriores, estes devem ser excluídos da análise. </li><li> No editor clique em &quot;salvar&quot; e depois clique em &quot;avaliar célula.&quot; O conjunto de dados está agora carregado no no software de análise. </li><li> Na janela Análise CCI no GUI, introduzir as definições para a análise: <ol><li> Desmarque as caixas &quot;de células T&quot;. </li><li> Digite o número de defasagens a ser analisado. O número de defasagens de tempo (τ) terão efeito sobre o enredo de difusão e deve ser escolhido de modo que o enredo de difusão é linear. Comece com a entrada de 25 e depois diminuir para onde a trama difusão é linear. τ é o número de intervalos de tempo da análise compara CCI e um intervalo de tempo é o tempo bntre um quadro e outro. O menor valor que dá um enredo linear deve ser selecionada. O número máximo de lapsos de tempo é escolhida de modo a que um ajuste linear é obtido, a escolha de um valor mais elevado irá produzir dados que não podem ser montados linha. </li><li> Digite o valor máximo k 2 (ver círculo 1 da Figura 1), é geralmente 20-50. Um bom k 2 enredo é uma trama em que há muitos pontos de dados que são distribuídos ao longo de uma linha. Comece com a entrada de 70 e, em seguida, diminuir depois de ter avaliado os k 2 e difusão parcelas e selecionar o menor valor em que o cluster pontos de dados em torno de uma linha reta. O valor k é 2 a magnitude ao quadrado do k-vector espacial no espaço de Fourier. Inicialmente, a análise deve ser repetida até que os melhores valores são determinados, em seguida, usar as mesmas configurações para todos os filmes consecutivos na série de dados, mas sempre verifique se as configurações selecionadas dar um bom ajuste para os dados: bom k 2 parcelase um enredo difusão linear. </li><li> Clique em &quot;Ajustes da Loja e avançar&quot;. </li><li> Clique em &quot;sim&quot; para mostrar todos os gráficos. </li><li> Clique em &quot;Load série de imagens&quot; (ver círculo 2 na Figura 1), em seguida, clique em &quot;área de trabalho&quot;. </li><li> Selecione &quot;imgSerCrop&quot;, clique em &quot;Importar do Workspace&quot;. </li><li> Digite as configurações de coleta de sistema de imagem. No &quot;tamanho do pixel&quot; caixa digite o tamanho do pixel projetado para o sistema de imagens em que as pilhas de imagens são adquiridas. Para AQP3-EGFP, 0.111 foi usada. Na caixa &quot;Digite o tempo (s) entre os quadros&quot;, 0,1150 foi usado para AQP3-EGFP. </li><li> Clique em &quot;selecionar ROIs&quot;, digite &quot;1&quot;, clique em ok e &quot;usar a imagem inteira&quot;. </li><li> Clique em &quot;análise Do CCI&quot; e clique em sim para fazer &quot;filtragem imóvel&quot;. Os resultados irão abrir automaticamente como imagens. </li><li> Minimizar a janela de configurações, minimizar a informação da célula window, e minimizar a janela fotofísica. Na janela dinâmica, verifique se a trama dinâmica mostra um ajuste linear dos dados para uma linha com uma inclinação negativa o que significa que os pontos de dados correlacionar e difusão livre pode ser assumida. Registre o coeficiente de difusão para o intervalo de tempo específico e K 2 configurações (não é necessário notar o desvio padrão do ajuste). Os pontos de dados nas k 2 lotes devem ser agrupados em torno da linha do tempo dado lags. </li><li> Caixa Tick &quot;Salvar figuras abertas como imagens&quot;, clique em &quot;Salvar dados abertos como imagens&quot; para salvar resultar arquivos. Salve em uma nova pasta em C: Users Documents AQP3diffusion. Clique em &quot;dados atuais clara&quot; e continuar com a análise da próxima safra. </li></ol></li></ol> 3. Média do coeficiente de difusão calculado é calculado para obter uma visão geral dos dados analisados <ol><li> Digite os coeficientes de difusão individuais de cada ROI em um spreadsheet (certifique-se de anotar o τ e K 2 valores), use os nomes das culturas, tal como definidos acima. </li><li> Calcule o coeficiente de difusão média e desvio padrão, utilizando um programa de planilha. </li><li> Realizar um teste de Kolmogorov-Smirnov ou estudantes t-teste para avaliar diferenças estatísticas usando um nível de significância de 5%. Quantitativo, as comparações entre as células (por exemplo, tratado vs não tratado) possa ser feita. </li><li> Abra a versão planilha das parcelas de difusão que foi gerado pelo software de análise para cada cultura, ea média dos dados para cada condição para cada intervalo de tempo. Gerar um novo enredo difusão média para apresentar em documentos ou apresentações. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este artigo apresentou um panorama detalhado passo-a-passo de como aplicar o método de análise de CCI para determinar coeficientes de difusão de imagens de microscopia de proteínas marcadas com proteínas fluorescentes. A análise é independente da escolha da sonda com uma gama dinâmica muito ampla na densidade rotulagem e pode assim ser também aplicado a proteínas marcadas com pontos quânticos, bem como corantes e proteínas fluorescentes, tais como a EGFP. Para calcular os coefici...

