Agradecemos FortéBio para fornecer gráficos utilizados na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM083088 para DTM

<html> 1. Programação do Instrumento de BLI Assay Ligue o instrumento pelo menos uma hora de antecedência para permitir que a lâmpada para aquecer, o que é necessário para minimizar o ruído e deriva em sinal óptico durante o experimento. Regule a temperatura desejada por meio da guia instrumento para pré-aquecimento do suporte da placa de amostra. Em seguida, criar o projeto experimental no software de aquisição de dados. Selecione &quot;New Kinetics Experiment&quot; na guia Assistente de Experiment. Isto apresenta um menu com abas com todos os passos que devem ser definidos. 1.1. Definição Placa Definir as colunas para ser utilizado na chapa de amostra, de 96 poços. Atribuir colunas para conter buffer, proteína imobilizada ou parceiro de ligação. Para cada associação bem, introduzir a concentração de agente de ligação a ser usado. Nota: a definição da placa mostrada na Figura 2 tem opções para ensaios diferentes. 1.2. Definição Assay EOR &quot;&gt; Definir as medidas necessárias para o ensaio. Estas incluem: (i) Base (vários), (ii) a carregar, (iii) associação e (iv) A dissociação do parceiro de ligação. Em seguida, como descrito abaixo, as etapas do ensaio ligação individuais com colunas de poços na placa de amostra, selecionando a etapa de análise e, em seguida, clicar duas vezes sobre a respectiva coluna. Este programa os sensores de ser movido de uma coluna de poços para o próximo durante o ensaio. <ol><li> Linha de Base Começar com uma breve etapa de linha de base (≥ 60 seg), com os sensores em tampão de ensaio (figura 2, coluna 1), para estabelecer os sinais de BLI iniciais na placa de 96 poços. </li><li> Carregando (imobilizando a proteína biotinilada sobre os sensores) Atribuir os sensores para os poços que contêm a proteína biotinilada (figura 2, coluna 2). Use a função de limite para atingir um nível pré-determinado de ligação (ver Introdução). Defina a opção de limite para que todos os sensores estarão movimentod para a próxima coluna de poços, quando qualquer um dos sensores atinge o limiar. </li><li> Linha de Base Incluir uma outra etapa de referência em tampão (Figura 2, a coluna 3, normalmente&gt; 5 minutos), para lavar as proteínas biotiniladas nonimmobilized a partir dos sensores e os sinais de referência estabelecer novos, estáveis. Para os ensaios de ligação de base / dissociação apenas (como na Figura 3), incluir um passo adicional de linha de base (60 seg) com sensores em novos poços de tampão (Figura 2, coluna 4), ​​antes do passo de associação. </li><li> Associação (do parceiro de ligação à proteína imobilizada) Para um ensaio de ligação de base / dissociação (como na Figura 3), seleccionar um intervalo de concentrações de agente de ligação a ser usadas para diferentes sensores / poços (figura 2, coluna 5). Ajustar o tempo de passo, de modo que pelo menos uma concentração de saturação do agente de ligação deve aproximar-se do equilíbrio de sinal de ligação. Para umaensaio para testar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes na dissociação do complexo proteína-proteína (tal como na Figura 5), seleccionar uma única concentração elevada de agente de ligação (~ 10 vezes superior ao estimado K D) para a utilização em todos os poços de associação. </li><li> A dissociação (do parceiro de ligação) Para um ensaio de ligação de base / dissociação única (como mostrado na Figura 3), pode designar os sensores para voltar à coluna 4 (Figura 2), os mesmos poços como tampão utilizados para a linha de base extra antes de associação. Para um ensaio para testar os efeitos alostéricos de pequenos ligantes, em vez designam sensores para mover a coluna 6 (Figura 2), em que cada poço pode conter tampão mais diferentes ligandos alosticos. </li></ol> 1.3. Atribuição Sensor Indicam os locais do tabuleiro sensor que irá conter sensores prewetted para o ensaio. Identificar todas as posições vazias desde o experimento fail se não sensores são apanhados. 