Agradecemos os membros da nossa equipe, especialmente Blache MC para assistência técnica, bem como M e Irla B Imhof, pelo apoio e discussões proveitosas. Figuras de deflação e confinamento reproduzida cortesia do Nature Methods. Este projecto é apoiado por verbas institucionais do CNRS, Inserm e Marselha Universidade, e por concessões específicas da Região Provence-Alpes-Côte d&#39;Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 Blan 1214 01) e Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR é apoiado por uma bolsa de estudos do Nationale Contre le Cancer Ligue.

Neste vídeo, apresentamos um experimento de acompanhamento integral única partícula, usando-pontos quânticos direcionados para um receptor de membrana específico. O principal objectivo desta experiência consiste em discriminar diferentes tipos de comportamentos difusão molecular medidos no interior da membrana plasmática de células vivas. Com efeito, os movimentos moleculares resultantes na membrana pode desviar-se tipicamente de difusão Browniano sendo linearmente dirigida ou confinada dentro nanodomains 26-29, por exemplo. Temos o objetivo de, simultaneamente, seguindo como muitos receptores como tecnicamente possível, para fornecer um instantâneo da variedade resultante na dinâmica que ocorrem no interior da membrana de uma célula viva. Isto é, em última análise esperado para permitir decifrar dos mecanismos que regulam a sinalização celular dos receptores de superfície. 1. Cultura de Células <ol><li> Preparar a amostra celular: usar aderentes células COS-7 que expressam endogenamente o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) 30. Quandotrabalhar com células vivas sem antibióticos certifique-se de não ter nenhuma contaminação sub-detectável latente mediante a utilização de técnicas estéreis em todos os momentos durante a preparação. </li><li> Crescer as células em meio completo (DMEM com 10% de soro de vitela, 1% de glutamina, HEPES 1% e piruvato de sódio 1%, ver tabela de reagentes específicos a seguir), a 37 ° C, com 7% de CO 2, tendo o cuidado de tê-los em sub-confluentes crescimento exponencial, antes de espalhá-las em Lab-Tek. </li><li> No dia antes da experiência, a propagação de 5.000 células / poço em 8-bem câmaras (Lab-Tek) e incubar durante a noite. Contagem de células assegura uma densidade constante de célula, portanto, um rácio reprodutível de Quantum-pontos por célula. </li></ol> 2. Marcação celular Preparar quantum-pontos com um revestimento específico. Quantum-dots são nanopartículas fluorescentes, composto de semicondutores. Estas nanopartículas são de grande interesse, porque eles são muito brilhantes e fotoestável comparado ao clássicosondas fluorescentes 31,32, o que permite realização de um sinal apropriado para-ruído (SNR) para geração de imagens única molécula. <ol><li> Antes do experimento, produzir fragmentos Fab contra EGFR a partir de linha de células de hibridoma (mAb 108, ATCC HB-9764), por digestão com papaína, como descrito anteriormente 21. </li><li> Conjugado Fab com biotina, como por instruções do fabricante (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotinilação Kit; Thermo Scientific, Fig. 1A.). </li><li> Use quantum-dots funcionalizados com estreptavidina (Invitrogen) e emissor de a 605 nm (comprimento de onda de emissão óptimo para a detecção de brilho, e separação de autofluorescência celular). </li><li> Preparar a solução de rotulagem em meio completo (ver tabela de reagentes específicos), a fim de saturar as streptavidins presentes em torno dos pontos de Quantum-, bem como para prevenir a agregação e ligação não específica para as células e para a lamela. </li><li> Prepare duas soluções intermediárias:um com quantum-dots-estreptavidina e outro com Fab biotinilado, cada uma a 20 nM. </li><li> Misturar um volume igual de estas duas soluções: misturar os pontos quantum-com Fab na relação de 1:1 para se obter uma concentração final de trabalho de 10 nM Fab: Quantum-pontos complexos. Usando uma proporção equimolar favorece a formação de mono-funcionalizados complexos compostos de um quantum-ponto e um fragmento Fab biotinilado. Isto favorece a rotulagem monovalente, limitando observações artefacto, devido à ligação cruzada do receptor 33,34. </li><li> Incubar durante 15 minutos a 25 ° C, utilizando um agitador a 1.200 rotações por minuto para evitar a agregação. A mistura é então pronto para usar em células vivas. </li><li> Incubar as células