Gostaríamos de agradecer ao Dr. Xiaowen Yang (serviço de clonagem PROTEX) para preparar as construções de expressão utilizadas para este trabalho e da Universidade de Leicester Núcleo de Biotecnologia Services. Este trabalho foi financiado por uma bolsa de estudo BBSRC, o Programa Wellcome Trust e subsídios pesquisador sênior WT085408 &amp; WT100237 e BBSRC conceder RM31G0224.

NOTA: O protocolo é adequado para qualquer escala de expressão, por conseguinte, os volumes e as quantidades dos reagentes deve ser dimensionado proporcionalmente. Um vector de expressão adequado de mamífero podem ser utilizados para este protocolo. Aqui utilizou-se uma modificação de pcDNA 3,1 vector de expressão que permite convenientemente a inclusão ou exclusão de um marcador de afinidade de acordo com a escolha das enzimas de restrição utilizados na clonagem (Figura 1). O protocolo seguinte descreve um transfecção grande escala. 1 Large Scale Cultura / transfecção em 1 L frascos cilíndricos Crescer e manter as células adaptaram-HEK293F suspensão de acordo com protocolos padrão. Tipicamente, as culturas de arranque, entre 30 e 100 ml são cultivadas em balões de 250 ml de cultura de células cónicas. <ol><li> Células de sementeira em 0.5 x 10 6 células / ml para um volume final de 300 ml em cada frasco rolante 1 L. NOTA: frascos rolantes acomodar um mínimo de 150 ml até um máximo de300 ml de cultura em suspensão. Para transfections maior escala usar várias garrafas. </li><li> Incubar durante 24 horas num incubador agitador orbital a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO2, até atingir uma densidade de células de 1,0 x 10 6 células / ml (células devem dividir aproximadamente a cada 24 h). </li><li> Pipetar um total de 300 ug de ADN, esterilizada por filtração (ver método suplementar) em 30 ml de PBS e vortex vigorosamente durante 3 seg. NOTA: É um total de 1 ug de DNA por milh de culas transfectadas. Se dois ou mais plasmídeos são para ser co-transfectadas reduzir a quantidade de cada um de modo a que a proporção de ADN para células permanece constante. </li><li> Adicionar 1,2 ml de 0,5 mg / ml filtrar esterilizado PEI para a solução de PBS / ADN e vortex vigorosamente durante 3 seg. </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Adicionar o ADN / PEI misturar com as células - que devem estar a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml (passo 1.3). </li><li> Após a co-transfecção, as células incubarnum incubador agitador orbital durante mais 48 horas a 37 ° C, 120 rpm, e 5% de CO 2. </li><li> Proteínas intracelulares da colheita por centrifugação as células a 3000 xg durante 5 min e armazenar o sedimento a -80 ° C. NOTA: Como alternativa, usar um padrão (não-CO 2) agitação da incubadora, quando a atmosfera acima da cultura é substituído com 5% de CO 2 e a tampa do frasco é selado. A atmosfera terá de ser substituída, em cada passagem (normalmente a cada 2 dias). </li></ol> 2.-Protein complexo purificação do extrato de células inteiras Este protocolo é otimizado para a purificação de complexos nucleares que utilizam proteínas marcadas no pavilhão. <ol><li> Descongelar sedimento celular em ~ 40 ml de tampão de lise de pré-gelada (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100, os inibidores de protease) por l de cultura. </li><li> Re-suspender o pellet pipetando para cima e para baixo várias vezes (para evitar a formação de espuma, não vórtice). </lEu&gt; <li> Exaustivamente re-suspender as células utilizando um homogeneizador de vidro. Sonicar por 3 ciclos (15 seg, 15 seg em off). Centrifugar a 30.000 xg por 25 min a 4 ° C e manter sobrenadante. </li><li> Equilibrar 1,25 ml de anti-bandeira embalado resina de agarose por litro de cultura por lavagem três vezes com tampão de equilibração de resina (de acetato de potássio 100 mM, Tris 50 mM, pH 7,5). </li><li> Incubar o extracto de células inteiras a partir do passo 2.3 com a resina de afinidade, em um ou mais tubos de centrífuga de 50 ml e cuidadosamente girar a amostra durante 30-120 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte. </li><li> Lava-se a resina com 45 ml de tampão de pré-refrigerada 1 (100 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% de glicerol, 0,3% Triton X-100). Centrifugar a 3000 xg por 1 min e elimine o sobrenadante. </li><li> Repetir o passo 2.7, utilizando tampão de alto teor salino (300 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, glicerol a 5%), seguido de tampão de baixa salinidade (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 70,5, glicerol a 5%) e Tampão de Clivagem TEV (50 mM de acetato de potássio, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM). NOTA: Certifique-se de cada lavagem é breve ou seja, suficiente para totalmente re-suspender a resina, e não mais. </li><li> Coletar uma amostra de 10 mL de resina e diluir em um volume de tampão de carga de proteína 2x para análise (controle de proteínas). Não utilizar agentes redutores, para evitar a libertação de anticorpo a partir da resina. </li><li> Re-suspender a resina em 8-10 ml de tampão de clivagem de TEV pré-refrigerado e transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Adicionar ~ 40 ug de protease TEV (a partir de estoque de 1 mg / ml) por l de cultura original e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Substituir tubo atmosfera com 100% de gás N2 para evitar a oxidação da proteína. </li><li> Delicadamente gire O / N a 4oC. </li><li> Centrifugar a 3000 xg durante 10 min. Transferir o sobrenadante para um filtro de ultra-centrifugação com um peso