1.4. Revisão Experiment Visualize todas as medidas planejadas para verificar se há erros e voltar para corrigi-los. 1.5. Execute Experiment Digite os detalhes necessários, incluindo a localização dos arquivos de dados. Digite a temperatura desejada para o experimento. Se os sensores ainda exigem prewetting, selecione a opção de adiar o início do experimento. Finalmente, uma vez que toda a preparação da amostra é completo (passo 2) e tanto a placa de amostra e sensor de bandeja são carregados no instrumento, clique no botão Go para executar o ensaio. 2. Preparação de Amostras <ol><li> Preparar um tampão de teste apropriado. Tampão utilizada para as experiências mostradas nas Figuras 3 e 5: 20 mM de MOPS (ácido 3 - (N-morfolino) propanossulfónico), Tris (tris (hidroximetil) amino-metano) (adicionados para ajustar o pH a 8,0), KCl 50 mM. Incluir BSA (albumina de soro de bovino, de ácidos gordos livres-, 0,5mg / ml final) no tampão para todas as etapas do ensaio e para todas as diluições da proteína biotinilada ou parceiro de ligação para minimizar a ligação não específica de proteínas para os sensores. </li><li> Dilui-se a proteína biotinilada (ε) em tampão de ensaio até uma concentração apropriada (ver introdução). </li><li> Preparar diluições do parceiro de ligação (F 1 (-ε)) em tampão de ensaio (ver discussão para a gama de concentrações de usar). </li><li> Prewet os sensores revestidos com estreptavidina durante pelo menos 10 minutos para remover o revestimento de protecção de sacarose. Retire o suporte contendo o sensor a partir da bandeja do sensor e inserir uma placa de 96 poços no fundo do tabuleiro, deslizando um canto da placa no entalhe de orientação sobre a bandeja. Para a coluna de sensores a utilizar, adicionar 200 ul de tampão de ensaio por po em que a coluna da placa de 96 poços. Retorne o rack de sensores para a bandeja na orientação correta (com guias em slots). </li><li> Conforme designado durante a programação na Etapa 1, preencha o poçosf a placa amostra com tampão de ensaio ou as diluições adequadas de proteína, como mostrado na Figura 2. Evite a introdução de bolhas, pois podem causar ruído no sinal óptico. Incluem um ou mais poços de referência que omitem ou (i) a proteína biotinilada ou (ii) o parceiro de ligação. </li><li> Abra a porta do aparelho e inserir o sensor de bandeja para o palco (à esquerda), com abas da bandeja inseridos nos slots do palco. Insira a placa de amostra no suporte da placa (à direita), certifique-se de que a placa está bem encaixada e na orientação correta, conforme indicado no suporte da placa. Fechar a porta e iniciar o ensaio de o programa de aquisição de dados (passo 1.5). </li></ol> 3. Informática <ol><li> Após o ensaio foi executado, abra o software de análise de dados e carregar a pasta que contém os dados. Clique na aba &quot;Processamento&quot; para ver um menu passo a passo de Processamento (à esquerda) e os dados cinéticos matérias, com cada sensor (AH) atribuída uma cor diferente (verFigura 3). </li><li> Em &quot;Seleção de dados&quot;, clique no botão &quot;Sensor Seleção&quot;. Sobre a &quot;Amostra Prata Map&quot;, designar os poços para 1 ou 2 sensores de controle (G, H em ensaio da Figura 3), como poços de referência. No menu Processamento, marque a caixa &quot;subtração&quot; e selecione &quot;Wells referência&quot; para subtrair sinal de referência (simples ou média) de sinal de todos os outros