This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

1 Determinação de um valor aproximado para a constante de dissociação (ou seja, dentro de uma ordem de grandeza) <ol><li> Preparar a mistura detalhado na Tabela 1. </li><li> Prepare stocks do ligante de interesse na maior concentração disponível, e então em seis de dez diluições desta. Onde um K d de aproximadamente é conhecida a partir dos dados anteriores, o objectivo de ter pelo menos duas concentrações acima e abaixo do K d. </li><li> Aliquota de 18 ul da mistura em oito poços de uma placa em qPCR. Adicionar 2 mL de solvente para o primeiro poço. Adicionar 2 mL de cada membro da série de diluição de ligando (passo 1.2), bem cada um dos restantes sete poços. </li><li> Coloque um selo sobre a placa de qPCR. Para alcançar uma boa vedação da placa, colocar um aplicador de mão (ver tabelas de reagentes específicos) no centro da placa. Alisar o selo para um lado e repita na outra metade doda placa. </li><li> Centrifugar a placa a 500 x g durante dois minutos para remover as bolhas de ar. </li><li> Coloque a placa em um instrumento StepOne qPCR. Seleccione a opção &quot;curva Melt&quot;, os filtros ROX, e escolher a velocidade rampa rápida (isto proporciona uma pausa de 2 min a 25 ° C, seguido de uma rampa de 99 ° C durante 40 minutos, e, em seguida, uma pausa de 2 min). Executar uma desnaturação térmica. NOTA: Os arquivos de script para a realização de uma corrida estão disponíveis online em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Na conclusão do instrumento de execução, clique no botão &quot;Analisar&quot; na tela. Salve o arquivo de resultado. </li><li> Abra o software Protein deslocamento térmico. <ol><li> Criar um novo estudo; na aba de propriedades, dar a este um nome, e na guia Condições, detalhar os ligantes. </li><li> Mover para a aba Arquivos Experiment, e importar o arquivo salvo resultados (XXX.eds), e definir o conteúdo de cada poço (modelo files estão disponíveis a partir dos autores). </li><li> Mude para a guia Análise, e pressione o botão &quot;Analisar&quot;. NOTA: Isto irá analisar os resultados. É possível exportar os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação. Os resultados são exportados em um formato de guia delineada. É melhor abrir o arquivo exportado no Excel, e imediatamente salve em formato Excel. </li></ol></li><li> Verificar que a proteína na presença de solvente sozinho dá um resultado semelhante ao mostrado na Figura 1A. Em seguida, examinar as temperaturas de fusão observados nos resultados no painel &quot;replicar&quot;. Certifique-se de que isso mostra um claro aumento na temperatura de fusão com o aumento da concentração do ligante. NOTA: Idealmente, isto irá proporcionar uma temperatura máxima de fusão claro (assumindo que a proteína é completamente ligando ligado), e um K d aproximado em que a temperatura de fusão está a meio caminho entre a proteína e sem ligandoo máximo. </li></ol> 2. Experimental Set-up para a determinação da constante de dissociação <ol><li> Preparar a mistura detalhado na Tabela 2, tal como uma mistura de base. </li><li> Prepare a existências do ligando em quinze concentrações diferentes, que serão diluídas dez vezes na última experiência. O ideal é incluir as concentrações de pelo menos duas ordens de magnitude acima e abaixo da estimada K d, e do centro de concentrações no estimada K d. Concentre-se em sete dos pontos dentro de uma ordem de grandeza da estimativa K d, com mais quatro pontos em ambos os lados deste; se existe uma escolha, incluir mais pontos em que os valores são saturantes. NOTA: Se necessário, é possível alterar as condições experimentais tais que as unidades são ligandos com o dobro da concentração experimental, onde a solubilidade do ligando é limitante. </li><li> Adicionar 120 mL do mestremisture até oito poços em um U-fundo placa de 96 poços, para atuar como um reservatório para distribuição conveniente da mistura principal. Use uma pipeta de 8 canais para dispensar 18 ul em uma coluna de uma placa de PCR. Repita durante mais cinco colunas, para dar um total de 48 poços cheios com um padrão de 6 x 8 na placa. </li><li> Adicione 20 l de os estoques ligante, ou solvente, para separar poços em um U-fundo placa de 96 poços. Usando uma pipeta de 8 canais, aspirado 2 l de oito