molecular de corte adequado e concentraraté 500 ul. </li><li> Recolher uma amostra de 10 ul da proteína concentrada e diluída em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. (TEV controle eluato). </li><li> Recolher uma amostra de 10 ul da resina e dilua em 1 volume de tampão de carga de proteína 2x para análise. Não utilizar agentes de redução, a fim de evitar a libertação de grandes quantidades de anticorpos a partir da resina. (Controle de resina pós-TEV). </li><li> Equilibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão de filtração em gel (acetato de potássio 50 mM, 50 mM Tris pH 7,5, TCEP 0,5 mM). </li><li> Filtra-se a proteína através de um filtro de 0,22 um </li><li> Coloque a amostra na coluna e recolher as frações. </li><li> Amostras executado a partir de passos 2.9, 2.15 e 2.16 e as fracções de filtração gel de passo 2,19 em um SDS-PAGE e Coomassie mancha para análise. NOTA: É aconselhável correr um gel de SDS-PAGE de amostras de passos de 2,9, 2,15 e 2,16 antes da filtração em gel para confirmar a expressão da proteína alvo.</li>
</ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Desenvolvemos um método eficaz e simples de custo (PEI custa muito menos do que os reagentes de transfecção disponíveis comercialmente lipófilos) para a expressão e purificação de grandes quantidades de proteínas recombinantes e os complexos de múltiplas subunidades a partir de células de mamíferos. Transfecção óptima e a eficiência de expressão pode ser alcançada se o DNA de plasmídeo muito puro (260/280 entre 1,8 e 2,0), é usado em combinação com PEI como descrito na secção de protocolo. As células devem ser cultivadas em meios sérica e sem antibiótico, por conseguinte, uma técnica estéril é estritamente necessária para a passagem em células de transfecção e para evitar infecções dispendiosas e demoradas. A viabilidade das células deve ser de 90% ou superior, e as culturas não devem ser cultivadas a densidades superiores a 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção, pois isso irá reduzir o rendimento de proteína. Para a transfecção de sucesso, culturas deve conter apenas uma única célula ou divisão. Clusters podem ser quebrados pelo vigorous vórtex de 20 a 30 segundos (Figura 5). A proporção de cada um plasmídeo utilizado na co-transfecção pode ser variado pelo utilizador de acordo com a estequiometria do complexo ser estudado. A eficiência de expressão pode ser optimizado para a proteína de interesse, de modo que um tempo de expressão adequado pode ser estabelecida. A purificação devem ser realizadas mantendo a amostra fria proteína em todos os momentos para reduzir o risco de degradação proteolítica não desejado. A escolha de marcas e memórias intermédias de purificação é crítica, uma vez que podem interferir com os elementos estruturais ou locais activos de determinadas proteínas, resultando muitas vezes na solubilidade e / ou a perda de actividade enzimática reduzida. Transfecções pequena escala são particularmente úteis para testar diferentes construções para a purificação de grandes complexos de proteínas. Hoje em dia, uma grande variedade de metodologias alternativas estão disponíveis para a expressão de proteínas eucarióticas recombinantes (Quadro 2). Por exemplo, Baculovirus de expressão em células de insecto é amplamente utilizado devido à sua elevada eficiência de transdução e a sua falta de toxicidade em comparação com outras espécies virais 6. No entanto, o processo de fabrico do vírus é demorado e sua instabilidade não permite que o vírus a ser armazenado por longos períodos. Por outro lado, os sistemas de expressão de levedura oferece a possibilidade de as células a densidades muito elevadas de crescimento em culturas de fermentação, resultando em rendimentos elevados de proteína 7. Mas ainda não têm toda a variedade de modificações pós-tradução necessárias para proteínas eucarióticas para dobrar correctamente e interagem com os seus parceiros de proteína. HDAC3, por exemplo, é expresso, mas não se dobra em E. coli. No entanto, quando expressa em células 293F, que foram capazes de purificar uma enzima activa num complexo com o seu co-repressor (SMRT) e uma molécula de inositol tetrafosfato (IP4) 8, o qual não se encontra em células procarióticas. Este método também permitiu-nos a purificar e resolver o cristal Structure de HDAC1 interagindo com MTA1 no complexo NURD, a qual é igualmente activado pelo IP4 9. Idealmente, nós sempre gostaria de expressar proteínas eucarióticas em seu ambiente natural, fisiológico. Os sistemas de expressão de mamífero empregando células HEK 293-EBNA1 em biorreatores 10-12 foram descritas e produzir níveis muito elevados de proteína, mas estas podem ser complexas. O nosso método é uma alternativa simples e acessíveis a expressão em sistemas de bactérias, leveduras e biorreatores. O método de expressão é rápido e não requer o uso de equipamento caro, especialmente se o ambiente em frascos rotativos ou frasco é substituída com 5% de CO 2 e agitam as incubadoras convencionais são utilizados. Usámos estes protocolos de co-transfectar vários plasmídeos e purificar complexos com até cinco proteínas com rendimentos de&gt; 1 mg / L de cultura. Curiosamente, o sistema ajuda a identificação de complexos estáveis ​​bem comportados. Por exemplo, expressão do complexo binário de HDAC1 e deram rendimentos limitados Sin3A de proteína, mas a adição de SDS3 resultou em 5 vezes quantidades mais elevadas e, portanto, guia a biologia estrutural na escolha de construções adequadas e complexos estáveis ​​para cristalização.