A organização espaço-temporal quadridimensional e mobilidade lateral de proteínas da membrana plasmática estão fortemente regulada e pode desempenhar um papel na função da proteína, actividade e interacções proteína-proteína. Difusão lateral de proteínas da membrana plasmática, tradicionalmente tem sido estudada pelo cálculo de coeficientes de difusão para partículas individuais de lapso de tempo de imagem de ponto quântico ou tingir proteínas da membrana plasmática rotulados 2-4. Esta abordagem requer a inserção de uma etiqueta extracelular da proteína de membrana de plasma para quantum dot ou marcação com corante, o que pode comprometer a dobragem e função da proteína e, assim, não pode ser alcançada por algumas proteínas. O volume estérico de um quantum dot tem mostrado retardar a difusão da proteína de 5 e, além disso, apenas uma pequena fracção das proteínas na população são marcadas com pontos de quantum, e não se sabe se esta fracção é representativo para o total associação de proteínas de membrana de plasma. Tra única partículacking (SPT) medições de coeficientes de difusão da série de imagens de proteínas marcadas ponto quântico envolve o mapeamento das posições de pico fotografada das partículas com bidimensional Gaussian encaixa seguido por extensos algoritmos de análise. A análise é computacionalmente muito intensivo, exigindo extensa curva não-linear adequado em cada quadro da imagem de uma seqüência de lapso de tempo para aproximações da função microscópio ponto spread (tipicamente bidimensional Gaussians espacial) e vinculação posterior de posições de partículas em trajetórias de partículas descrevendo o movimento de moléculas individuais 6,7. A técnica de correlação de imagem recentemente desenvolvido, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) permite medições simples relativos dos coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática. A possibilidade de calcular rotineiramente coeficientes de difusão de proteínas da membrana marcados com proteínas fluorescentes por CCI é uma ferramenta única que detémvárias vantagens sobre quantum dot análise tradicional SPT: Sem inserção de marcas e consumindo tempo extracelulares rotulagem extracelular é necessária (linhas de células que expressam proteínas fluorescentes podem ser usados); coeficientes de difusão são extraídos a partir do conjunto total de proteínas fluorescentes em relação a um subconjunto marcado com pontos quânticos; A análise é simples, sem a necessidade de controlar as proteínas individuais e a análise pode ser realizada utilizando um código existente sem a necessidade de programação de utilizador adicionais. O método é rápido, porque é uma técnica de cálculo da média, que permite o cálculo rápido e cálculo dos coeficientes de difusão. Estas medições rápida difusão para a população de proteína complementar as informações de transporte molecular mais detalhada obtida para um subconjunto da população pelos métodos SPT meticuloso. tempo CCI correlaciona sequências de imagens de microscopia de fluorescência, que tenham sido previamente transformadas com o espaço de Fourier, e assim separa flflutuações uorescência devido a fotofísica daqueles devido ao transporte molecular 1. Como resultado, a CCI pode determinar o número de densidade, velocidade de fluxo e difusão de moléculas fluorescente etiquetado sendo imparcial por fotodegradação complexo ou intermitente dos fluoróforos. Isso faz com que CCI uma ferramenta útil para determinar rapidamente a dinâmica de difusão de proteínas de membrana de células marcadas com fluorescência, sem a necessidade de algoritmos de gravação personalizados. Além de proteínas marcadas com fluorescência, CCI também pode ser aplicado a proteínas de membrana marcado com quantum dot 8. Este documento oferece uma introdução passo-a-passo de como usar o CCI para extrair coeficientes de difusão de proteínas da membrana plasmática EGFP-marcadas, demonstrando como colocar a cultura, como usar o código e como avaliar as parcelas geradas, a partir do qual a difusão coeficientes são extraídos. Como exemplo, os dados obtidos por fiação conjunto disk-microscopia em reflexão interna semi-total de fluorescênciamodo nce (TIRF), de um renal proteína canal de água aquaporina-3 (AQP3) etiquetadas com EGFP é apresentado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

