A interação proteína-proteína na transcrição tem sido tradicionalmente estudada usando a diálise por. No entanto, a diálise por por é puramente quantitativa. Usamos interferometria biocamada, ou BLI, para superar esse problema.
Em comparação com Por dan, a BLI detecta associação em tempo real e dissociação entre parceiros de ligação. Também gera parâmetros cinéticos quantitativos, que são indicativos de mecanismos de interação. A tecnologia BLI pode parecer intimidante, mas não é difícil aprender Para usar essa tecnologia, é preciso ter acesso a um instrumento BLI e ao software associado.
Este vídeo permitirá que você se adapte facilmente à tecnologia BLI. Aproximadamente 10 minutos antes do início de um ensaio, pipeta 200 microliters do buffer BLI em um tubo PCR. Remova um biosensor NTA de níquel da embalagem original segurando a porção larga do biosensor usando uma mão enluvada.
Coloque o biosensor sobre o tubo PCR de tal forma que apenas a ponta de vidro do biosensor esteja submersa no tampão BLI. Mantenha a ponta do biosensor submersa por pelo menos 10 minutos para garantir a hidratação total. Ligue a máquina Blitz.
Certifique-se de que a máquina está conectada ao computador através de uma porta de saída de dados USB na parte de trás da máquina. No computador, abra o software associado e clique em Advanced Kinetics no lado esquerdo da tela. No software, digite todas as informações apropriadas sobre o experimento sob cada título respectivo.
Clique no Tipo Biosensor e escolha Nickel NTA no menu suspenso. A duração de cada etapa pode ser alterada de padrão conforme necessário. Para obter resultados ótimos, use um mínimo de 30 segundos para a linha de base inicial e linha de base e 120 segundos para associação e dissociação.
Remova o biosensor de níquel hidratado NTA do tubo PCR e afixe-o no suporte biosensor na máquina deslizando a porção larga do biosensor para o suporte. Coloque um tubo de microcentrifusagem preto de 0,5 mililitro no suporte do tubo da máquina e pipeta 400 microliters de tampão BLI nele. Feche a tampa da máquina de tal forma que a ponta do biosensor fique submersa no tampão no tubo de microcentrifuuagem.
Clique em Next no software para começar a gravar a linha de base inicial. Após o passo inicial da linha de base ter terminado a gravação, abra a tampa da máquina. Mova o controle deslizante para a direita, de tal forma que o suporte de gota esteja situado na frente da seta preta.
Pipeta quatro microliters de um ligante marcado por dia para o suporte de gota e fechar a tampa da máquina, que começará automaticamente a gravar a etapa de carregamento. Após o passo de carregamento terminar de gravar, abra a tampa da máquina. Mova o controle deslizante para a esquerda, de tal forma que o suporte do tubo esteja mais uma vez situado na frente da seta preta.
Feche a tampa da máquina e certifique-se de que a ponta do biosensor esteja submersa no tampão BLI do tubo no suporte do tubo. A máquina e o software começarão automaticamente a gravar a etapa da linha de base. Após o passo da linha de base terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
Remova o suporte de gota e limpe-o pipetando qualquer proteína e enxaguando-o com água deionizada dupla por um total de cinco vezes. Use uma limpeza tecidual para limpar a superfície do suporte de gota após a última lavagem. Substitua o suporte de gota de volta na máquina.
Mova o controle deslizante na máquina para a direita, de tal forma que o suporte de gota esteja mais uma vez situado na frente da seta preta. Pipeta quatro microliters de um analito dialisado no suporte de gota e fechar a tampa da máquina, que começará automaticamente a registrar a etapa de associação. Após o passo da associação terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
Mova o controle deslizante na máquina para a direita, de tal forma que o suporte do tubo esteja mais uma vez situado na frente da seta preta e feche a tampa da máquina, que começará automaticamente a gravar a etapa de dissociação. Após a etapa de dissociação ter terminado a gravação, abra a tampa da máquina e remova o suporte de gota e o suporte do tubo. Enxágue bem ambos com água deionizada dupla para lavar qualquer proteína.
Remova o biosensor e descarte-o com segurança. Repita estes passos para o mesmo par de ligantes analitos usando diferentes concentrações de analito. Depois de todas as corridas terem terminado, salve os dados do software clicando em Arquivo e Salvar experimento como no lado esquerdo da tela.
No título Executar dados, selecione Correção de etapa e ajuste de um a um e clique em Analisar para gerar dados cinéticos. Para extrair os dados quantitativos em uma planilha e gerar gráficos, clique em Exportar para CSV e salvar os dados registrados como um arquivo CSV. Abra o arquivo CSV usando um software de planilha.
GrgA de comprimento total é feito de 288 aminoácidos. Como mostrado aqui, uma região média de 28 aminoácidos liga Sigma 28 diretamente. Aqui a região média marcada com um terminal final Sua tag foi usada como ligante, que foi imobilizada pela primeira vez na ponta de um biosensor NTA de níquel.
Gravações de experimentos com três concentrações diferentes de analitos cada uma iniciando 30 segundos antes da ligação de ligante e terminando dois minutos após o início da última lavagem são mostradas. A visualização aprimorada da associação de ligantes e analitos e dissociação é mostrada após a remoção dos valores nos dois primeiros estágios e a redefinição da linha de base. Depois de lavar sem saída e terminal GrgA 138 a 165 fora do biosensor, a associação em tempo real com o analito foi registrada após a adição do Sigma 28.
Finalmente, a dissociação em tempo real foi registrada após a lavagem. Antes dos ensaios bli, o glicerol é removido de ligantes e analitos. Recomendamos que a BLI seja realizada logo após a diálise, conforme discutido no texto.
Depois de caracterizar interações proteína-proteína na transcrição com BLI, pode-se investigar como a interação afeta a iniciação, alongamento e ou término da transcrição.