ações ligantes diferentes (ou solvente). Adicionar estas para uma coluna da placa de PCR, que foi enchida com uma mistura mestre no passo 2.3. Repita o procedimento com os mesmos oito ligando / stocks de solventes para mais duas colunas. Aspirar 2 ul de oito existências ligando ou solventes remanescentes, e adicione-os a uma quarta coluna na placa. Repita esse procedimento para mais duas colunas. Isto vai dar amostras em triplicado para todos os 16 ligando e as amostras de solvente. </li><li> Coloque um selo sobre a placa de qPCR (ver passo 1.4). </li><li> Centrifugar a placa a 500 xg durantedois min. </li><li> Coloque a placa no instrumento qPCR. Executar uma desnaturação térmica usando os parâmetros especificados no passo 1.6. </li><li> Na conclusão do instrumento de execução, clique no botão &quot;Analisar&quot; na tela. Salve o arquivo de resultado. </li><li> Abra o software Protein deslocamento térmico. Criar um novo estudo; na aba de propriedades, dar a este um nome, e na guia Condições, detalhar os ligantes. </li><li> Mover para a aba Arquivos Experiment, e importar o arquivo salvo resultados (XXX.eds), e definir o conteúdo de cada poço. NOTA: arquivos de modelo estão disponíveis online em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Mude para a guia Análise, e pressione o botão &quot;Analisar&quot;. <ol><li> Escolha a aba &quot;réplicas&quot; no menu do lado esquerdo da tela para mostrar os resultados como triplicatas. Avaliar a confiabilidade dos dados com base em quão apertado as triplicatas são. Should as triplicatas mostram uma reprodutibilidade, examinar os dados brutos de perto. </li><li> Analisar os dados usando tanto o Boltzmann ou métodos derivativos para avaliar a temperatura de fusão. Selecione a opção &quot;Replicar resultados&quot; guia, e no &quot;Replicar resultados enredo&quot;, alterne o &quot;Plot por:&quot; botão entre &quot;Tm - Boltzmann&quot; e &quot;Tm - Derivado&quot;. Seleccione o método que dá a maior reprodutibilidade para a amostra. Exportar os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação. NOTA: Para obter exemplos que mostram várias transições, é quase sempre melhor usar o método derivativo no modo de fusão múltipla. Os resultados são exportados em um formato de guia delineada. É melhor abrir o arquivo exportado no Excel, e imediatamente salve em formato Excel. </li><li> Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes, incluindo a repetição de um dia separado, para assegurar a reprodutibilidade dos resultados. Caso a análise de dados (consulte a etapa 3 abaixo)indicam que o valor de K d é significativamente diferente para o cálculo inicial, alterar as concentrações de ligando em conformidade (ver passo 2.2) para garantir uma boa gama de valores de cerca de K d. </li></ol> 3 Análise de dados para determinar a constante de dissociação sob desnaturação térmica <ol><li> Criar uma tabela no Excel da concentração de ligando e a temperatura de fusão. </li><li> Abra o software GraphPad Prism, e criar uma mesa XY. Entre os dados, usando a coluna de X para as concentrações de ligando e a coluna de Y para a fusão de temperatura resulta. NOTA: um exemplo é mostrado Figura 1B. Um roteiro com as equações pré-carregados e instruções alternativas para a utilização do pacote estatístico SPSS, estão disponíveis online em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Na guia Análise, selecione a opção para alterar o parâmetro de análises (Ctrl + T). Para entrar no modelo correto, selecione &quot;New&quot; e &quot;Criar uma nova equação&quot;. Inserir a equação detalhado na Tabela 3 como &quot;sítio de ligação do ligando Single&quot;. NOTA: Um exemplo dessas medidas é mostrado na Figura 1C. Quando se utiliza o script pré-carregado com equações, a equação pode ser dirigida relevante escolhido a partir da lista, em vez de inserido. Derivação desta equação é fornecida em um apêndice. </li><li> Selecione as &quot;regras de Valores Iniciais&quot; caixa e digite regras para os valores iniciais, conforme detalhado na Tabela 3. </li><li> Restringir o parâmetro P, como &quot;constante igual a&quot; e introduzir a concentração final de proteína (nas mesmas unidades que o ligando é dada em). </li><li> Selecione OK para realizar a análise. NOTA: Um exemplo dessas medidas é mostrado na Figura 1D. O