Support by Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 and 7339) is gratefully acknowledged.

<ol>
	<li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat/mouse+model+of+brain+function+and+dysfunction.">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5 (2008).</li><li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological,+electrophysiological,+neurological,+and+behavioral+features.">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1 (2012).</li><li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis. , (2004).</li><li>Yu, F. 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G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel.">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li><li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optimization+of+(31)P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution.">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li><li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optimization+of+(31)P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation.">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li><li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methodologies for Metabolomics. , (2013).</li><li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study.">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101 (2013).</li><li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy.">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li><li>Pearson, G. 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The authors have nothing to disclose.

Espectroscopia de RMN é um método eficiente para a medição de concentrações de compostos químicos em solução de um modo muito preciso e reprodutível. No entanto, a obtenção de dados de alta qualidade, é necessário obedecer a certas regras respeitantes à preparação e análise de amostras. Na determinação das concentrações do metabolito por espectroscopia de RMN, nem a geração ou a recepção do sinal de RMN domina o erro de quantificação, a menos que a intensidade de um sinal observado se aproxim...

Modelos murinos têm sido utilizados extensivamente em pesquisas sobre o cérebro 1. Correlações genótipo-fenótipo foram investigados em ratinhos e ratos cérebros por estudar a expressão do gene no RNA e / ou os níveis de proteína em, por um lado, e os fenótipos morfológicos, funcionais, electrofisiológicos e / ou comportamentais no outro 2-6. No entanto, para compreender completamente os mecanismos que ligam fenótipo com o genótipo, é imperativo para investigar os eventos moleculares jusante da expressão da proteína, ie. o metabolismo dos substratos bioquímicos sobre o qual as enzimas actuam 7. Esta exigência levou, ao longo dos últimos 10 a 15 anos, a um renascimento da pesquisa metabólica em muitos ramos da biologia 8,9. Enquanto estudos metabólicos clássicos têm sido muitas vezes focado em detalhes de caminhos específicos, a nova abordagem metabolômica é voltada para uma investigação abrangente do perfil metabólico global do tecido em questão.Uma conseqüência desse conceito é uma necessidade óbvia de ferramentas analíticas que minimizem viés para as vias e / ou classes de compostos metabólicos específicos. No entanto, um ensaio bioquímico clássica baseia-se numa reacção química específica de um analito específico que precisa de ser especificado antes de o ensaio é realizado. Por outro lado, as técnicas espectroscópicas de ressonância magnética (RMN) nuclear e espectrometria de massa (MS) (i) são determinadas com base em propriedades moleculares (físicas) de compostos bioquímicos, cada um dos quais dá origem a um ou vários sinais distintos num espectro detectado no decurso de uma experiência; e (ii) detectar um grande número de compostos diferentes por experiência. Assim, cada espectro contém a informação combinada de toda uma gama de metabolitos. Por esta razão, métodos espectroscópicos são ferramentas adequadas para metabolômica, já que nenhuma seleção prévia precisa ser feita em relação à natureza da substância a medir 8 </sup&gt;. Como consequência, estas técnicas adequam-se naturalmente para estudos exploratórios porque facilitam grandemente a detecção de alterações metabólicas inesperados. Embora espectroscopia de RMN e MS pode ser utilizada indiferentemente para a análise de vários metabolitos, cada método possui vantagens e desvantagens que foram recentemente revisto 10 específicas. Resumidamente, a espectroscopia de RMN pode geralmente ser realizada a partir de extractos em bruto e não necessita de separação cromatográfica de compostos de amostra antes da análise. Por outro lado, MS trabalha com gás ou cromatografia líquida (GC ou LC) separação, exceto para os recentes desenvolvimentos específicos, tais como imagens de espectrometria de massa. Em alguns casos especiais, tais como a análise de açúcares, LC separação pode tornar-se uma necessidade para a espectroscopia de RMN, como bem, porque as linhas de ressonância de diferentes açúcares sobrepõem-se significativamente em protão (1H) Os espectros de RMN. No entanto, uma espectroscopia de RMN sem chrseparação omatographic continua a ser o método de RMN mais popular, quase universalmente aplicada metabolômica. Geralmente, a preparação da amostra é mais demorada e complexa para MS do que para espectroscopia de RMN. Sérios problemas devido a efeitos de matriz são muito menos comuns em espectroscopia de RMN que em MS, onde eles podem levar a sinais consideravelmente atenuados. Metabolito quantificação pode ser conseguida com um ou outro método. No entanto, vários compostos padrão são necessários para a MS, devido às variações nos efeitos de matriz e as eficiências de ionização entre os metabolitos. Pelo contrário, apenas um padrão por exemplo é necessário para uma análise de espectroscopia de RMN, porque sob as condições de medição adequadas, o último método é intrinsecamente graças quantitativos para a resposta RMN estritamente linear pelos núcleos observados. Uma grande desvantagem de RMN é a sua sensibilidade relativamente baixa. MS, em particular, LC-MS, é mais sensível do que a RMN de várias ordens de grandeza; por esta razão, MS é para ser preferido sobre RMN para oanálise de compostos que ocorrem em concentrações muito baixas. Por outro lado, a natureza não destrutiva da experiência de RMN é uma clara vantagem sobre a esclerose múltipla; desta forma, pode ser realizada RMN repetidamente com a mesma amostra, por exemplo, para diferentes núcleos de RMN-activo, tal como um H, fósforo-31 (31 