sensores. </li><li> Alinhe todos os vestígios de Y = 0 usando a etapa &quot;Alinhar eixo Y&quot;. Selecione &quot;linha de base&quot;, como a etapa de alinhamento (sendo esta a última linha de base antes da etapa Association). Para o &quot;Intervalo de tempo&quot;, digite os últimos 10 segundos do que da linha de base (ou seja, 50-60 seg para 60 seg linha de base, como na Figura 3). </li><li> Marque a caixa &quot;Inter-passo Correção&quot; para minimizar as mudanças de sinal entre as etapas de associação e dissociação. Selecione alinhar a linha de base ou dissociação. </li><li> Selecione a função de filtração Savitzky-Golay na maioria dos casos e clique em &quot;Dados do Processo&quot; para prosseguir. Inspecione visualmenteos dados finais processados ​​(painel inferior direito). Com ensaios destinados a análise de dados global (como na Figura 4), ​​se os traços de sinal mostram uma mudança significativa entre Associação e etapas de dissociação, altere a seleção de dissociação ou a linha de base para a &quot;Correção Inter-passo&quot; e reprocessar os dados antes de prosseguir para dados Análise. </li></ol> 4. Análise de Dados Clique na guia &quot;Análise&quot; in Análise de Dados para começar. Nota: o exemplo os passos indicados a seguir são para a análise global de múltiplas curvas de ligação / dissociação (como na Figura 3). <ol><li> Para o &quot;Passo a analisar&quot;, escolha associação e dissociação. Para o &quot;Modelo&quot;, selecione 01:01. Nota: outras opções disponíveis são limitados. </li><li> Para a &quot;montagem&quot;, escolha Global (completa). Para o &quot;Group By&quot;, selecione Cor (como no gráfico). Selecione &quot;R max desvinculado por Sensor&quot; para permitir montagem independente de R max (resposta de sinal máxima sobre saturando ligação do partner à proteína imobilizada). Nota: fazemos isso para a maioria dos ensaios, como sensores de variar um pouco na quantidade de proteína imobilizada (veja a Figura 3, Loading). </li><li> Na tabela apresentada, certifique-se todos os vestígios de sensores a serem analisados ​​têm a mesma cor, então eles vão ser analisados ​​como um conjunto global. Se necessário, selecione uma ou mais sensores traça omitir de montagem mundial: na coluna &quot;Incluir&quot;, clique com o botão direito sobre a posição do sensor desejado e selecione &quot;Excluir Wells&quot;. </li><li> Clique em &quot;Curvas em forma!&quot; para iniciar a análise de regressão não-linear. Examine os resultados de ajuste, que incluem (i) sobreposição das curvas de regressão com vestígios de dados de sensores (como na Figura 4), ​​(ii) parcelas de resíduos de montagem, e (iii) uma tabela com os valores dos parâmetros determinados (constantes de velocidade, R max, K D) e estatísticas (erros padrão para os parâmetros, Qui-quadrado, R 2). </li><li> Em &quot;Exportar Dados&quot;, salve os resultados ajustados, clicando em &quot;Exportar tabela csv para.&quot;. Para graphing ou uma análise mais aprofundada de dados / curvas equipadas com outro software, clique em &quot;Exportar Resultados de montagem&quot; para salvar os dados de cada sensor e curva ajustada em um arquivo de texto. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific,+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli.">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li><li>Dayne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioLayer+Interferometry+(BLI)+-+How+Does+it+Work?.">BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?.</a> Fort&#233;Bio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).</li><li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry.">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li></ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.