programa gráfico produz uma figura que mostra os dados e o ajuste para o modelo. Exemplos de tstas análises são apresentados nos dados representativos. </li></ol> 4. Ajustando os dados para modelos cooperativos Para ajustar os dados para um modelo de cooperativa, ou escolher entre um modelo de cooperativa simples, ou um modelo onde duas constantes de dissociação separados são definidos. A primeira abordagem é o preferido no caso de uma cooperatividade negativa, ou como uma investigação inicial. No entanto, em princípio, é melhor nos casos de cooperatividade positiva para modelar dois dissociação diferentes constantes 18. Neste caso, a modelagem pode continuar assumindo qualquer ligação sequencial de ligantes, ou ligação independente de ligantes. <ol><li> Siga os mesmos passos iniciais como no protocolo 3 No entanto, no passo 3.3, inserir uma das equações na Tabela 3 listado como &quot;modelo cooperativo Simples&quot;, &quot;ligação sequencial de dois ligantes&quot;, ou &quot;Independent ligação de dois ligantes&quot; 18. </li><li> Selecione as regras aplicáveis ​​para valores iniciaisassociada com cada uma destas equações na Tabela 3. </li><li> Examinar o ajuste do modelo aos dados. Se os dados se encaixam mal, considere um outro modelo. NOTA: também é importante analisar cuidadosamente a montagem da temperatura de fusão de dados pelo software deslocamento térmico Protein (passo 2.9): às vezes é necessário alterar os parâmetros aqui para obter os melhores resultados. Outra consideração é se o intervalo de pontos de dados é o ideal, e se existem pontos anômalos: ou um conjunto limitado de dados de ambos os lados de K d, ou um único ponto anômalo (especialmente nas concentrações mais altas ligante), pode afetar significativamente os resultados. </li><li> Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes (ver passo 2.12) para assegurar a reprodutibilidade. </li></ol> 5. Ajustando os dados para curvas que mostram deslocamentos binários na temperatura de fusão Ocasionalmente, em vez de uma resposta graduada a ligando, as proteínas foramObservou-se adotar uma resposta binária, onde a amostra ligado é nitidamente separada da amostra não ligado. Um exemplo é fornecido nos resultados representativos (Figura 4). Neste caso, a montagem das temperaturas de fusão não irá proporcionar um bom ajuste para K d. <ol><li> Exportar a saída de dados brutos do Protein software deslocamento térmico. Para cada ponto de temperatura, o cálculo da média de fluorescência para o ligando de zero, e as concentrações mais elevadas de ligandos. Tabular os resultados a partir de cada ponto de dados seguinte a estes. NOTA: O erro criado aqui é menor do que o erro nas temperaturas de fusão embutidos. </li><li> Abra o pacote estatístico SPSS. Copie as temperaturas, os dois conjuntos de dados médios, e os dados de cada experimento para uma janela de dados em SPSS. Na aba variável, definir o conjunto de dados médio para não ligando como &quot;baixo&quot;, eo conjunto de dados média para a maior concentração ligante como &quot;alto&quot;. </li><li> Baixe o arquivo de sintaxe disponívelon-line em http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Selecione &quot;Executar → Executar tudo&quot;. </li><li> Copie a proporção resultados ligados a um novo livro do Excel, com as concentrações ligando relevante. </li><li> Abra o software Graphpad, e criar uma mesa XY. Entre os dados, usando a coluna de X para as concentrações de ligando e a coluna de Y para a fusão de temperatura resulta. Na guia de análise, selecione &quot;parâmetros de análise mudança&quot;. Para entrar no modelo correto, selecione &quot;New&quot; e &quot;Criar uma nova equação&quot;. Introduza a equação dada na Tabela 3, listados como &quot;análise de desvios em binários temperatura de fusão&quot;. </li><li> Marque a caixa &quot;regras para os valores iniciais&quot;, e inserir regras para valores iniciais detalhados na Tabela 3. Restringir o parâmetro P, como &quot;constante igual a&quot; e digite a concentração final de proteína (nas mesmas unidades que a ligand é dada em). NOTA: exemplos de concluir essas caixas para o protocolo na seção 3 são mostrados na Figura 1C, D. </li><li> Se existe um bom ajuste, os resultados podem ser melhorados através da extrapolação do resultado esperado na concentração do