P), carbono-13 (13 C), flúor-19 (19 M) etc., como nenhum material é consumido por RMN em oposição às medições de MS. Tanto a RMN e MS pode ser utilizada em modos diferentes, cada um sendo óptima para a detecção de compostos com características químicas específicas. Por exemplo, 31 P RMN é muitas vezes mais adequados do que 1 H RMN para a análise de compostos fosforilados moderadamente concentrado, embora quase todos os metabólitos fosforilados também contêm protões. No entanto, os sinais de 1 H NMR pode ser obscurecido por sinais de 1 H RMN de outros compostos, não fosforilada, enquanto o segundoobviamente não causam sinais de fundo em 31 P espectros de RMN. Em uma situação análoga, 19 F NMR análise é para ser preferido para os compostos fluorados, por exemplo, drogas fluorados (não há sinais de fundo de metabolitos endógenos), enquanto que o caso especial, de 13 C RMN de interesse é, quase exclusivamente, se o destino do 13C precursores metabólicos marcados exógenos deve ser seguido, devido à extremamente baixa abundância natural dos isótopos de 13 C (cerca de 1%). Muitos espectrómetros de massa de funcionar no modo de iões negativos ou modo de ião positivo. Portanto, é importante saber em frente da análise se os iões a serem observados são negativamente ou positivamente carregada. Nós nos focamos em um protocolo para a análise do tecido cerebral metabolome por 1 H e 31 P espectroscopia de RMN, porque este método produz um grande número de concentrações metabólicas importantes, a baixo custo, em termos de (i) tempo necessário para a preparação de amostras dend (ii) esforço necessário para o metabolito quantificação. Todos os ensaios podem ser realizados utilizando o equipamento de laboratório padrão de química húmida e uma maior facilidade de resolução espectroscopia de RMN. Outros requisitos estão descritos na seção de protocolo a seguir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="921">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:144px;">Virbac</td>
			<td style="width:180px;">Vetflurane</td>
			<td style="width:316px;">Anesthetic for animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda</td>
			<td>Isotec 3</td>
			<td>Newer model available: Isotec 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel, scissors, forceps, clamps</td>
			<td>Harvard Apparatus 
			Fisher Scientific</td>
			<td>various 
			various</td>
			<td>Surgical equipment for animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freeze-clamp tool</td>
			<td>homebuilt</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Tong with aluminium plates, to be inserted 
			in liquid nitrogen for cooling</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dewar</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>4150-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid nitrogen</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen gas</td>
			<td>Air Liquide</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nitrogen evaporator</td>
			<td>Organomation Associates</td>
			<td>N-EVAP 111</td>
			<td>Can be replaced by homebuilt device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mortar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pestle</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z247510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue homogenizer</td>
			<td>Kinematica</td>
			<td>Polytron</td>
			<td>With test tubes fitting homogenizer shaft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic scale</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass centrifuge tubes</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>45500-15, 45500-30</td>
			<td>Kimax 15-mL, 30-mL tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Kimble</td>
			<td>45150-2</td>
			<td>Kimax 2-mL tube; should replace &#34;Eppen-dorf&#34; tube if compatible with centrifuge rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">polystyrene pipettes</td>
			<td>Costar Corning</td>
			<td>Stripettes</td>
			<td>5 and 10-mL volumes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterochloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431915</td>
			<td>99.96 % deuterated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>423459</td>
			<td>99.96 % deuterated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deuterium chloride</td>
			<td>Alpha Aesar</td>
			<td>42406</td>
			<td>20 % in deuterium oxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deuteroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>164488</td>
			<td>30 % in deuterium oxide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lyophilizer</td>
			<td>Christ</td>
			<td>Alpha 1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cold centrifuge</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Megafuge 16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>Eutech Cybernetics</td>
			<td>Cyberscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cesium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>516988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR tubes</td>
			<td>Wilmad</td>
			<td>528-PP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR stem coaxial insert</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z278513</td>
			<td>By Wilmad</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z255688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Research</td>
			<td>With tips for volumes from 0.5 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipet-Aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>AVANCE 400</td>
			<td>including probe and other accessories</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMR software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>TopSpin 1.3</td>
			<td>newer version available: Topspin 3.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water-soluble standard compounds</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phospholipid standard compounds</td>
			<td>Avanti Polar Lipids 
			Doosan Serdary 
			Sigma-Aldrich</td>
			<td>various 
			various 
			various</td>
			<td>&#160; 
			Source for plasmalogens, but may be 
			&#60; 70 - 80 % purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylenediphosphonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSP-d4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>269913</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolomic analysis of rat brain by high resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of tissue extracts

