Agradecemos Weixan Lu para assistência técnica na cultura e na manutenção dos estoques de células Sf9. LAY foi apoiado por um Conselho de Pesquisa Médica (MRC) studentship pós-graduação. RJCG era um Research Fellow da Universidade Royal Society. A Divisão de Oxford de Biologia Estrutural faz parte do Wellcome Trust Centre para Genética Humana, Wellcome Trust Award Núcleo Grant Número 090532/Z/09/Z.

Este protocolo assume que o rato kindlin-3 do gene (FERMT3) tem sido clonado com êxito para um vector a jusante do promotor p10 muito tarde e que possui o vector que flanqueiam as sequências de baculovirus para permitir a recombinação com o bacmid BAC10 KO: 1629 desenvolvido por IM e Jones colegas 28. Para este protocolo, o gene kindlin-3 foi clonado em pOPINE 29 e os iniciadores e a estratégia de clonagem utilizados podem ser encontradas descritas em outros lugares 12. O plasmídeo foi concebido de modo a que o gene FERMT3 (kindlin-3) está sob o controle do promotor p10 de baculovírus e o vector contém 5 &#39;UTR/ORF603 e ORF de 1629 e codifica uma sua 6-tag no terminal C para a purificação a jusante 29. 1. Cultura de Células de insetos e Manutenção <ol><li> Antes da amplificação de baculovírus recombinante, as células de Spodoptera frugiperda adaptados para cultura em suspensão (células Sf 9) deveser cultivado e mantido. Células de insetos devem sempre ser tratadas com técnicas de assepsia em uma cultura de tecidos de fumos capô dedicado. </li><li> As culturas em suspensão de células de insectos são incubadas em Sf-900 II (SFM) meio líquido isento de soro suplementado com penicilina 100 ug / ml e 100 ug / ml de estreptomicina, em frascos de 27 ° C com agitação a 100 rpm. </li><li> Manter o celular inseto faixa de densidade cultural entre 1 X 10 6 - 1 x 10 7 células / ml por dividir e diluir a cultura de células com frescos Sf-900 II mídia. Nota: saudável As células devem parecer uniforme em tamanho e deve ser de forma esférica. </li><li> Contar as células num volume de amostra, utilizando um hemocitómetro e microscopia de luz para calcular a densidade das células de cultura. </li></ol> 2. Geração de Baculovirus Recombinante <ol><li> Cultura e manter as células em suspensão utilizando Sf9 Sf-900 II, meio suplementado com 100 ug / ml penicillin e 100 ug / ml de estreptomicina. Para a geração de baculovírus, células de insectos devem ser cultivadas a uma gama de densidades de 5 x 05-01 outubro x 10 6 células / ml. </li><li> Semente de aproximadamente 1 x 10 6 células Sf9 por poço de uma placa de cultura estéril de tecidos de 6 cavidades em 2 ml de Sf-900 II meios suplementados com penicilina 100 ug / ml e 100 ug / ml de estreptomicina. Deixar as células Sf9 à RT, na hotte de aderir à base dos poços de plástico e, assim, formar uma monocamada. </li><li> Realizar geração de baculovirus recombinante por cotransfecção de ADN de bacmid e de DNA plasmídeo em cultura em monocamada. <ol><li> Para cada transfecção, misturar 1-2 ug de purificado pOPINE-mFERMT3, que possui os elementos de baculovírus ORF1629, com 0,5 ug de purificado BAC10 KO: 1629 em 100 ml de Sf-900 SFM II sem antibióticos (solução A). </li><li> Num tubo separado, dilui-se 6 mL de reagente de Cellfectin II com 100 ml de Sf-900 SFM II sem antiantibióticos para cada reacção de transfecção (Solução B). A &#39;mix master&#39; pode ser criado aqui, para manipulação de líquidos reduzida, se forem necessárias muitas transfections. </li><li> Misturar as duas soluções (A e B, a cerca de 200 uL) e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar um complexo de ADN-lípido. </li><li> Dilui-se os complexos de ADN-lipido com 800 ul de Sf-900 SFM II sem antibióticos. Aspirar cuidadosamente a mídia monocamada de células Sf9 e pipetar cuidadosamente a solução A / B e da mídia em cima da monocamada Sf9. </li><li> Incubar as células transfectadas em um incubador humidificado a 27 ° CO / N e adicionar mais 1 ml de Sf-900 SFM II sem antibióticos para cada cultura em monocamada ao dia seguinte. Incube as células a 27 ° C durante mais 5 dias. </li></ol></li><li> Recolher os baculovírus recombinante directamente a partir do meio de cultura (cerca de 2 ml no total) e transferir para um tubo de centrífuga limpo (por exemplo um tubo Falcon de 15 ml). <ol><li> Esclareça qualquer debr célula Sf9é por centrifugação a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Transferir o vírus, que