A PLD ocupa a Cadeira de Pesquisa do Canadá em Engenharia de Proteínas. Este trabalho foi financiado por uma bolsa dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde para a PLD. Este trabalho também foi apoiado por um Grant-in-Aid para pesquisas científicas da Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (nº 23310171) e da Japan Bio-oriented Technology Research Advancement Institution (BRAIN). Somos gratos aos Drs. Chris Marshall e Mike Kuiper pelo trabalho pioneiro que levou à FIPA. Também agradecemos ao Dr. Sakae Tsuda por fornecer instalações para alguns deste trabalho e à Dra.

1. Crescendo cristais de gelo únicos
<ol><li>Pegue uma panela de metal limpa (15 cm de diâmetro, 4,5 cm de altura) que se encaixe e possa flutuar sobre, um banho de resfriamento etileno glicol.</li>
	<li>Preparem os moldes cilíndricos de cloreto de polivinil (PVC), (4,5 cm de diâmetro, 3-4 cm de altura, 4 mm de espessura), serrando seções de um tubo.<ol>
<li>Corte um entalhe, (1 mm de largura, 2 mm de altura) em um lado (Figura 1A).</li>
		<li>Prepare quantos moldes possam caber confortavelmente na panela (Figura 1B). Nota: Estudo mostrou que o álcool polivinyl (PVA) pode afetar a nucleação do gelo22. No entanto, em nosso sistema de PVC de molde aberto não encontramos problemas de formação atípica de gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique uma película leve de graxa de vácuo no anel de superfície inferior de cada molde, que é a superfície com o entalhe cortado. Sele esta superfície untada e entalhada em uma panela de metal com os entalhes orientados para longe do centro da panela. Tenha cuidado para não encher ou obstruir os entalhes com graxa.</li>
	<li>Adicione 0,22 μm de água filtrada e desgaseada/desomuionizada ao centro da panela, mas fora dos moldes, e deixe a água entrar lentamente nos moldes através dos entalhes. Tenha cuidado para não introduzir bolhas. A camada de água deve ter aproximadamente 5 mm de profundidade.</li>
	<li>Coloque a panela em um banho de etileno glicol controlado pela temperatura resfriado a -0,5 °C. A panela deve estar perfeitamente nivelada. Adicione pesos de lastro nas laterais da panela, se necessário.</li>
	<li>Depois que a panela e a água atingirem -0,5 °C, adicione um pequeno pedaço de gelo no meio da panela, fora dos moldes.<ol>
<li>Isso nucleará o crescimento do gelo na água superfriada através da panela e nos moldes. O pequeno entalhe na parte inferior de cada molde permite que apenas um cristal de gelo se propague, resultando em um único cristal de gelo em cada molde.</li>
		<li>Incubar durante a noite para formar uma camada de gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ao longo dos próximos três dias adicione 13 ml de água desgassada/desionizada a cada molde uma vez por dia e deixe cair a temperatura do banho de etileno glicol após cada adição a -0,8 °C no primeiro dia, para -1,1 °C no segundo dia, e para -1,5 °C no terceiro dia.<ol>
<li>Incubar a essas temperaturas durante a noite.</li>
		<li>No quarto dia, os moldes devem estar completamente cheios de gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire os moldes da panela, empurre os cristais de gelo para fora dos moldes e armazene em uma superfície limpa, como um barco de pesagem, em um congelador de -20 °C por aproximadamente 1 hora antes de manusear.</li>
	<li>Em vez de preparar muitos pequenos cristais de gelo, um grande cristal de gelo de vários litros em volume pode ser preparado em uma incubadora de temperatura constante, como descrito pelo Knight23. O grande cristal de gelo pode ser armazenado por um ano ou mais se mantido coberto em um congelador de -15 a -20 °C. Porções de cristal único podem ser cortadas do bloco de gelo com uma serra conforme necessário.</li>
</ol>2. Determinando singularidade e orientação do cristal de gelo
<ol><li>Determine se o gelo expelido do molde é um único cristal observando em uma sala de congelador, entre duas polaroides cruzadas (Figura 1D).<ol>
<li>Se o cristal de gelo é único, então não devem ser vistas rachaduras ou descontinuidades, e a direção da luz não deve mudar dentro do cristal de gelo. Nota: Se uma sala de freezer não estiver disponível, uma sala fria pode ser usada em todas as etapas necessárias, sendo cautelosa para trabalhar rapidamente e manusear o gelo com moderação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Devido à birefringência de gelo, pode-se determinar a orientação do eixo cao mesmo tempo. Use as seguintes informações para determinar a orientação:<ol>
<li>Quando o eixo cé exatamente paralelo à luz do incidente, em teoria, nenhuma luz passará pelas polaroides cruzadas. Se a luz incidente é intitulada ligeiramente de paralelo com o eixo c,um espectro multicolorido uniforme de luz é transmitido através do cristal quando é girado entre as polaroides cruzadas. Esta transmissão uniforme surge da inatividade óptica do gelo Ih ao longo de seu eixo c24. O plano basal do cristal de gelo é normal para o eixo c.</li>
		<li>Quando o eixo cestiver mais distante do paralelo com a luz incidente e o cristal de gelo é girado entre as polaroides cruzadas, a luz transmitida alternará entre 0-100% de transmissão a cada 90° de rotação do cristal.</li>
		<li>Mais comumente, o eixo cserá normal ao plano circular do cristal cilíndrico de gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a orientação dos eixosa por gelo colocando25, o que é feito embrulhando o cristal de gelo firmemente em papel alumínio, cutucando um pequeno buraco com uma agulha através da folha no gelo no plano basal (normal ao eixo c),e colocando-o sob vácuo por 20 minutos.<ol>
<li>Este tratamento produzirá uma gravação com simetria hexagonal no plano basal, onde os eixos acorrem através dos vértices da estrela de seis lados (Figura 2A).</li>
		<li>Se desejar, o cristal de gelo pode ser cortado com uma serra paralela ou perpendicular a um lado do hexágono para montá-lo com um plano prisma primário ou secundário perpendicular ao dedo frio, respectivamente (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Adsorção de Proteínas anticongelantes fluorescentes rotuladas para um único cristal de gelo