O rápido progresso da biologia celular e molecular a necessidade constante de drogas melhorou em medicina criou uma necessidade para os biólogos estruturais de olhar para estruturas de proteínas cada vez mais complexos. Estas muitas vezes podem exigir determinadas modificações pós-traducionais, chaperones moleculares e co-fatores para apoiar a sua dobradura elaborado e atividade enzimática. Embora a grande maioria das estruturas presentes no Protein Data Bank foram obtidos usando os sistemas de expressão bacterianos, procariotas são incapazes de realizar um grande número de modificações e estas não têm muitos co-factores essenciais eucarióticas. Isto pode ser um problema para o estudo de grandes complexos de multi-subunidades que são activados por pequenas moléculas de sinalização, bem como para nuclear, da superfície da célula e as proteínas segregadas que requerem mecanismos de dobragem elaborados. Um número de E. coli foram projetados para superar algumas destas limitações 1. Nos últimos anos, no entanto, a utilização de msistemas de expressão ammalian tem vindo a aumentar, porque eles produzem de forma confiável proteínas eucarióticas que são de outra problemática para expressar em outros sistemas 2. Hoje em dia, é possível obter linhas celulares estáveis ​​de mamífero e expressão transitória por meio de uma variedade de técnicas que vão desde a transdução virai da transfecção mediada por produto químico, o gene de transferência física, tais como electroporação e injecção directa 3. Apesar de todos esses métodos têm o seu próprio conjunto de vantagens e desvantagens, apenas alguns deles são adequados para estudos estruturais serem muito caros e / ou demorado. Aqui nós descrevemos um método muito simples, rápido, de baixo custo, mas altamente eficiente para expressar complexos de proteínas para a biologia estrutural na suspensão crescido células de mamíferos. A abordagem utiliza transientes de co-transfecção de uma linha de rim embrionário humano (HEK) célula (por exemplo, células HEK 293F Livres). Estas células foram derivadas da ce HEK 293linha ll, estão adaptadas a crescer em culturas de suspensão, atingindo altas densidades utilizando meio isento de soro (por exemplo, 293 Freestyle Expressão Médio). As células são então transfectadas transitoriamente utilizando uma versão ramificada de polietilenimina (PEI), um reagente polimérico de baixo custo que tem sido relatado para funcionar para uma grande variedade de células de mamíferos 4, formando complexos ADN / PEI que entram na célula hospedeira por endocitose 5. Este método é adequado tanto para pequena escala (30 ml) e em larga escala (até 300 ml) e as experiências podem produzir níveis elevados de complexos de proteínas purificadas. É particularmente útil para o estudo de proteínas que requerem mecanismos de dobragem complexo, co-factores ou particulares de modificações pós-tradução que não pode ser realizada por bactérias, leveduras e células de insectos. Neste protocolo, apresentam a expressão e purificação do andaime central de três proteínas do complexo de repressão transcricional Sin3A. Este consiste de histonaDeacetylase 1 (HDAC1), supressor defeituoso de silenciamento 3 (SDS3) e Switch-independente 3 (Sin3A). O complexo purificado é utilizado para ensaios de cristalização de alto rendimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="865">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:292px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FreeStyle HEK 293F cells&#160;</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td>R790-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:315px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td style="width:140px;">LifeTechnologies</td>
			<td style="width:119px;">12338-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
			<td style="width:140px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">A220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:315px;">250 ml Erlenmeyer Flask with Vented Cap</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Roller bottles with vented caps</td>
			<td style="width:140px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">01836-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:315px;">Polyethylinamine, 25 kDa, branched</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">408727</td>
			<td style="width:292px;">Make 0.5 mg/ml stocks in H2O, adjust pH to 7.0 with dilute HCl and store at -20 - 4&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Mammalian expression vector</td>
			<td style="width:140px;">-</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">15 ml Ultra centrifugal filters (10 kDa cut-off)</td>
			<td style="width:140px;">Amicon</td>
			<td style="width:119px;">UFC901008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Superdex&#160; 10/300 GL</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-5175-01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recombinant protein expression for structural biology in hek 293f suspension cells: a novel and accessible approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