está no sobrenadante resultante e denotado P1, para um tubo limpo e armazenar a 4 ° C no escuro até serem utilizadas. Nesta fase, a monocamada Sf9 restante pode ser utilizado para avaliar a produção de vírus recombinante através da avaliação da presença de recombinante kindlin-3 nas células de insectos. </li></ol></li><li> Ressuspender a monocamada com 0,5 mL de PBS e diluir uma amostra de 10 ul, com iguais volumes de tampão de carga de SDS-PAGE 2x. Aquecer as amostras a&gt; 95 ° C durante pelo menos 10 min. <ol><li> Sonicar a amostra durante 1 s a amplitude de 10%, utilizando uma ponta de micro-sonicador se for demasiado viscoso para o carregamento de gel adequada. </li></ol></li></ol> 3. A amplificação de Baculovirus Recombinante <ol><li> Para a amplificação de vírus em suspensão, utilizar uma densidade de células de 1,4 x 10 6 células / ml, o que deve ocupar de 1/20 do volume total do frasco (ou seja, 50 ml de cultura emNum balão de 2 L). </li><li> Alcançar a amplificação do vírus recombinante por infectar a cultura de células de insecto com o estoque viral P1 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 usando a seguinte fórmula; <img alt="" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51206/51206eq1.jpg" width="400" /> Nota: A geração de vírus P1 pode ser assumida como tendo um título viral esperado de 1 x 10 7 pfu / ml. No entanto, um ensaio de placa pode ser executada antes desta fase. </li><li> Incubar a cultura de insectos P1-infectadas a 27 ° C com agitação a 100 rpm durante 3 dias (72 h). </li><li> Recolher o vírus através da separação das células a partir dos meios de comunicação social através de centrifugação a 1000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Guardar o sedimento celular resultante nesta fase para a confirmação da produção de vírus recombinante através da avaliação kindlin-3 a expressão da proteína por SDS-PAGE e Western blotting. </li><li> Transfira os meios enriquecidos com vírus esclarecidas para um tubo limpo e armazenar a 4 ° C emno escuro até serem utilizadas. Este estoque viral é denotado como P2. Nota: A título viral de 2 x 10 8 pfu / ml (ou de uma taxa de amplificação de 100 ufp / célula), pode ser antecipado. </li></ol> 4. Expressão de kindlin-3 em infectadas com baculovírus Sf9 <ol><li> Crescer num volume adequado de Sf9 culturas de células em suspensão de Sf-900 SFM II suplementado com 100 ug / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, antes da expressão recombinante de larga escala kindlin-3 para a purificação. Incubar as culturas em suspensão a 27 ° C com agitação a 100 rpm e com um volume total da cultura: Garrafa proporção em volume de 1:5. </li><li> Infectar culturas em suspensão de Sf9, a uma densidade de 2 x 10 6 células / ml. </li><li> Suplemento culturas de Sf9 com uma concentração final de 1% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), seguida com vírus recombinante amplificado (estoque P2-viral) para se obter um MOI de 1. Incubar as culturas infectadas a 27 ° C com agitação a 100 rpm. </li><li> Colheita recombinaçãont kindlin-3-6-CHIS expressando células Sf9 72 horas após a infecção por centrifugação a 1000 xg &#160; e o sedimento celular resultante armazenado a -20 ° C até à sua utilização, ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 5. A purificação da proteína recombinante Kindlin-3 <ol><li> Thaw congelado células de inseto infectadas com o baculovírus (Sf9) pelotas expressando recombinante kindlin-3 no gelo. </li><li> Ressuspender o sedimento de células descongelado com tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, 1% (v / v) de Tween-20), suplementado com um cocktail inibidor da protease livre de EDTA e de 1.000-2.000 U DNase1. Nota: Em alternativa, uma solução salina tamponada de fosfato modificado (PBS) também pode ser utilizado, em que a concentração de NaCl é ajustada a 500 mM para evitar interacções não específicas entre proteínas endógenas de células Sf9 e a coluna de afinidade com metal imobilizado utilizado para a purificação a jusante (ver abaixo). </li><li> Lisar as células por incubação das células ressuspensas com o detergente e vortexing. Sonicar (40% de amplitude, 10 ciclos de 10 segundos de pulsos seguido de 10 segundos de arrefecimento), a amostra para posterior ruptura celular em um banho de gelo ou, em alternativa utilizar um homogeneizador de Dounce. </li><li> Clarificar