Instrumentos actualmente disponíveis para BLI permitir a produção e flexibilidade significativa nos ensaios para interacções biomoleculares. Várias amostras de solução são dispensados ​​em poços de uma placa de microtitulação preto, e um conjunto de sensores BLI paralelas são programados para se mover para trás e para a frente entre as colunas de poços na placa. As amostras são agitadas por agitação orbital durante todo o ensaio. O sistema utilizado aqui tem oito sensores e usa uma placa de amostra...

Interacções proteína-proteína são importantes para muitos processos biológicos, e métodos ópticos livre do rótulo como a superfície Plasmon Resonance (SPR) têm sido utilizados in vitro para estudar a cinética de ligação e de dissociação 1. A maioria dos métodos sem rótulo imobilizar uma biomolécula em uma superfície do sensor e usar um sinal óptico para detectar um parceiro de ligação de solução, uma vez que se associa com a biomolécula imobilizada 1. Enquanto SPR é um método altamente sensível, é propenso a interferências devido a mudanças no índice de refração da solução que flui sobre o sensor 2. Apesar de não ser tão sensível quanto a SPR, Bio-camada Interferometria (BLI) é menos afetado por mudanças na composição da amostra 1,3. BLI usa biossensores de fibra óptica que têm um revestimento biocompatível proprietária na ponta. O sistema utilizado aqui (Octeto-RED96) contém oito espectrofotômetros. A luz branca é canalizada para uma linha de sondas que se movem em um braço robótico. Sensores de fibra óptica are captado pelas sondas e mudou-se para uma placa de 96 poços contendo amostras. Uma das moléculas alvo é imobilizado na superfície do biossensor. Em seguida, os sensores são movidos para cavidades contendo o parceiro de ligação em solução. BLI monitora associação do parceiro de ligação com a molécula imobilizada e depois monitora dissociação depois de se mudar os sensores de solução sem o parceiro de ligação. A ligação de moléculas de superfície do biossensor leva a alterações na interferência óptica entre ondas de luz que reflectem para trás para os espectrofotómetros a partir de uma superfície interna e externa a partir da interface entre o sensor e solução. Estas alterações na interferência pode ser quantificado e utilizado para determinar as taxas cinéticas de ligação e de dissociação, tal como resumido na animação da figura 1. Temos aplicado BLI para medir as interacções entre o complexo catalítico da ATP sintase bacteriana e sua subunidade ε, o qual pode auto-inibir a enzima. ATP synthase é um nanomotor rotativo encaixado à membrana que catalisa a síntese e hidrólise de ATP 4. O complexo catalítico (F 1) pode ser isolado de uma forma solúvel que funciona como uma ATPase. Subunidade ε tem dois domínios: o domínio N-terminal (NTD) é necessário para a montagem correcta e acoplamento funcional da enzima, mas não interagem directamente com as subunidades catalíticas; do domínio C-terminal (CTD) pode inibir a enzima, interagindo com várias subunidades catalíticas 5,6. Esta regulação mediada por ε é específico para ATP sintases bacterianas e não se observa no homólogo mitocondrial. ATP sintase emergiu como um alvo para drogas antibacterianas, como mostrado pela recente aprovação do FDA bedaquiline no tratamento da tuberculose resistente aos medicamentos 7. Assim, visando papel inibitório da ε para a descoberta da droga poderia render antibacterianos que não inibem a ATP sintase mitocondrial. Com o complexo catalítico isolado (F 1), εtorna-se uma subunidade dissociáveis. No entanto, com ε ligado a M 1, o εCTD pode sofrer uma alteração conformacional dramática, parcialmente inserção na cavidade central da enzima e formando um estado de inibição, que é pouco provável que se dissociam directamente 6,8. Usamos BLI para medir cinética de F 1 / ε ligação e dissociação, e indiretamente, para examinar os efeitos alostéricos do local catalítico ligantes na conformação de ε. No nosso sistema, ε foi escolhido para a imobilização na superfície do sensor, uma vez sinal BLI (como SPR) é sensível à massa das moléculas de ligação à superfície. A subunidade ε é pequena (~ 15 kDa), em relação ao principal complexo F 1 (~ 347 kDa). Assim, um sinal de BLI maior irá resultar da ligação de F 1 a ε imobilizada. A fim de monitorar F 1 de dissociação, o que pode ser muito lenta, ε deve ser fortemente imobilizada. Assim, optou-se por biotinilarE imobilizá-la em biossensores revestidas com estreptavidina. As proteínas podem ser biotinilada por (i) a modificação aleatória de lisinas da superfície 9, (ii) a reacção de uma cisteína nativa única ou engenharia com um reagente biotina-maleimida de 10 ou (iii) a adição de um péptido geneticamente biotina-receptor específico que é enzimaticamente biotinilado durante expressão in vivo da proteína marcada 11. No nosso sistema, ε é biotinilado utilizando método (iii) 8. Uma vez ε marcado com biotina, está imobilizado sobre sensores estreptavidina, BLI pode medir a ligação e dissociação do F 1 que foi esvaziada da subunidade ε (F 1 (-ε)). Para as experiências aqui descritas, os ensaios preliminares foram feitos para determinar quantidades razoáveis ​​de proteína biotinilada para imobilizar sobre os sensores. Isto pode variar, dependendo do peso molecular da proteína e do seu parceiro de ligação, mas o objectivo é o de determinar uma quantidade mínima de proteína imobilizada tchapéu fornece (i) aceitável sinal-ruído para a cinética de ligação com uma baixa concentração do parceiro de ligação (abaixo K D) e (ii) uma distorção mínima de cinética de ligação com a concentração de quase saturação do parceiro de ligação. Além disso, a estequiometria de biotinilação pode variar (mas evitar&gt; 1 mol biotina / proteína mol), de modo algum ensaio inicial pode ser necessário para cada novo lote de proteína biotinilada para confirmar que um sinal consistente BLI pode ser alcançada durante a imobilização da estreptavidina-revestida sensores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Octet-RED96</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">30-5048</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A6003-10G</td>
			<td>Fatty Acid free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosensor/Streptavidin</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">18-5019</td>
			<td>Tray of 96 sensors</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Microtiter plate</td>
			<td style="width:108px;">Greiner Bio-one</td>
			<td style="width:119px;">655209</td>
			<td>Black, Polypropylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Acquisition software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Data Analysis software</td>
			<td style="width:108px;">Pall/Fort&#233;Bio</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.4</td>
			<td>Newer versions available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects

Descreve-se o uso de bio-camada de interferometria para estudar interacções inibidoras de subunidade ε com o complexo catalítico de Escherichia coli ATP sintase. Bacteriana tipo F ATP sintase é o alvo de um novo antibiótico, aprovado pela FDA para combater a tuberculose resistente a medicamentos. Compreender bactérias específicas auto-inibição da sintase do ATP pelo domínio C-terminal da subunidade ε poderia proporcionar um novo meio para a enzima alvo para a descoberta de medicamentos anti-bacterianos. O domínio C-terminal de ε sofre uma alteração conformacional dramática quando as transições de enzimas entre os estados activos e inactivos, e ligandos do local catalítico, que podem influenciar de conformações de ε é predominante. As medidas do ensaio de cinética de ε ligação / dissociação com o complexo catalítico, e indiretamente meamede a mudança de ε ligado a enzima para e a partir da conformação inibitória aparentemente nondissociable. O sinal de interferometria Bio-camada não é muito sensível para a composição da solução, de modo que também pode ser utilizado para monitorizar os efeitos alostéricos de ligandos do local catalítico de alterações conformacionais do ε.

Ligação em tempo real e da cinética de dissociação BLI são mostrados na Figura 3. Esta experiência foi feita com tampão de ensaio de associação e dissociação. Esta experiência foi iniciada com um passo da linha de base de 10 minutos uma vez que os sensores foram prewet apenas brevemente. Em seguida, ε biotinilado foi carregado sobre os sensores. No dissociação detectável de ε ocorreu em todas as etapas restantes, como visto a partir da curva de referência (G) que não tinha parceiro d...

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε.

Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

28.7K visualizações.  SUNY Upstate Medical University.  Os protocolos aqui descrever os ensaios cinéticos de interações proteína-proteína com Bio-camada Interferometria. Tipo F ATP sintase, que está envolvida no metabolismo da energia celular, pode ser inibida pela sua subunidade ε em bactérias. Temos adaptado Bio-camada de interferometria para estudar as interacções do complexo catalítico com o domínio C-terminal do inibidor ε. 

Vídeo: Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

Um simples e rápido protocolo para medir lipídios neutros em algas células usando fluorescência

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

Química

Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

O exame quantitativo e qualitativo dos Interações partícula-partícula coloidal Usando Probe Nanoscopia

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

An ELISA Based Binding and Competition Method to Rapidly Determine Ligand-receptor Interactions

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and reliable point-by-point protocols of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the investigation of ligand-receptor interactions: the direct ligand-receptor interaction assay (LRA) and the competition LRA. As a case study, the ELISA based analysis of the interaction between different lambda interferons (IFNLs) and the alpha subunit of their receptor (IL28RA) is presented: the direct LRA is used for the determination of dissociation constants (KD values) between receptor and IFN ligands, and the competition LRA for the determination of the inhibitory capacity of an oligopeptide, which was designed to compete with the IFNLs at their receptor binding site. Analytical steps to estimate KD and half maximal inhibitory concentration (IC50) values are described. Finally, the discussion highlights advantages and disadvantages of the presented method and how the results enable a better molecular understanding of ligand-receptor interactions.