ligando infinito. A partir do modelo da parte ligada a cada concentração de ligando, examinar o valor para o valor mais alto de concentração do ligando. Se esta é 0,99 ou maior, é improvável para melhorar os resultados uma análise mais aprofundada. </li><li> Se a proporção é inferior a 0,99, uma etapa adicional é requerido para corrigir os efeitos da proteína não ligada na amostra mais elevada concentração de ligando. No passo 5.2, escrever a proporção de ligando ligado ao ponto de maior concentração de ligando (a partir do passo 5.7) em célula R2 (uma célula diferente, podem ser utilizados, e R2 apropriadamente substituído na equação na Tabela 3). Criar uma coluna extra após a média dos valores mais elevados de concentração de ligando. Nos abetoscélula T, copiar a equação listadas na Tabela 3 como &quot;A extrapolação para o infinito concentração do ligando&quot;. Copie esta fórmula para as células restantes nesta coluna. NOTA: Este cálculo remove o efeito da proteína não ligada na concentração mais elevada de ligando. A diferença entre a proteína do ligando livre e a concentração mais elevada de ligando é multiplicado pelo inverso da percentagem ligada a uma concentração mais elevada de ligando para proporcionar a diferença esperada entre estados proteína totalmente ligadas e não ligadas, em cada ponto de temperatura. Esta diferença é adicionado ou subtraído do estado desagregado para dar a fluorescência esperado para a proteína totalmente ligando ligados. </li><li> Substituir a coluna para a concentração máxima ligando na folha de dados SPSS com esta nova coluna, e repetir o ajuste de dados. NOTA: os passos 5,7-5,9 pode precisar ser repetido se o modelo sugere uma nova mudança significativa na proporção ligação nas concentrati máximas liganteem (se este for o caso, provavelmente seria ideal para repetir o experimento com um ponto de concentração de ligante superior incluído). </li><li> Nos casos em que a proteína apresenta um comportamento cooperativo deslocamento binário e exibe, a equação sugerida no passo 5.5 devem ser substituídos com aqueles do passo 4.1. Os parâmetros &quot;fundo&quot; &quot;Top&quot; e deve ser substituído por 1 e 0, respectivamente. </li><li> Repita a experiência, no mínimo, por duas vezes (ver passo 2.12) para assegurar a reprodutibilidade. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

Fluorimetria diferencial de varredura demonstrou seu poder como um método robusto e versátil para a caracterização de proteínas e identificação de potenciais ligantes protéicos. Os sucessos bem documentados em acelerar a estabilização da proteína, descoberta de drogas (especialmente em laboratórios menos financiados) e cristalização 10,23-25 ​​tornaram um método atraente para a triagem inicial de compostos. Compostos adicionados às proteínas mostram um claro aumento dependente da dose na temperatura de fusão aparente de 7,9. No entanto, tem havido algumas tentativas para utilizar os resultados destas experiências para determinar as constantes de ligação aparentes para ajudar na classificação compostos quanto à sua afinidade. Aqui, nós apresentamos um método para a determinação sistematicamente uma constante de dissociação aparente de proteínas na presença de um ligando. Os resultados aqui apresentados demonstram que a DSF pode rapidamente e de forma robusta fornecer estimativas da constante de dissociação parauma combinação de proteína-ligando. Os dados observados podem ser manipulados com instrumentos disponíveis comercialmente para fornecer uma rápida determinação de K d, sem a necessidade de fazer hipóteses sobre o valor provável de parâmetros. O método tem uma vantagem significativa sobre alguns métodos comparáveis ​​de ser parcimoniosa em proteínas e tempo requerido. O experimento descrito aqui vai consumir 0,13 mg de proteína por experiência (aproximadamente 0,4 mg por experiências repetidas em triplicata). Isso se compara favoravelmente com a calorimetria de titulação isotérmica (ITC), onde uma única experiência com uma média de 40 kDa vai consumir uma quantidade similar. O conjunto completo de experimentos necessários para este protocolo iria consumir em torno de 4 horas, incluindo a preparação, para um único conjunto de experimentos. Mais uma vez, esta é provavelmente a ser consideravelmente mais rápida do