o lisado por centrifugação a 48.000 xg durante 1 hora a 4 ° C. Carrega-se o sobrenadante resultante para uma coluna HisTrap (5 ml de volume de coluna), pré-equilibrada com tampão de lise, a 4 ° C a uma taxa de 1 ml / min. Nota: Em alternativa, o lisado clarificado pode ser incubada com um 1-5 ml de volume de leito de pérolas de Sepharose níquel pré-equilibradas (por exemplo, Ni Sepharose 6 fluxo rápido) a 4 ° C durante 1-2 horas. Uma coluna de Ni-Sepharose pode ser formada após o passo de ligação, utilizando uma coluna de fluxo por gravidade. </li><li> Lavar a coluna com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) para remover as proteínas não ligadas. </li><li> Usar um gradiente linear de imidazol 10-500 mM a uma velocidade de 10 mm / ml (ou, em 10 volumes de coluna) utilizando uma Äkta FPLC para eluiro limite recombinante kindlin-3-CHIS 6. </li><li> Fraccionar a eluição em 0,5-1 ml de fracções usando o Äkta FPLC, com as fracções contendo kindlin-3-CHIS 6 geralmente eluindo a uma concentração de 300 mM de imidazole. </li><li> Avaliar a composição de proteína do eluente por SDS-PAGE e por purificações primeira vez confirmar por western blotting utilizando um anticorpo anti-His 6 de anticorpo ou anticorpo anti-ratinho kindlin-3. </li><li> Reunir as fracções contendo kindlin-3 e troca de tampão para 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM por meio de uma série de diluições em tampão de amostra e as concentrações de proteína utilizando um concentrador centrífugo com um peso molecular de 50 kDa de corte (MWCO) a 4 ° C. Nota: Em alternativa, dialisar a solução de proteína utilizando Slide-A-Lyzer cassete de diálise com um MWCO de 30 kDa, a 4 ° C durante 4 horas a O / N em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM. Nota: por permuta iónica (ver abaixo) de uma menor concentração de NaCl, <em&gt; isto é, 50 mM, pode ser e tem sido utilizado para este passo. </li><li> Aplicar a solução de proteína-tampão trocado numa coluna HiTrap heparina HP previamente equilibrada (5 ml de volume de coluna) utilizando uma Äkta de FPLC com um caudal de 0,5 ml / min. Nota: O limite kindlin-3 é eluída usando um gradiente linear de NaCl (NaCl 0,2 M a NaCl 1 M) no mesmo tampão, a aumentar a uma taxa de 10 mM / ml. Kindlin-3-CHIS6 é esperado para eluir a ~ 0,6 M de NaCl. </li><li> Fraccionar a eluição em 0,5-1 ml de fracções e avaliar a composição de proteína por SDS-PAGE e Western blotting, se for caso disso. Nota: pode-se esperar que um grau de pureza de proteína de cerca de 95%, como avaliado por SDS-PAGE. </li><li> Piscina fracções contendo kindlin-3 e concentra-se utilizando um concentrador de centrífuga com uma proteína de 50 kDa MWCO para um volume final de 0,5-2 ml. </li><li> Num passo final, polir a proteína concentrada e troca de tampão a proteína utilizando a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). <ol><li> Aplique a proteína purificada em uma Superdex S200 (16/60) ou (10/30) pré-equilibrada em 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM, DTT 1 mM, com um caudal de 1 ml / min ou 0,5 ml / min, dependendo do tamanho da coluna utilizado. Nota: cromatografia de exclusão de tamanho, também pode ser realizada em solução salina tamponada com fosfato (PBS), se necessário. </li><li> Purifica-se as proteínas de acordo com o tamanho através da aplicação de tampão para a coluna a uma taxa de 1 ml / min ou 0,5 ml / min, dependendo do tamanho da coluna. Nota: A proteína que elui da coluna é fraccionado e controlada por meio da absorvência a 280 nm. </li><li> Um único pico de absorvância deve ser esperado a partir de SEC, que é fraccionado e avaliada por SDS-PAGE para determinar a homogeneidade, e é tipicamente&gt; 95% de pureza após este passo. </li></ol></li><li> Concentra-se a purificou kindlin-3-CHIS 6 usando um concentrador de centrífuga com uma proteína de 50 kDa MWCO de ~ 15 mg / ml, tal como avaliado espectrofotometricamente usando um coeficiente de extinção calculado (ε) de 109,320 M-1cm-1 &lt;/ Sup&gt; (assumindo que todos os resíduos de cisteína são reduzidas). </li><li> Para o armazenamento a -20 ° C e armazenagem a longo prazo a -80 ° C, a alíquota de proteína nos tubos de flash e congelar as amostras em azoto líquido de PCR. Alternativamente, a proteína pode ser utilizada directamente para a investigação utilizando um número de técnicas bioquímicas e biofísicas. </li></ol>