Aqui mostramos de 2 L (8 x 250 ml culturas) transiente de co-transfecção e a purificação da HDAC1, SDS3, complexo ternário Sin3A. HDAC1 e SDS3 interagir com Sin3A através do domínio HDAC-interação (HID) de Sin3A. Um rendimento típico de purificação superior a 1 mg de complexo por litro de cultura. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 Representação esquemática do vector de expressão pcDNA 3.1 modificado. O plasmídeo foi digerido com EcoRV e EcoRI de modo a incluir o marcador de afinidade e o local de clivagem de TEV no terminal amino de Sin3A. Para clonar as versões não marcados de HDAC1 e SDS3, o vector foi digerido com Kpnl e EcoRI. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. SDS-PAGE mostra a primeira fase de purificação. A pista &quot;proteína ligada&quot; mostra o complexo ligado à resina de afinidade. Após a digestão de TEV, o marcador presente na Sin3A-HID é clivada e o complexo é eluída a partir da resina, como mostrado no segundo e terceiro pistas do gel. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Cromatograma de cromatografia de exclusão de tamanho utilizando proteína purificada do complexo. Note-se que o complexo puro eluído no volume vazio porque forma um dímero em solução. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 mostra SDS-PAGE das fracções da filtração em gel mostrado na Figura 3. Figura 5 tripano células HEK 293F coradas de azul em 2.3x10 6 células / mL prontas para serem transfectados. Células só devem estar presentes na forma de células individuais ou divididas, enquanto grandes aglomerados pode ser cindida por vórtice vigoroso durante aproximadamente 25 seg. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Possíveis causas </td><td> Ação </td></tr><tr><td rowspan="4"> Rendimento de proteína baixa. </td><td> Baixo número de células transfectadas. </td><td> Certifique-se a densidade das células é de aproximadamente 1,0 x 10 6 antes da adição da mistura de reacção para a transfecção da cultura. </td></tr><tr><td> As células podem ter sido subcultivadas demasiadas vezes. </td><td> Use células-mãe fresca após aproximadamente 90 passeas idades. </td></tr><tr><td> O ADN pode ser degradado ou ter uma grande quantidade de impurezas. </td><td> Certifique-se o ADN de plasmídeo a ser usado tem uma proporção de 260/280 entre 1,8 e 2,0. Executando o ADN num gel de agarose é aconselhável para avaliar a sua qualidade. </td></tr><tr><td> Proteína (s) a ser expresso não são estáveis ​​ou solúveis suficiente. </td><td> Teste diferentes construções em pequena escala antes de up-scaling as transfections. Certificar-se que as etiquetas não interfiram com a estrutura da proteína (s) de interesse. </td></tr><tr><td> Células olhar turvo e ter uma cor e / ou cheiro estranho. </td><td> As células são infectadas com bactérias ou leveduras. </td><td> Boa técnica de esterilização deve ser utilizado em todos os momentos. Fumigating as capelas de fluxo laminar e UV-desinfecção sala de cultura celular em caso de infecção ajuda contendo o problema. </td></tr><tr><td rowspan="2"> As células têm baixa viabilidade. </td><td> PH errado na mídia. </td><td> Certifique-se que as culturas são cultivadas em 5-8% de CO 2em todos os momentos. </td></tr><tr><td> As células foram cultivadas até uma densidade de mais de 3,0x10 6 células / ml. </td><td> As células não devem ser cultivadas até densidades acima de 2,5 x 10 6 células / ml, imediatamente antes de uma transfecção e nunca acima de 3,0 x 10 6 células / ml. </td></tr><tr><td rowspan="2"> A purificação por afinidade não funcionou </td><td> Proteína (s) não