em 100 uL de mistura durante 5 minutos a 37 ° C, com 7% de CO2. </li><li> Lave as células com os não-autofluorescente meio de imagem (HBSS tampão, HEPES 1%, ver tabela de reagentes específicos) pré-aquecida a 37 ° C. </li><li> Cuidadosamente remover o excesso de rótulos para evitar unnecessário estragar o SNR por não acoplado, fora do foco quantum-pontos, por lavagem extensivamente cada poço com imagem latente médio, normalmente de 5 vezes à temperatura ambiente, com pelo menos 5 minutos atraso antes da última lavagem. </li></ol> 3. Configuração óptica A configuração de vídeo-microscopia é composto de quatro partes principais: <ol><li> Um microscópio invertido com um cubo específico de fluorescência (excitação FF01-457/50, FF495-DI02 dicróico, e FF01-617/73 filtros de emissão, Semrock) e uma alta abertura numérica (1,3 ou 1,49) óleo de imersão-100x objectivo. </li><li> Uma lâmpada de mercúrio de 100 W (acoplado ao microscópio através de uma fibra óptica, evitando a interferir com a termorregulação). </li><li> Um 512 x 512 pixels sensibilidade elevada EMCCD câmara para atingir um SNR suficiente. </li><li> De uma incubadora para manter as amostras biológicas, a 37 ° C durante a experiência. </li></ol> 4. Aquisição <ol><li> Selecione as células isoladas e bem-propagação. Estefavorece a extensão da lamellipodia, belo apartamento, melhor adaptada a olhar para o movimento planar das moléculas da membrana. </li><li> Avaliar o estado fisiológico celular por sua aparência, tanto na luz transmitida e da fluorescência: tráfego vesicular intenso, ausência de sinais de necrose ou apoptose e autofluorescência baixa e média-forte de rotulagem quantum-dot (normalmente até 1.000 Quantum-pontos por célula, consulte Fig. 1B, C). </li><li> Selecione uma densidade de rotulagem elevado, o que é fundamental para monitorar simultaneamente receptores tantas quanto possível. Esta é realmente limitado, tanto pela fisiológico (expressão de superfície, a acessibilidade epítopo, o movimento lateral) e os parâmetros de algoritmos (não sobrepostos ponto propagação da funções (PSF), mesmo tendo em conta a desfocagem devido ao movimento, para permitir a detecção adequada e reconexão). </li><li> Para cada célula, em primeiro lugar adquirir uma imagem de campo de campo claro (de preferência utilizando DIC, se disponível), que pode ainda permitir a verificação para o aspecto de célulase os limites espaciais do lamellipodia. </li><li> Salve esta imagem com o mesmo nome do vídeo-stack (como cell1.tif &amp; cell1.stk por exemplo), em uma sub-pasta chamada dic, uma vez que, com essas convenções, o algoritmo pode encontrar automaticamente para trás a imagem correspondente para cada pilha. </li><li> Adquirir 1 a 3 vídeos por celular, de forma contínua, normalmente em 36-ms taxa, a taxa mais rápida possível em full frame com esta câmara. No entanto pode-se adquirir em freqüências mais altas, até 1-ms taxa, usando CCD dedicado com maior sensibilidade e / ou menos pixels. A tecnologia de transferência de quadro fornece atraso insignificante entre os quadros. </li><li> Electron melhoria multiplicam deve ser sempre ajustado no máximo (abaixo de saturação, se for o caso) para permitir atingir a sensibilidade única molécula, com um SNR suficiente, pelo menos acima de 20 dB (para detecção de pico eficiente 1), normalmente em torno de 25-30 dB. </li><li> Normalmente, adquirir 300 quadros por pecado de vídeo,ce trajetórias são reconstruídos sobre ~ 100 quadros, em média, em sua maioria limitados por longas eventos que piscam. Frequência de vídeo e de comprimento pode ser adaptado para uma determinada medida, o que poderia exigir vestígios mais longos, por exemplo. </li></ol> 5. Análise de MTT <ol><li> Selecione o caminho para o diretório contendo os arquivos de vídeo para avaliar um conjunto de dados fornecido com Matlab ou Octave. </li><li> Para iniciar a análise totalmente automatizado 1,35, digite o comando detect_reconnex23 em Octave, ou MTT23i em Matlab. Este programa representa a &quot;versão 2.3, com interface de usuário&quot; e está disponível para download, juntamente com a versão anterior 2.2. É primeiro exibe uma interface gráfica listar todos os parâmetros utilizados, como mostrado na fig. 2. </li></ol> 6. Os resultados representativos MTT analisa automaticamente cada gravador de vídeo, para entregar os traços de alvos detectados e estimados, complementadas por outros emInvestigações, tais como detecção de