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Chem. 286, 43334-43342 (2011).</li><li>Zhao, Y., Chapman, D. A., Jones, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+baculovirus+recombination.">Improving baculovirus recombination.</a> Nucleic Acids Res. 31, (2003).</li><li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+ligation-independent+cloning+method+suitable+for+high-throughput+expression+screening+applications.">A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications.</a> Nucleic Acids Res. 35, 45 (2007).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. 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Os autores não têm nada a revelar.

Os sistemas de expressão de baculovirus estão a tornar-se cada vez mais popular e uma ferramenta importante para a produção de quantidades de miligrama de proteína recombinante para a caracterização da proteína por meio de estudos biofísicos, incluindo a cristalografia de raios-X. Apesar de ser mais exigente experimentalmente os sistemas de expressão de baculovírus oferecem várias vantagens sobre E. coli uma das quais é um ambiente quase-nativos para as proteínas de origem eucariótica, por exemplo a presença de acompanhantes e oportunidade para modificação pós-tradução apropriados. Em nossos próprios esforços para expressar kindlin-3, expressão hospedeiros alternativos foram utilizados, incluindo linhas de células de mamíferos e as tensões de expressão bacteriana (observações não publicadas). Geralmente, o número de E. coli estirpes testadas produziram quantidades muito pequenas de recombinante kindlin-3 (~ 0,5 mg / L de cultura, observações não publicadas). No entanto, a expressão controlado por baculovírus em células de insectos foi particularmente eficaz e, em comparison a expressão transitória em células de mamíferos, mais favorável para a geração de grande biomassa necessária para o isolamento de um miligrama de proteína citoplasmática recombinantes (observações não publicadas). Especulamos que a presença chaperonas eucarióticas pode permitir a produção eficiente de kindlin-3. Os Baculoviridae infectar células de insectos e para a expressão da proteína recombinante de baculovírus usado neste trabalho baseia-se na Autographa californica vírus da poliedrose nuclear (AcNPV). Na natureza o AcNPV, que infecta o Autographa californica (alfafa lopper) larvas de insetos, requer a proteína poliedrina para formar oclusões em que os virons são encapsulados em uma matriz de proteína cristalina proporcionando a proteção necessária para a sua libertação. Em células em cultura não é necessária a formação de corpos de oclusão para a replicação e é, portanto, dispensável. No caso de expressar proteínas estranhas no gene da proteína poliedrina pode ser replaced em um AcNPV recombinante com o gene para a proteína de interesse. AcNPV pode infectar outras espécies de lepidópteros e para os efeitos de minhoca proteína recombinante expressão exército Spodoptera frugiperda são usadas células de ovário de pupa. Na abordagem aqui descrita, o bacmid AcNPV (BAC10) foi concebido de modo a que um gene virai essencial, ORF1629, é inactivado pela inserção de cloranfenicol acetil-transferase que resulta em um bacmid knock-out (BAC10: KO 1629), de tal modo que é incapaz de formar baculovirions infecciosas 28. A cotransfecção de células Sf9 com BAC10 linearizado: KO 1629 e os FERMT3 contendo repara vector de transferência a ORF1629 inactiva, por meio de transposição, resultando em um genoma viável que também tem incorporado o gene FERMT3 sob o controlo do promotor da poliedrina 28. Descreve-se um protocolo de purificação para o isolamento de elevada pureza rato recombinante kindlin-3 através de um tridimee passo abordagem cromatográfica. Os métodos usados ​​aqui podem ser facilmente aplicados a outras proteínas His-tag. Nós empregamos um passo de troca iónica para purificar kindlin-3, mas acreditamos que este é mais um passo pseudo-afinidade como kindlin-3 possui um grande número de resíduos básicos, incluindo um trecho de poli-lisina dentro de seu domínio F1. Além disso, é considerado kindlin-3 ao ligar-se e interagir com a face citoplasmática da membrana de plasma, onde funciona, e por conseguinte, podemos prever que o agrupamento de resíduos básicos vai permitir que a proteína de contrariar a membrana carregada negativamente. Os buffers descritos nos protocolos de purificação são considerados padrão e são freqüentemente usados ​​em biologia estrutural. O ensaio thermofluor (Figura 5) demonstra que kindlin-3 é estável na maior parte das condições de tampão com pH acima de 6,0. Isto foi particularmente útil e importante para informar nossas experiências quando se estuda kinldin-3: β1A interacção da cauda por RMN, que produziu excelente espectros a pH 6,1 com baixas concentrações de NaCl a 12. Antes de qualquer estudo biofísico pode ser realizado, é importante demonstrar que a proteína purificada de interesse é de facto correctamente dobrada e é funcionalmente activo. Numa publicação anterior, foi demonstrado que a recombinante kindlin-3 expressa e purificada usando este método foi um monómero e monodisperso em solução, tal como avaliado por cromatografia de exclusão de tamanho, dispersão dinâmica de luz, ultracentrifugação analítica e pequeno ângulo de dispersão de raios-X, e foi também capazes de se ligar e reconhecendo a NPxY-membrana distal ea montante conjunto serina / treonina de β 1A caudas citoplasmáticas 14, confirmando assim que ele se comporta como a proteína nativa, o que está em linha com estudos celulares e fisiológicos anteriores 14,20,22. O uso de um ensaio de estabilidade térmica é uma forma adicional de sugerindo the a dobragem correcta da proteína de interesse, como a proteína incorrectamente dobrada irá resultar em um fundo elevado de fluorescência devido à presença de resíduos hidrofóbicos expostos. A família kindlin de proteínas tem sido o foco de muita atenção, uma vez que o seu papel inesperado coativadores essenciais de integrinas in vivo foi descoberto. Isso provocou muito esforço para expressá-las de modo recombinante e resolver suas estruturas. Até à data, sucesso limitado tem sido relatada em expressando quantidades de miligramas de proteína recombinante de comprimento total, mas que têm aqui descrito o uso de um sistema de baculovírus, que permite a expressão em larga escala em níveis em que estudos estruturais tornam-se possíveis. Ao gerar grandes quantidades de recombinante kindlin-3 prevemos que isso vai ajudar mais estudos desta proteína. O método de purificação e o fluxo de trabalho controlado por baculovírus descrito aqui para murino recombinante kindlin-3 também pode ser utilizado para expressar e purificar as outras isoformas kindlin, Que também são difíceis de expressar e também possuem extensões poli-lisina, e podem ser ainda adaptado para outras proteínas citoplasmáticas, tais como proteínas de ligação de ácido nucleico, que não conseguem expressar em estirpes bacterianas.