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics and proteomics have been complemented by comprehensive quantitative analysis of the metabolite pool present in biological systems. This strategy, termed metabolomics, strives to provide a global characterization of the small-molecule complement involved in metabolism. While the genome and the proteome define the tasks cells can perform, the metabolome is part of the actual phenotype. Among the methods currently used in metabolomics, spectroscopic techniques are of special interest because they allow one to simultaneously analyze a large number of metabolites without prior selection for specific biochemical pathways, thus enabling a broad unbiased approach. Here, an optimized experimental protocol for metabolomic analysis by high-resolution NMR spectroscopy is presented, which is the method of choice for efficient quantification of tissue metabolites. Important strengths of this method are (i) the use of crude extracts, without the need to purify the sample and/or separate metabolites; (ii) the intrinsically quantitative nature of NMR, permitting quantitation of all metabolites represented by an NMR spectrum with one reference compound only; and (iii) the nondestructive nature of NMR enabling repeated use of the same sample for multiple measurements. The dynamic range of metabolite concentrations that can be covered is considerable due to the linear response of NMR signals, although metabolites occurring at extremely low concentrations may be difficult to detect. For the least abundant compounds, the highly sensitive mass spectrometry method may be advantageous although this technique requires more intricate sample preparation and quantification procedures than NMR spectroscopy. We present here an NMR protocol adjusted to rat brain analysis; however, the same protocol can be applied to other tissues with minor modifications.

Para obter melhor resolução em espectros de RMN metabólica do cérebro e outros extratos de tecidos, tem sido prática comum para remover ou íons máscara de metal (o mais importante: íons paramagnéticos) presentes em soluções de extractos. Isto foi conseguido através da adição de um agente quelante tal como o EDTA ou o extracto de CDTA 19, ou fazendo passar o extracto através de uma resina de troca iónica, tais como Chelex-100 20. Os resultados apresentados na Figura 1</strong...

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Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).

Metabolômica Análise do cérebro de um rato de alta resolução Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Extratos de Tecidos

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

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Research

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Neuroscience

14.6K visualizações.  Aix-Marseille Université. The neurochemistry of mammalian brain is changed in many neurological and systemic diseases. Characteristic profiles of cerebral metabolites can be efficiently obtained based on crude extracts of brain tissue. To this end, high-resolution NMR spectroscopy is employed, enabling detailed quantitative analysis of metabolite concentrations (metabolomics).