confinamento. Esta última análise, permite que vestígios de mapeamento sobre as imagens de células (Fig. 1C e 3). Descrição MTT A análise de MTT núcleo é executada através de cada quadro, invocando 3 tarefas principal (Fig. 3): <ol><li> Detecção da presença ou ausência de um alvo (quantum-ponto), dentro de uma sub-região de deslizamento sucessivamente centrada em torno de cada pixel, onde duas hipóteses são comparados: presença quer de um sinal, com o PSF modelized como um bi-dimensional Gaussian pico , ou apenas o ruído, utilizando um limiar de alarme segurar o suficiente baixa falso, com menos de uma detecção espúrio por quadro. Isto leva a um mapa de probabilidade de detecção. Cada máximo local é considerado como um alvo putativo, assegurando que o seu nível de probabilidade é maior do que um valor mínimo, definido de acordo com a probabilidade desejada de falso alarme (PFA). Esse limite é definido baixa o suficiente para discriminar com eficiência signais de ruído, evitando, na melhor das detecções falsas (PFA de 10 -6 por padrão, para garantir a menos de um erro em 512 x 512 pixel imagens), permitindo ainda uma probabilidade suficientemente elevada de detecção, atingindo o 1 previsto teoricamente ideal. Note-se que a necessidade de usar uma sub-região implica que as fronteiras de imagem (3 pixels, para uma janela padrão de 7 x 7 pixels) não pode ser avaliada. </li><li> Estimativa, para cada alvo detectado, dos parâmetros relevantes, tais como sub-pixel de posição e intensidade do sinal. Para cada alvo detectado, pelo menos um-quadrado ajuste de Gauss-Newton é em seguida realizada para estimar a posição, largura e altura do Gaussian detectado. Isto proporciona nomeadamente a posição de subpixel do corante (10 a 20 nm para exatidão valores típicos da SNR e corantes imóvel ou lentamente difusão, aumentando até ~ 100 nm para corantes difusão a 0,1 uM 2 / s). </li><li> Reconexão das novas metas com otraços já construiu ao longo dos quadros anteriores. O conjunto de novas metas é combinado com o conjunto de traços anteriores. Para este efeito, a fim de atribuir a cada alvo a um traço, se possível, todas as informações disponíveis estatístico obtido a partir do passo de detecção é usado, não só a posição, mas também a intensidade, a largura de piscar e estatísticas associadas. Assim, as metas não são designadas para o próximo traço: em caso de vestígios de passagem, intensidade, velocidade, largura e piscando será considerada. Isto proporciona a pontuação reconexão estatisticamente ideal. Essa estratégia evita, quando possível, a polarização do reconexão em direção aos vizinhos mais próximos. </li></ol> Picos detectados pode ser rejeitado se a posteriori a sua estimativa ou reconexão falha. Um teste especial trata a detecção de novos picos, o que poderia iniciar vestígios novos. Este teste utiliza um PFA mais rigoroso (10 -7), uma vez que voltar a ligar um pico a um traço pode ser interpretada de facto como um ó validação<html> f sua relevância (este critério ser, por definição, não é aplicável para novos picos). Análise da trajetória Confinamento transiente possível é em seguida avaliada por uma função inversamente relacionada com a difusão local 24-29. Aplicando um limiar permite definir confinado ou não episódios. Iterando sobre todos os vestígios destes, podemos mapear a dinâmica da membrana, em termos de confinamento transitória / desacelerar eventos. Isto pode ser alternativamente representado usando o binário ou valores discretos da presente índice confinamento. Por padrão, o MTT executa automaticamente as tarefas, economizando 8 parâmetros de pico em um arquivo de texto: número de quadro, i e j posição, intensidade de sinal, raio, offset e piscar, para cada quadro do vídeo (grupo de 7 linhas) e trace (coluna) . Estes parâmetros de saída pode ser recarregado em Matlab ou Octave usando o script fread_data_spt para continuar a analisar os vestígios ou seja, ou de intensidade de sinal, como exemplificado na<html> &quot;Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt&quot;&gt; MTT_example roteiro em anexo. Outras análises levar a mapear vestígios sobre cada célula (Fig. 1C e 3) e para proporcionar uma distribuição do histograma para os parâmetros relevantes (tais como as intensidades de pico, ou valores SNR de difusão locais). Para cada arquivo, média e desvio padrão de cada parâmetro são salvos em um arquivo de texto, juntamente com uma imagem dos histogramas. Distribuições logarítmicas, tais como, por deslocamentos quadrados r 2, levar a média geométrica. O coeficiente de difusão D é calculado a partir de um ajuste linear ao longo dos cinco primeiros pontos da curva de MSD. Esses valores fornecem uma visão geral de um experimento envolvendo a cinética exemplo de reações celulares ou tratamentos farmacêuticos / enzimática que afetam a organização da membrana. Uma vez que MTT é um código de fonte aberta, este aspecto pode ser prontamente adaptado para qualquer investigação dedicado. 