As proteínas da família kindlin são um componente essencial do conjunto de adesão focal, e, por conseguinte, essencial para a vida complexo. Kindlins, dos quais existem três isoformas em mamíferos (kindlin-1, kindlin-2, e kindlin-3), são considerados coativadores extracelulares dos receptores integrinas juntamente talina 1. A adesão das células mediada pela integrina liga a superfície da célula com a matriz extracelular (ECM) em eucariotas superiores. É um processo crítico e comum num grande número de fenómenos fisiológicos, incluindo a integridade do tecido, a embriogénese, o metabolismo do osso, a hemostasia e a imunidade. A adesão das células mediada pela integrina é activado através de dentro para fora a transdução do sinal através da ligação do talina e kindlin para as integrinas β-subunidade caudas citoplasmáticas (TCs) os seus motivos NPxY conservadas. A importância biomédica de proteínas kindlin estende no entanto, tanto quanto o núcleo, onde kindlin-2 tem sido demonstrado em vários relatórios recentes para ser envolvida na transcriçãoai controlar 2,3. Kindlins são proteínas vários domínios de aproximadamente 75 kDa, caracteriza-se por a posse de uma FERM bipartido C-terminal (4,1 banda, Ezrin, radixina, moesin) de domínio, que é interrompida por uma homologia plecstrina (PH) de domínio no centro do seu subdomínio F2 4,5. Estudos dos domínios kindlin-2 e kindlin-3 PH mostraram que ele se liga ao segundo mensageiros lipídicos fosfatidilinositol-(3,4,5)-trifosfato e fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato 6-8. No entanto, os estudos do domínio PH kindlin-1 mostram que se liga a PtdIns (3,4,5) P 3, com uma afinidade muito mais baixa, o que pode ser explicado em kindlin-1 por uma ponte de sal específico da isoforma impedindo lípidos de ligação 9. Além disso, há um circuito de aminoácidos ~ 100 inserido no domínio F1 das kindlins que está previsto para ser desdobrada, mas se liga a fosfatidilserina no folheto interno da membrana plasmática 10,11. O FERM kindlindomínio é considerado homólogo ao domínio talina FERM, embora o domínio talina FERM não possui um domínio de homologia plecstrina. Ambos kindlins talina e interagir com motivos NPxY nas β-caudas integrina através da região F3 do seu domínio FERM, mas kindlin se liga ao motivo da membrana distal, enquanto que tem como alvo a talina proximal membrana um 12-16. Kindlins e talina, tanto em adição possuem um domínio N-terminal F0 com uma dobra da ubiquitina-like que não se encontra em outras proteínas FERM 11,17. Estudos sobre o domínio de F0 kindlin-2 têm demonstrado que se liga de forma independente para o fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato membranas enriquecidas 17. Os kindlins apresentam padrões de expressão tecido-específica parálogo e funções fisiológicas não redundantes. Kindlin-1 é expresso principalmente na epiderme, mas também, em menor grau do cólon, do estômago e dos rins; kindlin-2 é expressa ubiquamente, mas concentra-se no estriado e lisomusculares e é a única kindlin expressa no desenvolvimento embrionário 4 e kindlin-3 é expressa em tecidos hematopoiéticos, com a maior concentração de kindlin-3 encontrados em megacariócitos 18. No entanto, estudos mais recentes sugerem que a proteína funcional é expresso nos tecidos endoteliais, bem 19. Kindlin-3 é de interesse médico agudo, devido ao seu papel fisiológico importante no sangue. É essencial para a agregação de plaquetas e formação de trombos durante o espalhamento 20, leucócitos de rolamento, em resposta à infecção e inflamação 21,22 e a formação de osteoclastos em podócitos reabsorção óssea 23. Além disso, a depleção de kindlin-3 em seres humanos conduz à deficiência de adesão dos leucócitos do tipo III - uma doença caracterizada por desordens de sangramento com risco de vida e infecções bacterianas recorrentes 20,24,25. Kindlin-3 estudos knock-out em camundongos revelaram a função crucial da proteína emadesão celular KIND3 -. / - ratos exibir fenótipos distintos, tais como hemorragia grave devido a integrinas inativos plaquetas, osteopetrose grave, e prejudicada a adesão de leucócitos 20,22, lembrando os sintomas em humanos falta kindlin-3. Dados estruturais de alta resolução nas kindlins, até à data, tem sido restrito a subdomínios individuais, tais como a homologia plecstrina (PH) domínio de kindlin-1 9 e kindlin-2 26,27 eo domínio de F0 kindlin-1 11 e kindlin -2 17. A maioria dos subdomínios de cada polipeptídeo kindlin têm, porém, resistiu a clonagem e análise estrutural (Yates e Gilbert, observações não publicadas), e os estudos das proteínas completos foram impedidos pela dificuldade de expressar e purificar quantidades suficientes usando E. coli (observações não publicadas e Harburger et al. 14). Há um interesse considerável em medicina kindlin-3 e sua function, juntamente com os outros dois membros da família, e, recentemente, geramos miligramas dele por expressão recombinante em células de Spodoptera frugiperda impulsionado por infecção baculovírus 12. Por isso, aqui descrevem métodos para a produção de quantidades de miligrama de rato recombinante kindlin-3 em cultura de células de insecto, adequados para estudos estruturais extensas e análise bioquímica. Neste protocolo, fazer uso de um bacmídeo nocaute engenharia (BAC10 KO: 1629) que é, por si só, incapaz de produzir partículas virais viáveis ​​28. O DNA viral é assim resgatado por recombinação com um vector de transferência que neste caso inclui também o gene kindlin-3 (FERMT3) e resulta no gene FERMT3 substituindo o vírus gene muito tardio, o que é altamente expressa, mas redundante, o que resulta em um recombinante vírus que expressa rato kindlin-3, como parte do ciclo de vida do vírus 28. Identificamos estamétodo para a produção de kindlin-3 após tentativas de expressar e purificar-lo em outros hosts de expressão provou proibitivamente difícil (observações não publicadas), mas também devido à versatilidade da suíte vetor Popin, que foi utilizado para clonagem e que podem implantado em muitos expressão hospeda 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1147">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Sf-900 II serum free media (SFM) 1X liquid</td>
			<td style="width:123px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">10902-096</td>
			<td style="width:439px;">store at 4&#176;C and warm to room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td style="width:123px;">InVitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Alternatively, GeneJuice transfection (EMD) reagent can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Streptomycin Sulphate (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>S0148</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Penicillin G, potassium salt (solid)</td>
			<td style="width:123px;">Melford</td>
			<td>P0580</td>
			<td>Sterilise filter (0.22&#956;m filter) before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">CELLSTAR Sterile 6-well Culture Plate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>10100-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8849</td>
			<td>Caution: Protease inhibitors are dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Bovine pancrease deoxyribonuclease (Dnase) I&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HisTrap FF (5ml)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-5286-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">HiTrap Heparin (5ml)</td>
			<td style="width:123px;">GE Heathcare</td>
			<td>17-0407-01</td>
			<td>Requires an &#196;kta FPLC machine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:467px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (with Ultracel-50 membrane)</td>
			<td style="width:123px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td style="width:439px;">15ml capacity and a MWCO of 50kDa protein concentrator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient production and purification of recombinant murine kindlin-3 from insect cells for biophysical studies