<ol><li>Monte um único cristal de gelo sobre o dedo frio (Figura 1C) primeiro entediando uma cavidade no topo do cristal. Para isso, alternar derreter o gelo com duas hastes de alumínio de diâmetro ligeiramente diferente, mas semelhante ao diâmetro do dedo frio, para formar a cavidade em que o dedo frio pode caber.</li>
	<li>Esfrie o dedo frio a -0,5 °C, coloque na cavidade de gelo e mantenha o cristal de gelo no lugar até congelar até congelar até o metal (Figura 2B). Evite bolhas de ar ao fixar o cristal no dedo, pois elas dificultam a transferência eficiente de calor do dedo para a haste.</li>
	<li>Encha um copo hemisférico que tenha aproximadamente o dobro do diâmetro do cristal de gelo com água ou tampão desionizado filtrado, resfriado a aproximadamente 4 °C. Submergir o cristal de gelo frio ligado ao dedo no copo e remover o excesso de água ou tampão de tal forma que o topo do cristal de gelo esteja aproximadamente nivelado com a camada líquida e o gelo não esteja tocando as paredes do copo.<ol>
<li>Cubra o copo com isolamento e baixe a temperatura para -5 °C.</li>
		<li>Aguarde aproximadamente 1 hora para que o cristal de gelo se forme em um hemisfério, verificando seu status aproximadamente a cada 20 minutos (Figura 2C).</li>
		<li>O gelo tomará a forma do copo hemisférico derretendo e cultivando o cristal de gelo, mas nunca deve crescer demais para tocar as paredes do copo. Deve haver pelo menos uma distância de 1 cm entre a parede e o hemisfério e o dedo frio não deve se projetar do gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire o copo do cristal de gelo e adicione a solução de proteína fluorescente a um volume final de 25-30 ml e concentração de análise desejada, tendo o cuidado de manter o volume líquido total no copo inalterado. Uma concentração típica da AFP é de 0,1 mg/ml.<ol>
<li>Resubmergar o cristal de gelo no copo para que o topo do cristal de gelo esteja nivelado com o líquido e o cristal de gelo não toque nas paredes do copo (Figura 2D).</li>
		<li>Solte a temperatura do dedo frio para -8 °C e deixe a solução de proteína congelar no cristal de gelo por 2-3 horas, agitando a solução com frequência. O gelo formado a partir da solução proteica deve ser de pelo menos 5 mm antes de parar o crescimento do gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire o cristal de gelo do copo enquanto ainda estiver preso ao dedo frio. Retire o gelo deste último aquecendo o refrigerante através do dedo frio para pouco mais de 0 °C e espere até que o cristal de gelo derreta.</li>
	<li>Coloque o lado plano de cristal para baixo sobre uma superfície limpa, como um prato de pesagem, tomando cuidado para não tocar no gelo recém-formado e armazenar a -20 °C por pelo menos 20 minutos antes de entregar.</li>
</ol>4. Visualização de planos de gelo ligados à proteína anticongelante
<ol><li>A visualização da fluorescência é feita em um congelador escurecido ou sala fria, colocando o fundo de cristal de gelo para baixo sob lâmpadas com filtros de excitação específicos de comprimento de onda para excitar o rótulo fluorescente e filtros de emissão da câmera para bloquear qualquer outra luz inespecífica. Com base no padrão, os planos de gelo que são vinculados por AFPs podem ser estimados (Figura 4).</li>
	<li>Se as luzes específicas do comprimento de onda não estiverem disponíveis, uma caixa de luz UV pode ser usada em vez disso.</li>
	<li>As etches de gelo tradicionais também podem ser realizadas simplesmente permitindo que o hemisfério de gelo sublimar a -20 °C por pelo menos 3 horas, após o qual o pó de proteína residual pode se tornar visível na superfície do gelo (Figura 5).</li>
	<li>O passo 2.3 pode ser repetido para determinar a orientação dos eixosa do hemisfério de gelo completo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+peptides+and+glycopeptides+in+cold-water+fishes.">Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes.</a> Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).</li><li>Sidebottom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemistry+-+heat-stable+antifreeze+protein+from+grass.">Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass.</a> Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).</li><li>Tomczak, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+stabilization+of+membranes+at+low+temperatures+by+an+antifreeze+protein.">A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein.</a> Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).</li><li>Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperactive+Ca2+-dependent+antifreeze+protein+in+an+antarctic+bacterium.">Hyperactive Ca2+-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium.</a> FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algal+ice-binding+proteins+change+the+structure+of+sea+ice.">Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).</li><li>Raymond, J. A., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+inhibition+as+a+mechanism+of+freezing+resistance+in+polar+fishes.">Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).</li><li>Baardsnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+ice-binding+face+for+type+i+antifreeze+protein.">New ice-binding face for type i antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).</li><li>Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+ice-binding+face+of+a+plant+antifreeze+protein.">Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein.</a> FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).</li><li>Garnham, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+ice-binding+site+of+an+antifreeze+protein+revealed+by+mutagenesis+and+fluorescent+tagging.">Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging.</a> Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).</li><li>Nutt, D. R., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+function+of+the+hydration+layer+around+an+antifreeze+protein+revealed+by+atomistic+molecular+dynamics+simulations.">Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).