599fig1.jpg &quot;alt =&quot; Figura 1 &quot;/&gt; Figura 1. Monitorização dinâmica receptores de membrana por MTT. Componentes (a) a membrana, tais como o EGFR, são marcados com quânticos-pontos acoplados a fragmentos Fab biotinilado (desenho esquemático com raspagem aproximadamente correcta de cada molécula). (B) da imagem fluorescente típica adquirido a partir de um vivo COS-7 de células, com 36-ms de tempo de exposição, que descreve difracção limitada picos correspondentes ao receptor individualmente rotulado. (C) de saída da análise de MTT exibindo as trajectórias reconstituídos dos receptores, cobrindo a imagem de campo claro da célula. <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. Parâmetros de entrada MTT. Correndo MTT23i abre uma interface gráfica de usuário listando todos os parâmetros de entrada, nomes e valores padrão, como descrito em nossa publicação anterior 1. Nos parâmetros espaciais algoritmo, eo tempo (janelas de pesquisa, o raio de pico, a difusão máxima<html> e piscando) são adimensionais em unidades padrão, pixels e quadros. Calibrações pode ser aplicado a posteriori para converter resultados de saída. Os valores padrão, correspondente a um 512BFT Cascade com ampliação de 100x, são o tamanho do pixel: 156 nm / pxl e atraso quadro: 36 ms / frame. Os investigadores devem otimizar alguns parâmetros críticos, tais como o coeficiente de difusão máxima esperada (&quot;Diff max&quot;) e desaparecimento de piscar máximo (&quot;T off&quot;). Estes dois limites de espaço e tempo são quase os únicos que precisam de ser reexaminadas para uma determinada condição experimental, sendo os outros definidas para valores padrão robustos. Por exemplo, o número de falsos alarmes está directamente definido para garantir menos de um erro por milhão de pixels, por conseguinte, menos do que um por quadro, o que é satisfatório na maioria dos casos. Todos os parâmetros são salvos em um arquivo de texto na pasta de saída, permitindo que os usuários verifiquem posteriormente as configurações que foram usadas para análise. s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3. Principais passos de a análise de MTT. Partindo de uma pilha experimental de imagens de fluorescência, os picos são sequencialmente e automaticamente detectado, estimada por um ajuste de Gauss e religado ao longo quadros (primeira gama de operações, parte superior do fluxograma). Traços pode ainda ser analisado para o confinamento putativo, por exemplo, em última análise, levando a um mapa dinâmico de descritores relevantes (segunda gama de operações, parte inferior). <img src="/files/ftp_upload/3599/3599fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. Valência rotulagem não tem impacto sobre MTT. Para avaliar o possível viés introduzido pela rotulagem multivalente artefactual, análise de MTT foi realizado para rastrear EGFR endógeno marcado com 2 esquemas diferentes, para gerar e analisar mapas de trajetórias. (A) receptores foram marcados com Fab biotinilado e quantum-dots605-estreptavidina, como descrito no protocolo.Neste caso, a valência de multi-quantum-pontos e streptavidins pode resultar em vários receptores de acoplamento a um corante único. (B) receptores foram marcados com Fab directamente acoplado a um corante orgânico, Atto647N. Neste caso, um Fab, portanto, um receptor, pode ser acoplado a mais do que um corante. (C) A média de deslocamento da curva quadrada (MSD) foi calculada para todos os traços de cada célula, rotulado ou com quantum-dot ou corantes ATTO (gráficos esquerda e direita, respectivamente). Coeficientes de difusão foram computados por ajuste linear ao longo dos cinco primeiros pontos da MSD (linha vermelha pontilhada). Cada esquema de marcação levou a valores de difusão semelhantes (gráfico central). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 células), Atto: Atto647N (n = 7 células), ns: não significativo (teste t de Student valor p&gt; 0,05).