The presented protocols describe two enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based techniques for the rapid investigation of ligand-receptor interactions: The first assay allows the determination of dissociation constant between ligand and receptor. The second assay enables a rapid screening of blocking peptides for ligand-receptor interactions.

Um ELISA baseada Encadernação e Método de competição de determinar rapidamente interacções ligando-receptor

A comprehensive understanding of signaling pathways requires detailed knowledge regarding ligand-receptor interaction. This article describes two fast and ...

Synthesis of Ligand-free CdS Nanoparticles within a Sulfur Copolymer Matrix

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature solvents. These coordinating ligands help solubilize and stabilize the nanoparticles while in solution, and can influence the resulting size and reactivity of the nanoparticles during their formation. Despite the ubiquity of using ligands during synthesis, the presence of aliphatic ligands on the nanoparticle surface can result in a number of problems during the end use of the nanoparticles, necessitating further ligand stripping or ligand exchange procedures. We have developed a way to synthesize cadmium sulfide (CdS) nanoparticles using a unique sulfur copolymer. This sulfur copolymer is primarily composed of elemental sulfur, which is a cheap and abundant material. The sulfur copolymer has the advantages of operating both as a high temperature solvent and as a sulfur source, which can react with a cadmium precursor during nanoparticle synthesis, resulting in the generation of ligand free CdS. During the reaction, only some of the copolymer is consumed to produce CdS, while the rest remains in the polymeric state, thereby producing a nanocomposite material. Once the reaction is finished, the copolymer stabilizes the nanoparticles within a solid polymeric matrix. The copolymer can then be removed before the nanoparticles are used, which produces nanoparticles that do not have organic coordinating ligands. This nascent synthesis technique presents a method to produce metal-sulfide nanoparticles for a wide variety of applications where the presence of organic ligands is not desired.

Herein we present a method to synthesize ligand-free cadmium sulfide (CdS) nanoparticles based on a unique sulfur copolymer. The sulfur copolymer operates as a high temperature solvent and a sulfur source during the nanoparticle synthesis and stabilizes the nanoparticles after the reaction.

Síntese de CDs Nanopartículas sem ligando dentro de uma matriz de copolímero de Enxofre

Aliphatic ligands are typically used during the synthesis of nanoparticles to help mediate their growth in addition to operating as high-temperature ...

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Sulfate Separation by Selective Crystallization with a Bis-iminoguanidinium Ligand

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, 1,4-benzene-bis(iminoguanidinium) (BBIG), is demonstrated. The ligand is synthesized as the chloride salt (BBIG-Cl) by in situ imine condensation of terephthalaldehyde with aminoguanidinium chloride in water, followed by crystallization as the sulfate salt (BBIG-SO4). Alternatively, BBIG-Cl is synthesized ex situ in larger scale from ethanol. The sulfate separation ability of the BBIG ligand is demonstrated by selective and quantitative crystallization of sulfate from seawater. The ligand can be recycled by neutralization of BBIG-SO4 with aqueous NaOH and crystallization of the neutral bis-iminoguanidine, which can be converted back into BBIG-Cl with aqueous HCl and reused in another separation cycle. Finally, 35S-labeled sulfate and &#946; liquid scintillation counting are employed for monitoring the sulfate concentration in solution. Overall, this protocol will instruct the user in the necessary skills to synthesize a ligand, employ it in the selective crystallization of sulfate from aqueous solutions, and quantify the separation efficiency.

A protocol for in situ aqueous synthesis of a bis(iminoguanidinium) ligand and its utilization in selective separation of sulfate is presented.

Separação sulfato por cristalização selectiva com um ligando bis-iminoguanidinium

A simple and effective method for selective sulfate separation from aqueous solutions by crystallization with a bis-guanidinium ligand, ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Acesso a Suportes de Ligantes Valiosos para Metais de Transição: Preparação Modificada em Escala Intermediária de 1

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Nucleação e Crescimento Mediado por Ligante de Nanopartículas de Paládio Metálico

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.