</li><li>Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+alpha-helical+antifreeze+peptides+on+specific+ice+crystal-surface+planes.">Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes.</a> Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).</li><li>Antson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+mechanism+of+ice+binding+by+type+iii+antifreeze+proteins.">Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins.</a> J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).</li><li>Graether, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-helix+structure+and+ice-binding+properties+of+a+hyperactive+antifreeze+protein+from+an+insect.">Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect.</a> Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).</li><li>Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+spruce+budworm+antifreeze+protein+interacting+with+ice+crystals:+Basal+plane+affinity+confers+hyperactivity.">Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity.</a> Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).</li><li>Middleton, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifreeze+protein+from+freeze-tolerant+grass+has+a+beta-roll+fold+with+an+irregularly+structured+ice-binding+site.">Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site.</a> J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).</li><li>Scotter, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basis+for+hyperactivity+of+antifreeze+proteins.">The basis for hyperactivity of antifreeze proteins.</a> Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).</li><li>Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+biomolecules+to+ice+and+their+effects+upon+ice+growth.+1.+Measuring+adsorption+orientations+and+initial+results.">Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results.</a> Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).</li><li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+insect+antifreeze+protein+and+its+implications+for+ice+binding.">Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding.</a> J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+naturally+inactive+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein+into+one+that+can+stop+the+growth+of+ice.">Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice.</a> FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).</li><li>Holt, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+antifreeze+proteins+and+poly(vinyl+alcohol)+on+the+nucleation+of+ice:+A+preliminary+study.">The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study.</a> Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).</li><li>Knight, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+growing+large,+optically+''perfect''+ice+crystals.">A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals.</a> J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).</li><li>Hobbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ice physics. , 200-248 (1974).</li><li>Knight, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+crystallographic+etch+pits+on+ice,+and+its+application+to+the+study+of+hailstones.">Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones.</a> J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).</li><li>Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+antifreeze+polypeptide+and+its+mechanistic+implications.">Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications.</a> Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).</li><li>Sicheri, F., Yang, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-binding+structure+and+mechanism+of+an+antifreeze+protein+from+winter+flounder.">Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder.</a> Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).</li><li>Devries, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+glycopeptides+and+peptides+in+inhibition+of+crystallization+of+water+in+polar+fishes.">Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes.</a> Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).</li><li>Pertaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+evidence+for+quasi-permanent+attachment+of+antifreeze+proteins+to+ice+surfaces.">Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces.</a> Biophys. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+superior+activity+of+the+large+isoform+of+snow+flea+antifreeze+protein.">Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein.</a> Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).</li><li>Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+active+qae+isoform+confers+thermal+hysteresis+activity+on+a+defective+sp+isoform+of+type+iii+antifreeze+protein.">Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein.</a> FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).</li><li>Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+ice+growth+and+melting+modifications+by+antifreeze+proteins.">New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins.</a> J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).</li><li>Celik, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+experiments+reveal+that+antifreeze+proteins+bound+to+ice+crystals+suffice+to+prevent+their+growth.">Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).</li><li>Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+beta-helical+model+of+an+ice+nucleation+protein+with+bridged+active+sites.">Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites.</a> BMC Struct. Biol. 11, (2011).</li></ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Desenvolvimento do método de gravação de gelo por Charles Knight para determinação de aviões de gelo ligados à AFP estudos muito avançados sobre o mecanismo de ligação de gelo por AFPs. Considerando que as estruturas de AFPs poderiam ser resolvidas pela cristalografia de raios-X26,27, não havia um método óbvio para deduzir a superfície complementar no gelo a que a AFP se ligava. Quando o tipo I AFP do flounder de inverno foi inicialmente caracterizado, foi hipótese para se ligar aos planos princ...