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J. 69, 989-993 (1995).</li><li>Jacobson, K., Dietrich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+lipid+rafts.">Looking at lipid rafts.</a> Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).</li><li>Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confined+lateral+diffusion+of+membrane+receptors+as+studied+by+single+particle+tracking+(nanovid+microscopy).+Effects+of+calcium-induced+differentiation+in+cultured+epithelial+cells.">Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells.</a> Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).</li><li>Livneh, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+deletions+in+the+cytoplasmic+kinase+domain+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+do+not+affect+its+laternal+mobility.">Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility.</a> J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).</li><li>Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot+bioconjugates+for+imaging,+labelling+and.">Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and.</a> 4, 435-446 (2005).</li><li>Wu, X., Bruchez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dot+conjugates.">Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates.</a> Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).</li><li>Mohammadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation-induced+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+protein+tyrosine+kinase.">Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase.</a> Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).</li><li>Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monovalent,+reduced-size+quantum+dots+for+imaging+receptors+on+living+cells.">Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells.</a> Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).</li><li>Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Serg&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-target+tracing+(MTT)+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface.">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protocol Exchange. , (1038).</li><li>Groc, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+trafficking+of+neurotransmitter+receptor:+comparison+between+single-molecule/quantum+dot+strategies.">Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).</li><li>Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>He, H. T., Marguet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+nanodomains+in+living+cell+membrane+by+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).</li><li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+complexes+and+clusters:+functional+advantages+and+methodological+hurdles.">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).</li><li>Kao, H. P., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+single+fluorescent+particles+in+three+dimensions:+use+of+cylindrical+optics+to+encode+particle+position.">Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position.</a> Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Em uma única partícula de rastreamento, ao lado dos aspectos de células e microscopia, a análise representa uma parte substancial do trabalho. Isso resolve o algoritmo usado para executar as três tarefas principais: detectar, estimando-se e reconectando picos em cada frame. Mas o aspecto conseqüente deste trabalho reside na elaboração do algoritmo em si, que podem precisar ser adaptado para qualquer nova investigação dedicada, essencialmente, para os últimos, os passos extras (como decifrar os modos de movime...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Linha COS-7 de células </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td><td> 5.000 células / poço </td></tr><tr><td> HBSS sem Ca2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14175 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300 </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 8-bem Lab-Tek </td><td> NUNC </td><td> 155441 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> QDot-605 estreptavidina </td><td> Invitrogen </td><td> Q10101MP </td><td> 20 mM </td></tr><tr><td colspan="4"> Fab biotinilado (para a síntese de Fab, ver referência 21) </td></tr><tr><td> Fab de mAb 108 </td><td> ATCC </td><td> HB-9764 </td><td> 200 g </td></tr><tr><td> NHS-biotina<html></td><td> Thermo Scientific </td><td> 21435 </td><td> 18,5 mg </td></tr><tr><td colspan="4"> Conclua médio </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 41965 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> SIGMA </td><td> F7524 </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> GIBCO </td><td> 25030 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> GIBCO </td><td> 11360 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Imagem médio </td></tr><tr><td> HBSS com Ca2 + </td><td> GIBCO </td><td> 14025 </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> GIBCO </td><td> 15630 </td><td> 250 ul </td></tr></tbody></table>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Equipamento </td><td> Companhia </td><td> Referência </td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE2000U </td></tr><tr><td> Lâmpada fluorescente </td><td> Nikon </td><td> Intensilight C-HGFIE </td></tr><tr><td> 1,3 NA 100x objetivo </td><td> Nikon </td><td> Planeje Fluor 1,30 </td></tr><tr><td> 1,49 NA objetivo 100x </td><td> Nikon </td><td> APO TIRF 1,49 </td></tr><tr><td> Câmera </td><td> Roper Scientific </td><td> Cascade 512 B </td></tr><tr><td> Caixa termostatizada </td><td> Vida Serviços de Imagem </td><td> A Caixa </td></tr></tbody></table> Apêndice: Script exemplo de análise complementar MTT função MTT_example (file_name) %%% Exemplos básicos que mostram como recuperar resultados de saída MTT %%% Plotar cada trace e para construir o histograma %%% De intensidades de fluorescência se nargin &lt;1% file_name não prestado? files = dir (&#39;* stk.&#39;); se IsEmpty (arquivos), disp (&#39;não há dados no diretório corrente &quot;), o retorno final, . file_name = arquivos (1) nome; padrão%: arquivo stk primeiro disp ([&#39;usando&#39; file_name &#39;por padrão&#39;]) final file_param = [nome_arquivo &#39;_tab_param.dat&#39;]; arquivo de saída% % Dados carregar% cd% (&#39;output23&#39;) ou (&#39;output22&#39;), de acordo com a versão utilizada % Disclaimer: versão 2.2 gera apenas 7 parâmetros, Parâmetro% extra, ruído, foi adicionado na versão 2.3 % Para ler todos os parâmetros de uma só vez, em uma única tabela % Tab_param = fread_all_param (file_param); Ta%b_i = tab_param (2:8: end, :); tab_j = ... % Para ler todos os parâmetros (exceto frame_number) em tabelas separadas % [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param); tab_i = fread_data_spt (file_param, 3); índice é de 3% porque o número de rastreamento e número do quadro, não informativo, são descartados! tab_j = fread_data_spt (file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8); Loop%% em relação a traços N_traces = tamanho (tab_i, 1); Tabelas% são N_traces linhas por colums N_frames para ITRC = 1: N_traces No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)&gt; 0;% não piscam passos apenas plot (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index)) &amp; Nbsp; xlabel (&#39;i (pixel)&#39;), ylabel (&#39;j (pixel) &quot;) title ([num2str &#39;trace #&#39; (ITRC)]) disp (&#39;Por favor, pressione qualquer tecla para rastreamento próximo), pause final %% Histograma Fluo N_datapoints = SUM (tab_blk (:)&gt; 0);% não só passos piscando hist% (tab_alpha (tab_blk&gt; 0), 2 * sqrt (N_datapoints)) usando 2sqrt (N) caixas xlabel (&#39;intensidade (au)&#39;), ylabel (&#39;ocorrência&#39;) do título (&#39;histograma de partículas de intensidade de fluorescência&#39;)