que os métodos tais como ITC ou ressonância de plasma de superfície, enquanto que muitas vezes requerem optimização poderoso considerável para atingir melhores dados. Os nossos resultados demonstram que continua a existir uma exigência de examinar cuidadosamente os dados brutos, o ajuste destes dados para determinar a temperatura de fusão, e o ajuste dos dados de temperatura de fusão para determinar a constante de dissociação. O primeiro desafio é a forma dos dados brutos produzidos na proteína de fusão. Em alguns casos, a forma pode não aproximados ao observado na Figura 1A. Problemas comuns incluem mudanças de temperaturas baixas na ligação do ligando, alta fluorescência de fundo e várias transições incomuns de temperatura. Deslocamentos de baixa temperatura são vistas em ligação um número de ligandos. Por este método, o parâmetro mais crítico é o erro na medição de T m, em comparação com a mudança de temperatura. Os dados geralmente pode ser equipado razoavelmente bem quando o desvio padrão das medições em triplicata não excedam 10% do deslocamento da temperatura de fusão entre a proteína não ligada e totalmente vinculado. Nossa experiência é que quando essa temperaturadeslocamentos ratura são apenas 2 ° C, isto pode ser suficiente para o ajuste dos dados, se os pontos de dados individuais são altamente precisos. Uma segunda questão é incomum em forma de curvas. Estas muitas vezes diferem entre a proteína livre e as formas de ligando ligado, como a ligação do ligando afecta modos desdobramento da proteína. Nestes casos, o utilizador tem de determinar se os dados podem ser usados ​​com a devida consideração dos modelos para ser utilizado para a determinação da temperatura de fusão e a constante de dissociação. Um outro problema comum é que a adição de um co-factor para a proteína (por exemplo, MgCl 2, no nosso exemplo com hexocinase) é necessário para obter os dados mais fiável. Nossa experiência tem demonstrado que uma análise cuidadosa de todos os fatores prováveis ​​no experimento na fase de fazer leituras iniciais é essencial para a obtenção dos melhores resultados. Além disso, os tratamentos teóricos alternativos pode revelar características destes dados 15,17. Finalmente, não é incomum para algumas proteínas que contain nativamente exposta regiões hidrofóbicas para mostrar alta fluorescência de fundo. Há um certo número de soluções para estes problemas, que têm sido extensivamente avaliação outras posições 6,9. Em particular, o utilizador deve-se considerar a possibilidade de utilizar o Boltzmann modelos ou derivados (por exemplo, Figura 4), ​​e no caso de utilização de derivados, se derrete múltiplas devem ser modeladas. Os dois métodos de modelação do desdobramento térmico diferem na medida em que o método de Boltzmann ajusta os dados experimentais com a equação de Boltzmann, assumindo um formato regular para a sigmoidal curva desdobramento. Em contraste, o método derivado leva a primeira derivada dos dados experimentais em cada ponto (painel inferior da Figura 1A), e considera que a temperatura de fusão ser o ponto mais elevado da primeira derivada. O método geralmente derivado retorna uma temperatura de fusão mais elevada de cerca de 2-3 ° C. A maioria das proteínas irá retornar uma mais consistenteresultado (isto é, o erro padrão da temperatura de fusão para as experiências em triplicado é inferior) por um dos dois métodos. Isto é geralmente intimamente relacionada com a forma exacta da proteína se desdobrar curva, e que é necessário para determinar empiricamente o melhor método, em cada caso. Quando o modelo derivado é utilizado, é também importante considerar vários eventos de fusão. Alguns dados mostram claramente evidência para múltiplas transições, e, nestes casos, os resultados tendem a ser mais fáceis de interpretar se estes eventos de fusão múltiplos são modelados. No contexto do presente protocolo, que é muitas vezes o caso de que a adição do ligando pode provocar uma proteína para passar de ter múltiplas transições de fusão para uma única transição (por exemplo, por meio da estabilização do mais frágil termicamente subdomínio), ou vice-versa. Teríamos, portanto, defendem que os dados brutos são examinadas em conjunto, antes de considerar qual abordagem será melhor para usar. Seguindo o modelling das temperaturas