A produção de proteínas anticongelantes (AFPs) é um importante mecanismo de sobrevivência de alguns organismos que vivem em ambientes carregados de gelo. Até recentemente, pensava-se que a única função das AFPs era prevenir ou retardar o crescimento de cristais de gelo internos que bloqueassem a circulação, causassem danos teciduais e estresse osmótico. Organismos que não toleram qualquer grau de congelamento, como peixes, expressam AFPs para inibir completamente o crescimento de cristais de gelo1. Outros, como a grama, são tolerantes ao congelamento e expressam AFPs para inibir a recristalização do gelo que reduz a formação de grandes cristais de gelo em seus tecidos2. A estabilização das membranas em baixa temperatura é mais uma função sugerida para as AFPs3. Recentemente, um novo papel foi sugerido para a AFP de uma bactéria antártica, Marinomonas primoryensis, dos lagos salgados cobertos de gelo4. Esta AFP faz parte de uma proteína de adesivo5 muito maior que se pensa em anexar a bactéria ao gelo para melhor acesso ao oxigênio e nutrientes6. Outros micróbios são conhecidos por segregar AFPs, o que pode alterar a estrutura do gelo em que vivem7.
AfPs foram encontrados em alguns peixes, insetos, plantas, algas, bactérias, diatomas e fungos. Eles têm sequências e estruturas notavelmente divergentes consistentes com sua evolução de diferentes progenitores em várias ocasiões; e ainda assim todos se ligam ao gelo e inibem seu crescimento pelo mecanismo de inibição de adsorção8. Cada um dos AFPs tem uma superfície específica que atua como seu local de ligação de gelo (IBS). Estes têm sido tipicamente identificados por mutagênese direcionada ao local de resíduos superficiais9-11. O IBS é hipótese para organizar moléculas de água em um padrão semelhante ao gelo que corresponde a planos específicos de gelo. Assim, a AFP forma seu ligante antes de vinculá-lo a ele5, 12. Aviões de gelo podem ser definidos por seus índices Miller, e diferentes AFPs podem se ligar a diferentes planos. Assim, o tipo I AFP do flounder de inverno liga-se aos 20-21 planos piramidários13, tipo III AFP liga tanto os planos prisma primário quanto o piramidal usando uma superfície composta de ligação de gelo11,14, enquanto o budworm de abeto AFP, um AFP hiperativo, liga-se simultaneamente aos planos primários e basais15,16. Outros AFPs hiperativos, como o MPAFP, ligam-se a múltiplos planos de gelo, como mostra a cobertura completa dos hemisférios de cristal de geloúnico 5,17. É hipótese, que a capacidade dos AFPs hiperativos de ligar o plano basal, bem como outros planos, pode explicar sua atividade 10 vezes maior sobre AFPs moderadamente ativa18. Embora a eficiência dos AFPs hiperativos esteja bem documentada, sua capacidade de se ligar a múltiplos planos de gelo ainda não é compreendida.
O método original para determinar os aviões de gelo com destino à AFP foi desenvolvido por Charles Knight13,19. Neste método, um cristal de gelo único macroscópico é montado em uma haste de metal oca (dedo frio) e formado em um hemisfério submergindo-o em um copo hemisférico cheio de água desgassada. Em seguida, o hemisfério é submerso em uma solução diluída de AFPs e uma camada de gelo é cultivada a partir da solução AFP para o hemisfério cristal de gelo ao longo de várias horas controlada pela temperatura do glicol de etileno circulando através do dedo frio. O cristal de gelo é removido da solução, retirado do dedo frio, e colocado em uma sala de congelador de -10 a -15 °C. A superfície é raspada com uma lâmina afiada para remover o filme de superfície congelada da solução de proteína anticongelante e o cristal de gelo é permitido sublimar por pelo menos 3 horas. Após a sublimação, os planos de gelo ligados por AFPs podem ser vistos como padrões brancos gravados derivados de proteína residual. O hemisfério de gelo pode ser orientado para seu eixo ce eixos,para localizar os planos basais e prisma de gelo, e determinar os índices Miller das manchas gravadas.
Aqui descrevemos uma modificação do método original para determinar aviões de gelo vinculados à AFP, um método a que chamamos de afinidade de avião de gelo baseado em fluorescência (FIPA)11. Os AFPs são fluorescentes rotulados com uma etiqueta quimrica, como proteína fluorescente verde (GFP)11,16,17,20, ou com um corante fluorescente covalentemente ligado à AFP5,21. Os AFPs fluorescentes são adsorvidos a um único cristal de gelo e crescidos usando o mesmo procedimento experimental que os experimentos originais de gravação de gelo. A extensão da ligação da AFP ao crescente hemisfério de gelo pode ser monitorada durante todo o experimento usando uma lâmpada ultravioleta (UV). Depois que o experimento estiver completo, o hemisfério pode ser diretamente retirado do dedo frio e imageado, sem sublimação. No entanto, se desejar, o hemisfério pode ser deixado para sublimar para visualizar uma etch de gelo tradicional. Modificações introduzidas na metodologia FIPA encurtam o protocolo tradicional de gravura de gelo em várias horas. Além disso, há o potencial de imagens simultâneas de vários AFPs, cada um com um rótulo fluorescente diferente, para visualizar os padrões sobrepostos de planos de gelo ligados à AFP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:177px;">NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators</td>
			<td style="width:95px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;">RTE7</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:177px;">Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant</td>
			<td style="width:95px;">Certified</td>
			<td style="width:145px;">29-3037-0</td>
			<td style="width:189px;">Common automotive antifreeze</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:177px;">Cold finger</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:177px;">Hemispherical cup</td>
			<td style="width:95px;">not available</td>
			<td style="width:145px;">not available</td>
			<td style="width:189px;">Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:177px;">High Dual Output Lighting System</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX</td>
			<td style="width:189px;">Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:177px;">Camera</td>
			<td rowspan="2" style="width:95px;">Canon</td>
			<td rowspan="2" style="width:145px;">EOS 50D</td>
			<td rowspan="2" style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:177px;">Emission Filters</td>
			<td style="width:95px;">Lightools Research</td>
			<td style="width:145px;">LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG</td>
			<td style="width:189px;">Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity

As proteínas anticongelante (AFPs) são expressas em uma variedade de organismos resistentes a frio para prevenir ou retardar o crescimento interno do gelo. Os AFPs se ligam a planos específicos de gelo através de suas superfícies de ligação de gelo. A análise de afinidade de plano de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma técnica modificada usada para determinar os planos de gelo aos quais os AFPs se ligam. A FIPA baseia-se no método original de gravação de gelo para determinar aviões de gelo com destino à AFP. Produz imagens mais claras em um tempo experimental encurtado. Na análise fipa, os AFPs são fluorescentemente rotulados com uma etiqueta quimrica ou um corante covalente e, em seguida, lentamente incorporado em um cristal de gelo único macroscópico, que foi pré-formado em um hemisfério e orientado para determinar os eixos a e c. O hemisfério de gelo ligado à AFP é retratado sob luz UV para visualizar aviões ligados à AFP usando filtros para bloquear a luz inespecífica. A rotulagem fluorescente dos AFPs permite o monitoramento em tempo real da adsorção da AFP no gelo. Os rótulos foram encontrados para não influenciar os planos aos quais os AFPs se ligam. A análise fipa também introduz a opção de vincular mais de um AFP marcado de forma diferente no mesmo cristal de gelo único para ajudar a diferenciar seus planos de ligação. Essas aplicações da FIPA estão ajudando a avançar nosso entendimento de como as AFPs se ligam ao gelo para deter seu crescimento e por que muitos organismos produtores da AFP expressam múltiplas isoformas da AFP.