Kindlins coativadores são essenciais, com talina, dos receptores de integrinas da superfície celular e também participar na integrina de fora para dentro de sinalização, e o controlo de transcrição do gene no núcleo da célula. Os kindlins são ~ 75 kDa proteínas vários domínios e se ligam a um motivo NPxY ea montante grupo T / S da cauda citoplasmática integrina β-subunidade. A isoforma kindlin hematopoietically importante, kindlin-3, é essencial para a agregação de plaquetas durante a formação de trombos, leucócitos rolando em resposta a infecção e a inflamação e a formação de osteoclastos em podócitos reabsorção óssea. O papel de Kindlin-3 nestes processos resultou em extensos estudos celulares e fisiológicas. No entanto, existe uma necessidade para um método eficiente de aquisição de quantidades de miligrama de alta qualidade da proteína para estudos posteriores. Nós desenvolvemos um protocolo, aqui descrita, para a expressão eficiente e purificação da recombinante murino kindlin-3 pela utilização de um baculovirus-dsistema de expressão dividida em células Sf9 produzindo quantidades suficientes de proteína de alta pureza de corpo inteiro para permitir a sua caracterização biofísica. A mesma abordagem pode ser feita no estudo das outras isoformas kindlin mamíferos.

A expressão em larga escala de rato recombinante kindlin-3 utilizando células Sf 9 infectadas com baculovírus pode levar menos de duas semanas, para atingir quantidades de miligramas, tal como ilustrado na Figura 1A esquemática e requer apenas uma pequena quantidade de DNA de plasmídeo a partir de um kit QIAprep Miniprep, para exemplo. A geração de baculovirus recombinante é conseguida por cotransfecção de células Sf9 com o rato kindlin-3 (FERMT3) contendo, juntamente com um plasmídeo linearizado baemídeo preparado (BAC10: KO 1629) e recolhendo as partículas virais recém-formados, após 5-7 dias, tal como mostrado na figura 1A. Este método de geração de resultados de baculovírus em 100% de vírus recombinantes e, essencialmente, dispensa a necessidade de purificação de placa 28,30. Uma em pequena escala (2 ml monocamada) cultura representativa irá gerar uma solução que contém o vírus recombinante com um título viral esperado de unidades formadoras de 1 x 10 7 de placa (pfu) por ml decultura. Pode-se realizar um ensaio de placas para determinar o título virai efectiva, mas esta é, talvez, demasiado trabalhoso quando um grande número de construções são testados para estudos estruturais. O êxito do passo de geração de vírus pode ser avaliada através da utilização de um plasmídeo contendo eGFP em paralelo, ou, para este kindlin-3 construto, a monocamada Sf9 pode ser ressuspenso em PBS e avaliou-se por SDS-PAGE e Western blotting, o que demonstra tipicamente uma banda clara correspondente a uma proteína de 75 kDa marcada com His, como mostrado na Figura 1B. O vírus é posteriormente amplificado para gerar quantidades suficientes para grande escala (volumes litros) infecção de células de inseto e isolamento de proteínas recombinantes. A segunda passagem do vírus (P2) é gerado por infectar culturas de suspensão com um MOI estimado de 0,1 (ver protocolo). É vital que a amplificação Sf9 cultura suspensão ocupa apenas um vigésimo do volume total de frasco. Esta aeração adicional garante que o vir resultandonós contendo mídia, colhida após 3 dias (72 horas) pós-infecção, irá gerar quantidades suficientes de kindlin-3 no subseqüente expressão da cultura. O estoque de vírus amplificado (P2) é assumido como possuir um título viral esperado de 2 x 10 8 pfu / ml com base numa estimativa conservadora de 100 ufp / célula usando uma densidade de células de 2 x 10 6 células / ml, durante a amplificação 31. Geralmente, para a amplificação de baculovirus óptima e produção de proteína, as células Sf 9 deve ser uniforme em tamanho e esférico, como mostrado na Figura 1C. Além disso, a amplificação e expressão de proteínas virais é máxima a 72 h após a infecção, e ambos são significativamente reduzida às 96 h pós-infecção. Uma vez que o vírus foi amplificado e usado para infectar as células Sf9 em experiências em grande escala recombinante kindlin-3 é parcialmente purificado por virtude da sua engenharia C-terminal Sua 6-tag utilizando cromato de afinidade com metal imobilizadotografia, como mostrado na Figura 2. É importante levar a cabo a purificação, a 4 ° C e que os inibidores da protease suficientes foram adicionados para evitar a proteólise. O kindlin-3 parcialmente purificada é ainda purificada a quase homogeneidade por cromatografia de permuta iónica (IEC), utilizando uma coluna de heparina, como se mostra na Figura 3. Aplicou-se o uso de uma coluna de heparina, em vez de uma coluna de troca iónica convencional, como se previu que o grande número de resíduos básicos, incluindo um trecho de poli-lisina no domínio F1 kindlin-3, que interagem fortemente com os grupos sulfato negativamente carregados da coluna. Esta estratégia é particularmente útil para as proteínas de ligação a ARN-ADN e com manchas de base de ligação de ácidos nucleicos, por exemplo o terminal de ligação de ARN-Uridililtransferase Cid1 32. Finalmente kindlin-3 pureza é &quot;polida&quot; por cromatografia de exclusão de tamanho para remover agregados e conseguir homogeneidade, como mostrado naFigura 4. Os buffers especificados nos protocolos são buffers padrão freqüentemente utilizados em purificação de proteínas para análise estrutural. Geralmente, tampões à base de fosfato são evitados para a purificação de proteínas para estudos estruturais, especialmente a cristalização de triagem devido à formação de cristais de fosfato nas gotas de cristalização (em particular para as experiências, a 4 ° C). No entanto, foi