está a ser expressa. </td><td> Veja acima. </td></tr><tr><td> Condições de purificação pode estar errado. </td><td> Ajustar as condições de tampão (por exemplo, sal elevado, de baixa concentração salina, pH). </td></tr></tbody></table> Tabela 1 Solução de problemas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistema </td><td> Vantagens </td><td> Desvantagens </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> Rápidosistema de expressão </li><li> Elevados rendimentos proteicos </li><li> Barato </li><li> Indicado para a produção acessível de proteínas marcadas isotopicamente </li></ul></td><td><ul><li> Falta de chaperonas importantes que podem ser necessários para o dobramento das proteínas </li><li> Falta de muitas modificações pós translacionais </li><li> Podem não ter co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Pode executar a maioria das modificações pós-tradução </li><li> Barato </li></ul></td><td><ul><li> Falta algumas modificações pós-traducionais </li><li> Podem não ter co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa. </li></ul></td></tr><tr><td> De expressão de baculovírus em células de insecto </td><td><ul><li> Pode efectuar todas as modificações pós traducionais &lt;/ Li&gt; <li> Baculovirus é menos citotóxica do que outras estirpes virais </li></ul></td><td><ul><li> Preparação do vírus para a transdução é demorado </li><li> O vírus não é estável e não pode ser armazenada por longos períodos de tempo </li><li> Células de inseto pode faltar co-fatores que são importantes para a função da proteína e / ou montagem complexa. </li></ul></td></tr><tr><td> Biorreactores com sistemas de mamífero </td><td><ul><li> Pode efectuar todas as modificações pós translacionais </li><li> Pode fornecer todos os co-fatores necessários para a função da proteína e montagem complexa </li><li> Can células de cultura em altas densidades </li><li> Pode expressar todas as proteínas de mamíferos que exigem máquinas de dobrar complexos </li><li> Rendimentos muito elevados de proteína </li></ul></td><td><ul><li> Requer pessoal especializado para usar o biorreator. </li><li> Equipamento caro é necessária. </li><li> Otimizando condição expressãos pode ser demorado. </li></ul></td></tr><tr><td> As células em suspensão HEK 293F </td><td><ul><li> Pode efectuar todas as modificações pós translacionais </li><li> Pode fornecer todos os co-fatores necessários para a função da proteína e montagem complexa </li><li> Pode expressar todas as proteínas de mamíferos que exigem complexa maquinaria dobrável </li><li> Protocolo rápido e intuitivo transfecção </li><li> Relativamente barata em comparação com biorreactores e / ou outros reagentes de transfecção disponíveis comercialmente. </li></ul></td><td><ul><li> Embora acessível, não tão barato como a expressão em bactérias </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabela 2. vantagens e desvantagens dos sistemas de expressão principais.

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Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

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Biology

53.3K visualizações.  University of Leicester. The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

Um método para produção de proteína recombinante em células de inseto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Biologia

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Uma interface de usuário gráfica para rastreamento assistido por software da concentração de proteínas em protrusões celulares dinâmicas

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...