de fusão individuais, outros problemas podem surgir na montagem destes para os modelos apresentados na seção de protocolo. É imperativo examinar cuidadosamente o ajuste à equação constante de dissociação usando uma escala logarítmica, como esta análise frequentemente destaca discrepâncias entre os dados observados eo modelo (e .g., Figura 3). Embora os resultados obtidos são geralmente robusto, o cuidado na interpretação oferece a oportunidade de extrair os melhores resultados, e a maior significado, a partir dos dados. A questão específica levantada por esses dados é a interpretação que deve ser colocado em proteínas que mostram cooperatividade, ou vários eventos de ligação, na DSF. Temos, até o momento, apenas observou esse fenômeno em proteínas que são esperados para ter vários eventos de ligação específicos (por exemplo, WcbM, uma proteína cuja homólogo melhor é uma multï¿½ero 26, e que atua como um multï¿½ero em cromatografia de exclusão de tamanho [de dados nãomostrados]). Não é de modo nenhum claro que a cooperatividade negativa observada na DSF desnaturação da enzima indica que, em última análise mostram cooperatividade negativa: em vez disso, esta pode ser uma indicação de que o complexo de ligação tem de ser explorado mais exaustivamente utilizando uma gama mais larga de métodos. Isto sugere a nós, no entanto, que mais extensos estudos de tais proteínas são susceptíveis de identificar efeitos interessantes. Os valores indicados para a constante de dissociação utilizando este método são, em geral da mesma ordem que aquelas fornecidas por outros métodos, tais como calorimetria de titulação isotérmica e de ressonância de plasmon de superfície. No entanto, os valores absolutos observados são frequentemente mais elevados do que os observados usando esses métodos. Isto é, pelo menos em parte uma consequência do facto de a constante de dissociação é observada na temperatura de fusão com a proteína do ligando. Este K d é geralmente maior do que a temperaturas fisiológicas. O dissociation constante está relacionada com a temperatura da reacção pelas equações: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (Em que c é a concentração θ referência padrão, Δ r G é a variação de energia livre de Gibbs da reacção, R é a constante dos gases molar, Δ H é a variação de entalpia na reacção, e Δ S é a variação de entropia na reacção .) As reacções com as constantes de dissociação na gama mensurável de este método terá geralmente um negativo Δ r L, e de modo que o efeito de um aumento na temperatura na equação [1] será o aumento da constante de dissociação. Ambos os termos Δ H e Δ S que constituem a energia livre de Gibbs (equação [2]) são temperaturdependente e 27, e o efeito sobre a constante de dissociação dependerá da amplitude e sinal de estas dependências de temperatura, e será, necessariamente, dependente interacção. Por conseguinte, não é inesperado que as constantes de dissociação determinadas por este método são, por vezes, maior do que os valores determinados por métodos que operam à temperatura ambiente. A dependência da temperatura é, evidentemente, também a ressalva de muitos outros métodos, os quais tendem a fornecer a constante de dissociação em temperaturas mais baixas do que a temperatura fisiológica. Outra ressalva do método DSF é que é um método marcado, ao contrário de ITC. O marcador fluorescente utilizado (SYPRO Laranja) é hidrofóbico, e portanto em alguns casos, pode competir com a ligação de ligandos a proteínas hidrofóbicas. Por conseguinte, é provável que, em alguns casos, a constante de dissociação obtida vai ser artificialmente elevado devido à competição com o rótulo. No entanto, para a comparação de diferentes ligandos, (o principal usoDSF), as diferenças não são susceptíveis de ser suficientemente significativa para afetar a classificação de compostos por afinidade. Uma potencial desvantagem deste método é o limite de detecção que pode ser alcançado. Em princípio, não deverá ser possível medir com precisão a um valor de K d que é inferior a 50% da concentração de proteína, e até mesmo os valores nesta gama são susceptíveis de ser de precisão duvidosa. Embora o limite de detecção a esta extremidade do intervalo pode ser alargado por uma pequena redução da concentração de proteína e de corantes, a sensibilidade