realizado um teste de desvio térmico baseado em Thermofluor para determinar quais os tampões foram estabilizador para kindlin-3, como mostrado na Figura 5. Resumidamente, uma solução de proteína purificada é diluída em tampões que cobrem uma gama de concentrações de cloreto de sódio de pH e, por conseguinte, a formação de uma tela de duas dimensões. A fusão da proteína é medida por observação da fluorescência do corante laranja Sypro (sondas moleculares), que se liga aos resíduos hidrófobos no interior do núcleo da proteína dobrada, ao longo da gama de temperaturas 20-95 ° C (293-368 K). O ponto médio da temperatura em que the proteína se desdobra (temperatura de transição, T m) foi calculada utilizando o software Opticon monitor e é descrito em outro lugar 33. Kindlin-3 foi observado para ser estável a concentrações elevadas de cloreto de sódio (500 mM) no intervalo de pH 7,0-9,0, com uma temperatura de transição consistente (T m) de 55 ° C. Observou-se também que a T m de Kindlin-3 foi cerca de 55 ° C dentro do intervalo de pH de 7,0-7,5, independentemente da concentração de cloreto de sódio. Observou-se que havia a proteólise limitada de kindlin-3 durante a purificação, mas a análise de SDS-PAGE da proteína altamente concentrada (~ 15 mg / ml) demonstrou contaminação limitada com dois polipéptidos adicionais de igual intensidade. Estranhamente, no entanto não há nenhuma indicação de espécies adicionais de cromatografia de exclusão de tamanho, tal como mostrado na Figura 4. É, assim, pensou que a proteína é cortado por proteases, mas permanece dobrada e hydrodynamically indistinguível de proteína de corpo inteiro. Curiosamente, calpaína é uma protease que cliva conhecido kindlin-3 em Tyrosine373, o qual está no ciclo β1-β2 da homologia plecstrina (PH) do domínio 34 e pode explicar as observações. Além disso, a transferência de western revelou que um dos dupletos polipeptídicas possui um His-Tag de terminal-C e o peso molecular aparente da dupleto, quando somadas, é igual a 75 kDa, o mesmo peso molecular que a proteína nativa. O rendimento do purificada recombinante kindlin-3 por litro de células Sf9 (~ 2 g de peso de células) é, na melhor das hipóteses, 5 mg. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral Visão geral da expressão da proteína heteróloga células de inseto infectadas com baculovírus. (A) A esquematizado de generatio baculovírusn e expressão de kindlin-3 em células Sf9. Nos esquemas de vetores de DNA, 5&#39;UTR / ORF603 é colorida em vermelho, a ORF1629 é colorido em verde e, o gene da proteína de interesse (POI) é de cor azul. (B) Western blot, utilizando um anticorpo anti-His anticorpo 6, de seis em pequena escala (2 ml) culturas de monocamada (pistas marcadas de acordo com a cultura) de células Sf9 produzindo baculovírus recombinante e recombinante murino kindlin-3. (C) Imagem de microscopia de luz de células Sf9 saudáveis ​​cultivadas em suspensão de Sf-900 SFM II suplementado com antibióticos e transferida para uma cultura de 35 mm de tecido bem prato (ver protocolo). Imagem ampliação 20X. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig2.jpg" /> Figura 2. Represepurificação ntative de kindlin-3 por cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC). SDS-PAGE de afinidade de níquel purificada recombinante murino kindlin-3 expressa em baculovírus infectadas células Sf9 (~ 2 g de peso de células). Proteína adsorvida foi eluida utilizando um gradiente de imidazol (mostrado acima o gel). Lanes são rotulados como segue; MW, marcador de peso molecular; Lys, lisado de células inteiras; FT, fluir através de (não ligada); WI, lave 1; WII, lave 2. Análise de Western blot (abaixo) também foi realizada utilizando as frações de eluição para confirmar a presença da His-tag engenharia da proteína recombinante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig3.jpg" /> Figura 3. Reprepurificação representativa de kindlin-3 por cromatografia de afinidade de heparina. (A) perfil de eluição observada a 280 nm (azul) mostrando um único pico simétrico eluição sob um gradiente de cloreto de sódio linear (verde), utilizando a faixa de concentração de NaCl de 0,05-1,0 M. ( B) Análise de SDS-PAGE da eluição fracionado demonstrando a presença da proteína kDa 75, kindlin-3 (K3 rotulado). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig4.jpg" /> Figura 4. Representativas de cromatografia de filtração em gel e (A) perfil de filtração em gel concentrado kindlin-3. Eluição de purificado kindlin-3 usandoum S200 Superdex (16/60) em Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM e DTT a 1 mM a 20 ° C. Com base no volume de eluição, kindlin-3 migra como esperado para uma proteína de 75 kDa, sugerindo que é predominantemente monomérico. (B) SDS-PAGE de altamente concentrado recombinante purificada kindlin-3 em 14,5 mg / ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51206/51206fig5.jpg" /> Baseado no Thermofluor Figura 5. Teste de desvio térmico para tampão de rastreio. Kindlin-3 foi diluído em vários tampões que compreendem um ecrã bidimensional de pH em função da concentração de cloreto de sódio. As temperaturas de transição de temperatura (pontos médios) foram observados por fluorescência de ocorante hidrofóbico obrigado, Sypro laranja (sondas moleculares) e calculados usando o software Opticon Monitor. (A) Um histograma 3D das temperaturas de transição é representada em conjunto com (B) a modificação na temperatura de transição a partir da média calculada de 50,4 ° C. Para maior clareza as barras são coloridas de acordo com o intervalo de temperaturas a que eles correspondem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51206/51206fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