A preparação e a montagem do cristal de gelo único são as duas etapas do procedimento FIPA onde os erros são mais comumente cometidos. Determinar se o cristal de gelo preparado é único é feito examinando-o através de polaroides cruzadas (Figura 1D), conforme descrito na etapa 2.1 da seção de protocolo. Se um cristal de gelo multicristalino for usado para a análise FIPA, o resultado será a vinculação descontínua dos AFPs no hemisfério sem um padrão de ligação coerente (Figura 6...

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Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Proteínas anticongelantes (AFPs) se ligam a planos específicos de gelo para prevenir ou retardar o crescimento do gelo. A análise de afinidade de aviões de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma modificação do método original de gravação de gelo para determinação de aviões de gelo ligados à AFP. Os AFPs são rotulados fluorescentemente, incorporados em cristais de gelo simples macroscópicos, e visualizados sob luz UV.

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

determining-ice-binding-planes-antifreeze-proteins-fluorescence-based

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.0K visualizações.  Queen's University. Proteínas anticongelantes (AFPs) se ligam a planos específicos de gelo para prevenir ou retardar o crescimento do gelo. A análise de afinidade de aviões de gelo baseada em fluorescência (FIPA) é uma modificação do método original de gravação de gelo para determinação de aviões de gelo ligados à AFP. Os AFPs são rotulados fluorescentemente, incorporados em cristais de gelo simples macroscópicos, e visualizados sob luz UV.

Vídeo: Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 &deg;C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 &mu;m in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Ice binding proteins (IBPs), also known as antifreeze proteins, inhibit ice growth and are a promising additive for use in the cryopreservation of tissues. The main tool used to investigate IBPs is the nanoliter osmometer. We developed a home-designed cooling stage mounted on an optical microscope and controlled using a custom-built LabVIEW routine. The nanoliter osmometer described here manipulated the sample temperature in an ultra-sensitive manner.

LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Química

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

A formação de estruturas biomoleculares ordenada pelo auto-montagem de pequenos peptídeos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

Submillisecond alterações na conformação das proteínas resolvidas por Photothermal Boca deflexão

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional units (e.g., domains). Traditional consensus-building models fail to account for interpositional dependencies &#8211; functionally required covariation of residues that tend to appear simultaneously throughout evolution and across the phylogentic tree. These relationships can reveal important clues about the processes of protein folding, thermostability, and the formation of functional sites, which in turn can be used to inform the engineering of synthetic proteins. Unfortunately, these relationships essentially form sub-motifs which cannot be predicted by simple &#8220;majority rule&#8221; or even HMM-based consensus models, and the result can be a biologically invalid &#8220;consensus&#8221; which is not only never seen in nature but is less viable than any extant protein. We have developed a visual analytics tool, StickWRLD, which creates an interactive 3D representation of a protein alignment and clearly displays covarying residues. The user has the ability to pan and zoom, as well as dynamically change the statistical threshold underlying the identification of covariants. StickWRLD has previously been successfully used to identify functionally-required covarying residues in proteins such as Adenylate Kinase and in DNA sequences such as endonuclease target sites.