do instrumento vai evitar mais redução na concentração de proteína. Do mesmo modo, a extremidade superior da sensibilidade serão determinadas pela solubilidade do ligando. Para obter uma estimativa matematicamente robusto para o K d, é a mais importante para a obtenção de dados com 90% da proteína presente sob a forma ligada ao ligando, que requer concentrações de ligando a ser aproximadaly dez vezes K d (assumindo que não há cooperatividade). O limite de detecção, portanto, de ser necessariamente um décimo da solubilidade do ligando no tampão relevante. Isto significa que os limites de detecção do método irá tipicamente variar entre 1 uM e entre 1 e 100 mM, dependendo da proteína e do ligando. Em conclusão, a fluorimetria de varrimento diferencial é uma técnica versátil aplicável a uma ampla gama de proteínas. Usando os métodos aqui apresentados, é possível determinar rapidamente e de forma barata a afinidade de uma proteína para diferentes ligandos. Isto tem um grande potencial de aplicação em purificação de proteínas e de estabilização, a esclarecer a função ou especificidade de enzimas de metagenomes, e na descoberta de medicamentos, especialmente em pequenos laboratórios.

Todas as proteínas vão ligar, com afinidades diferentes, para uma variada gama de outras moléculas de íons simples para outras grandes macromoléculas. Em muitos casos, as proteínas se ligam a pequenas parceiros da molécula, como parte da sua função normal (por exemplo, ligação de uma cinase de ATP). Outras interacções podem não estar relacionadas com a função, mas são úteis como ferramentas experimentalmente (por exemplo, moléculas pequenas que estabilizam proteínas para melhorar o sucesso de cristalização, ou ajudar a manter as proteínas em solução); enquanto que as moléculas pequenas que se ligam a locais activos e locais alostéricos das proteínas podem agir como inibidores e assim modular a actividade de enzimas. Há uma grande variedade de técnicas que podem ser utilizadas para determinar a afinidade de proteínas de moléculas parceiras. Calorimetria isotérmica de titulação 1 é amplamente visto como um &quot;padrão-ouro&quot;, uma vez que fornece informações ricas sobre as reações, é o rótulo de livre, e tem oportunidades limitadas para umartifacts do experimento. No entanto, apesar das recentes melhorias na sensibilidade da instrumentação e automação de set-up experimental, ainda é relativamente caro em termos de exigências de proteína, tem no máximo um rendimento baixo e médio, e é mais adequado para interações com moderada a afinidades elevadas (10 nm a 100 M K d) 2. Outros rótulo métodos gratuitos, como ressonância de plasma de superfície ou bicamada interferometria 3 oferta débitos mais elevados, e ter conseguido a sensibilidade para detectar moléculas menores tão baixas quanto 100 Da. No entanto, os instrumentos de alto rendimento para estes métodos são relativamente caros, só se justificam em que haverá uma taxa de transferência contínua de projetos relevantes, e por isso é provável que sejam inacessíveis para muitos laboratórios acadêmicos. Fluorimetria de varrimento diferencial (DSF ou thermofluor) foi descrita pela primeira vez em 2001 4 como um método para a descoberta da droga. Neste metod, as proteínas são incubadas com um corante fluorescente (foram utilizados corantes inicialmente naftaleno-sulfónico), o qual altera a sua fluorescência após ligação para as regiões hidrófobas das proteínas. A amostra de proteína-corante é, em seguida, aquecida, e a fluorescência monitorizada como o calor aumenta. O desdobramento da proteína, e a exposição das partes hidrofóbicas da proteína, dá origem a um padrão característico da fluorescência como uma função de temperatura (Figura 1A). A experiência pode ser realizada em pequenos volumes em qualquer instrumento de PCR quantitativo comercial, e assim numa única experiência, um grande número de amostras podem ser testadas simultaneamente (normalmente 48, 96 ou 384 amostras, dependendo do modelo de instrumento). Experiências pode geralmente ser realizada em cerca de uma hora, dando a possibilidade de análise de alto rendimento das amostras 5. Outras melhorias na metodologia de ter visto a adoção de corantes com melhores propriedades espectrais 6,7 </sup&gt;, ferramentas genéricas para análise de dados, e sugeriu