efficient-production-purification-recombinant-murine-kindlin-3-from

Research

JoVE Journal

Biology

23.2K visualizações.  University of Oxford.  Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus. 

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Um método para produção de proteína recombinante em células de inseto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Biologia

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

A purificação cromatográfica do não-polipéptidos recombinantes Elastina semelhantes e suas fusões com Peptídeos e Proteínas de<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.

Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary but also across multiple points of control within the hypothalamic/pituitary/ovarian circuit. Within the ovary, multiple specialized cell types grow in close association with the oocyte within the ovarian follicles. The biology of these cells has been well described at the later stages, when they are easily recovered as byproducts of assisted reproductive treatments. However, the in-depth analysis of small antral follicles isolated directly from the ovary is not commonly carried out due to the scarcity of human ovarian tissue and the limited access to the ovary in patients undergoing assisted reproductive treatments. 
These methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips with the concurrent identification/isolation of ovary resident cells enable the high-resolution analysis of the early stages of antral follicle development. We demonstrate protocols for isolating discrete cell types by treating antral follicles enzymatically and separating the granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells. The isolation of cells from the antral follicles at various sizes and developmental stages enables the comprehensive analysis of the cellular and molecular mechanisms that drive follicle growth and ovarian physiology and provides a source of viable cells that can be cultured in vitro to recapitulate the follicle microenvironment.

Here, we present protocols for the identification and purification of ovarian cells from antral follicles. We elaborate on methods for processing whole ovaries for the cryopreservation of cortical strips while also harvesting intact antral follicles that are treated enzymatically to liberate multiple follicle resident cell types, including granulosa, theca, endothelial, hematopoietic, and stromal cells.

Extração, marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...