Synthetic protein sequences based on consensus motifs typically ignore co-evolving residues, that imply interpositional dependencies (IPDs). IPDs can be essential to activity, and designs that disregard them may result in suboptimal results. This protocol uses StickWRLD to identify IPDs and help inform rational protein design, resulting in more efficient results.

Otimização de proteínas sintéticas: Identificação de interposição Dependências Indicating Estruturalmente e / ou resíduos funcionalmente ligadas

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). The fibronectin protein film was immobilized on the silicon nitride (SiN) membrane that forms the SALVI detection area. During ToF-SIMS analysis, three modes of analysis were conducted including high spatial resolution mass spectrometry, two-dimensional (2D) imaging, and depth profiling. Mass spectra were acquired in both positive and negative modes. Deionized water was also analyzed as a reference sample. Our results show that the fibronectin film in water has more distinct and stronger water cluster peaks compared to water alone. Characteristic peaks of amino acid fragments are also observable in the hydrated protein ToF-SIMS spectra. These results illustrate that protein molecule adsorption on a surface can be studied dynamically using SALVI and ToF-SIMS in the liquid environment for the first time.

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

This work presents a protocol for liquid handling and sample introduction to a microchannel for in situ time-of-flight secondary ion mass spectrometry analysis of protein biomolecules in an aqueous solution.

In Situ Caracterização de Proteínas hidratadas em água por SALVI e TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Síntese Facile de micelas Worm-like por luz visível Mediated Dispersão Polimerização Usando Photoredox Catalisador

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Determining the Chemical Composition of Corrosion Inhibitor/Metal Interfaces with XPS: Minimizing Post Immersion Oxidation

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, the focus is on metallic substrates immersed in acidic solutions containing organic corrosion inhibitors, as these systems can be particularly sensitive to oxidation following removal from solution. To minimize the likelihood of such degradation, samples are removed from solution within a glove box purged with inert gas, either N2 or Ar. The glove box is directly attached to the load-lock of the ultra-high vacuum X-ray photoelectron spectroscopy instrument, avoiding any exposure to the ambient laboratory atmosphere, and thus reducing the possibility of post immersion substrate oxidation. On this basis, one can be more certain that the X-ray photoelectron spectroscopy features observed are likely to be representative of the in situ submerged scenario, e.g. the oxidation state of the metal is not modified.

A protocol to avoid the oxidation of metallic substrates during sample transfer from an inhibited acidic solution to an X-ray photoelectron spectrometer is presented.

Determinar a composição química do inibidor de corrosão / Metal Interfaces com XPS: Minimizando Pós Immersion Oxidação

An approach for acquiring more reliable X-ray photoelectron spectroscopy data from corrosion inhibitor/metal interfaces is described. More specifically, ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for specialized equipment to achieve modest pressures, and can even be used to achieve higher pressures in more specialized equipment and sturdier reaction vessels. At the end of the reaction, the vials can be easily depressurized by opening at room temperature. In the present example CO2 serves as both a putative directing group as well as a way to passivate amine substrates, thereby preventing oxidation during the organometallic reaction. In addition to being easily added, the directing group is also removed under vacuum, obviating the need for extensive purification to remove the directing group. This strategy allows the facile &#947;-C(sp3)-H arylation of aliphatic amines and has the potential to be applied to a variety of other amine-based reactions.

Achieving Moderate Pressures in Sealed Vessels Using Dry Ice As a Solid CO2 Source

Here we present a protocol for performing reactions in simple reaction vessels under low-to-moderate pressures of CO2. The reactions can be performed in a variety of vessels simply by administering the carbon dioxide in the form of dry ice, without the need for costly or elaborate equipment or set-ups.

Atingir pressões moderadas em vasos selados usando gelo seco como uma sólido CO2 fonte

Herein is presented a general strategy to perform reactions under mild to moderate CO2 pressures with dry ice. This technique obviates the need for ...