Difusão lateral e compartimentalização de proteínas da membrana plasmática são fortemente regulados em células e, assim, estudar esses processos irão revelar novas perspectivas para a função da proteína da membrana plasmática e regulação. Recentemente, k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) 1 foi desenvolvido para permitir medições de rotina de coeficientes de difusão diretamente a partir de imagens de proteínas da membrana plasmática marcados fluorescente, que evitaram desvios sistemáticos introduzidos pelo fotofísica sonda. Embora a base teórica para a análise é complexo, o método pode ser implementado por não-especialistas, utilizando um código livremente disponível para medir os coeficientes de difusão de proteínas. CCI calcula uma função de correlação de tempo a partir de uma imagem Pilha de microscopia de fluorescência após a transformação de Fourier de cada imagem para (k-) espaço recíproco. Subsequentemente, transformar média circular, logaritmo natural e linear encaixa para a função de correlação obtém-se o coeficiente de difusão. Estedocumento fornece um guia passo-a-passo para a análise de imagem e medição de coeficientes de difusão via CCI. Primeiro, uma sequência de imagens de alta taxa de quadros de uma proteína da membrana plasmática fluorescente etiquetado é adquirido através de um microscópio de fluorescência. Em seguida, uma região de interesse (ROI) evitando organelas intracelulares, vesículas em movimento ou salientes regiões da membrana é selecionado. A pilha de ROI é importado para um código disponível gratuitamente e vários parâmetros definidos (ver secção Method) são definidos para análise CCI. O programa então gera uma &quot;inclinação das encostas&quot; complô das funções de correlação tempo k-espaço, eo coeficiente de difusão é calculado a partir da inclinação da trama. Abaixo está um procedimento passo-a-passo CCI para medir o coeficiente de difusão de uma proteína de membrana usando o canal de água aquaporina renal-3 marcado com EGFP como um exemplo canônico.

Para adquirir pilhas de imagens adequadas a serem analisados ​​com CCI, podem ser utilizados diferentes sistemas de microscópio. É possível analisar sequências de imagens de um microscópio de epi-fluorescência, bem como uma configuração de disco TIRF ou spinning. A membrana deve ser plana, sem grandes organelas celulares em movimento ou em movimento vesículas / objetos. Este trabalho apresenta uma seqüência de imagens de lapso de tempo de AQP3 marcadas com GFP em células MDCK ao vivo de imagens em um mic...

Watch this Scientific Journal Video about Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy at JoVE.com

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Este documento fornece um guia passo a passo para a técnica de análise de flutuação k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) para medir coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática em células de mamíferos vivos.

Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K visualizações.  Aarhus University.  Este documento fornece um guia passo a passo para a técnica de análise de flutuação k-Espaço de Correlação Imagem Espectroscopia (CCI) para medir coeficientes de difusão de fluorescente etiquetado proteínas da membrana plasmática em células de mamíferos vivos. 

Vídeo: Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Usando Correlação Digital de Imagem para caracterizar as cepas de locais vasculares amostras de tecido

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...