mapping molecular diffusion in the plasma membrane by multiple-target tracing (mtt)

Nosso objetivo é obter uma descrição detalhada dos processos moleculares que ocorrem em membranas celulares em diferentes funções biológicas. Temos o objetivo de caracterizar a organização complexa e dinâmica da membrana plasmática a nível molécula única, através do desenvolvimento de ferramentas analíticas dedicadas a uma única partícula Tracking (SPT) em alta densidade: Multiple-Target de rastreamento (MTT) 1. Uma única molécula de videomicroscopia, oferecendo milissegundo e nanométrica resolução 1-11, permite uma representação detalhada da organização da membrana 12-14 com precisão o mapeamento descritores, tais como receptores de células de localização, mobilidade confinamento, ou interações. Nós revisitado SPT, tanto experimentalmente e através de algoritmos. Aspectos experimentais incluíram optimizar a instalação ea marcação celular, com um ênfase particular ao atingir a densidade de rotulagem mais alta possível, a fim de proporcionar um instantâneo dinâmico de um dinâmica moleculars que ocorre no interior da membrana. Questões algorítmicas preocupado cada passo usado para a reconstrução trajetórias: a detecção de picos, a estimativa e religação, dirigida por ferramentas específicas de análise de imagem 15,16. Implementar deflação após a detecção permite picos de resgate inicialmente oculta por vizinhos, os picos mais fortes. De nota, melhorando a detecção impacta diretamente a reconexão, reduzindo as lacunas dentro de trajetórias. Performances foram avaliados através de simulações de Monte Carlo para a densidade de rotulagem e vários valores de ruído, que normalmente representam as duas grandes limitações para medições paralelas na resolução espaço-temporal alta. A precisão nanométrica 17 obtido para moléculas individuais, utilizando quer sucessiva de ligar / desligar óptica photoswitching ou não-linear, pode fornecer observações exaustivos. Esta é a base de métodos Nanoscopia 17 como STORM 18, PALM 19,20, 21 ou RESOLFT STED 22,23, whiCH podem muitas vezes exigem amostras de imagens fixas. A tarefa central é a detecção e estimativa de difração limitada picos que emanam de um único moléculas. Assim, fornecendo pressupostos adequados, tais como lidar com uma precisão posicional constante em vez do movimento browniano, MTT é diretamente adequado para análises nanoscópicas. Além disso, o MTT pode fundamentalmente ser utilizado em qualquer escala: não só para as moléculas, mas também para células ou animais, por exemplo. Assim, o MTT é um algoritmo de seguimento poderoso que encontra aplicações em escalas moleculares e celulares.