protocolos para a triagem inicial 8,9. A gama de aplicações do método foi estendido, com um foco particular em estabelecer as condições ideais para a preparação e armazenamento de proteínas 10, e na identificação de potenciais parceiros de ligação para ajudar a cristalização 11. O relativamente elevado rendimento do método, de custo relativamente baixo teor em proteína (~ 2 g por reacção), e a aplicabilidade ao estudo de moléculas de ligação fracas fez DSF uma ferramenta valiosa para a concepção de fármacos com base fragmento, especialmente no contexto académico 12-14. Apesar da ampla aplicação da DSF para estudar as interações proteína-ligante, poucos estudos têm descrito a determinação de constantes de dissociação desses estudos. No entanto, estes tendem a produzir equações detalhados que descrevem o desdobramento da proteína, com muitos parâmetros que devem ser equipados com dados esparsos ou em alguns casos, ecalculados a 7,15-17. Estes métodos são de particular relevância nos casos difíceis, tais como os compostos de ligação com força, ou proteínas que apresentam transições incomuns. No entanto, para muitos laboratórios, estas análises detalhadas são demasiado pesado para uso rotineiro. Propomos, portanto, tratamentos alternativos para diferentes cenários, e demonstrar como estes podem ser usados ​​para ajustar os dados resultantes de diferentes interações proteína-ligante. Nosso método utiliza o instrumento StepOne qPCR, para que o software de análise de dados sob medida está disponível; enquanto que esta aumenta a velocidade de análise de dados, os resultados de outros instrumentos podem ser processadas utilizando os métodos previamente publicados 9, e a mesma análise a jusante pode ser realizada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

Uma grande variedade de métodos estão disponíveis para a determinação da constante de dissociação entre uma proteína e as moléculas pequenas interagem. No entanto, a maioria destes requerem acesso a equipamento especializado, e muitas vezes exigem um grau de conhecimento para efetivamente estabelecer experimentos confiáveis ​​e analisar dados. Fluorimetria exploratória diferencial (DSF) está sendo usado cada vez mais como um método robusto para a triagem inicial de proteínas para interagir moléculas pequenas, tanto para a identificação de parceiros fisiológicas ou para a descoberta hit. Esta técnica tem a vantagem de que ele requer apenas uma máquina de PCR adequados para a PCR quantitativa, de modo adequado e instrumentação disponível na maioria das instituições; uma excelente gama de protocolos já estão disponíveis; e há fortes precedentes na literatura para múltiplos usos do método. Últimos trabalhos propôs vários meios de cálculo constantes de dissociação de dados QSD, mas estes são matematicamente exigente. Aqui, nós demtrar um método para estimar as constantes de dissociação a partir de uma quantidade moderada de dados experimentais DSF. Esses dados geralmente pode ser coletados e analisados ​​em um único dia. Demonstramos como diferentes modelos podem ser usados ​​para ajustar os dados coletados a partir de eventos de ligação simples, e onde os sítios de ligação ou ligação independente cooperativas estão presentes. Por fim, apresentamos um exemplo de análise de dados em um caso em que os modelos padrão não se aplicam. Estes métodos são ilustrados com os dados recolhidos em proteínas de controlo comercialmente disponíveis, e as duas proteínas do nosso programa de pesquisa. No geral, o nosso método fornece uma maneira simples para que os pesquisadores ganhar rapidamente uma visão mais aprofundada interações proteína-ligante utilizando DSF.

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.1K visualizações.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Vídeo: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinação da superfície celular Relativa e Expressão total de canais recombinante de iões utilizando Citometria de Fluxo

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Coleção de esperma de qualidade diferencial usando centrifugação gradiente de densidade

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

Usando elegans caenorhabditis para tela para interações de acompanhantes específicas de tecido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...