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Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-alvo é um algoritmo de rastreio caseiro desenvolvido para controlar individualmente moléculas marcadas no interior da membrana plasmática de células vivas. Detecção eficaz de, estimar e rastreamento de moléculas ao longo do tempo a alta densidade de fornecer uma ferramenta de fácil utilização, abrangente para investigar a dinâmica da membrana em nanoescala.

Mapeamento de Difusão Molecular na membrana plasmática por Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

mapping-molecular-diffusion-plasma-membrane-multiple-target-tracing

Research

JoVE Journal

Biology

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

17.1K visualizações.  Parc scientifique de Luminy. Multiple-alvo é um algoritmo de rastreio caseiro desenvolvido para controlar individualmente moléculas marcadas no interior da membrana plasmática de células vivas. Detecção eficaz de, estimar e rastreamento de moléculas ao longo do tempo a alta densidade de fornecer uma ferramenta de fácil utilização, abrangente para investigar a dinâmica da membrana em nanoescala.

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Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Medição Perto membrana plasmática e global Dynamics cálcio intracelular em astrócitos

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Biologia

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Medição quantitativa do GLUT4 translocação para a membrana plasmática por citometria de fluxo

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Em tempo real, análises de Transporte Retinol pelo receptor de membrana da proteína de Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

Fácil medição de Difusão Coeficiente de EGFP-tag Plasma Proteínas de Membrana Usando k-Space espectroscopia de correlação de Imagem

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

Imagem Plasma Membrane Deformações Com pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Medição simultânea de mitocondrial de cálcio e mitocondrial potencial de membrana em células vivas por Microscopia fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Determinação da membrana plasmática de particionamento para proteínas associadas perifericamente

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and activates the mixed lineage kinase-like domain pseudokinase, MLKL, to rupture or permeabilize the plasma membrane. Necroptosis is an inflammatory pathway associated with multiple pathologies including autoimmunity, infectious and cardiovascular diseases, stroke, neurodegeneration, and cancer. Here, we describe protocols that can be used to characterize MLKL as the executioner of plasma membrane rupture in necroptosis. We visualize the process of necroptosis in cells using live-cell imaging with conventional and confocal fluorescence&#160;microscopy, and in fixed cells using electron microscopy, which together revealed the redistribution of MLKL from the cytosol to the plasma membrane prior to induction of large holes in the plasma membrane. We present in vitro nuclear magnetic resonance (NMR) analysis using lipids to identify putative modulators of MLKL-mediated necroptosis. Based on this method, we identified quantitative lipid-binding preferences and phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) as critical binders of MLKL that are required for plasma membrane targeting and permeabilization in necroptosis.

We report methods for characterization of MLKL-mediated plasma membrane rupture in necroptosis including conventional and confocal live-cell microscopy imaging, scanning electron microscopy, and NMR-based lipid binding.