A imagem de cálcio é uma técnica extremamente útil para investigar a variedade de papéis que os íons de cálcio têm no funcionamento dos neurônios. Íons de cálcio geram uma infinidade de sinais intracelulares que controlam funções-chave, como a liberação de neurotransmissores de vesículas sinápticas. Os métodos de imagem de cálcio permitem a medição direta do fluxo dinâmico de cálcio dentro dos neurônios e do tecido neuronal. Este vídeo fornece uma visão geral de como os corantes indicadores de cálcio funcionam, como um experimento de imagem de cálcio é concluído e, finalmente, discute algumas das aplicações desta técnica.
Primeiro, vamos rever os princípios bioquímicos dos corantes indicadores de cálcio.
Os corantes indicadores de cálcio são moléculas de quenteador modificadas, como a Fura-2, que são compostas por dois componentes principais. O primeiro é o sítio quelaador que liga cálcio de forma seletiva. O segundo é um local fluorescente que emite luz em um comprimento de onda específico quando iluminado por um comprimento de onda excitação de luz ultravioleta.
A ligação do cálcio ao corante altera suas propriedades de fluorescência, o que fornece uma maneira de quantificar as alterações na concentração de cálcio, que é representada aqui pela diferença de intensidade fluorescente emitida por este neurônio em dois diferentes comprimentos de onda de excitação.
A maioria dos corantes indicadores de cálcio são ainda modificados para permitir que eles cruzem prontamente a membrana celular e são introduzidos na solução de banho com os neurônios ou injetados no tecido cerebral para estudos em animais inteiros.
Alguns corantes têm dupla excitação ou propriedades de emissão dupla, dependendo se o cálcio está ou não vinculado. Tome-se, por exemplo, o corante Fura-2, que tem um comprimento de onda de excitação diferente quando o cálcio está ligado versus quando não é. Tomando a razão da intensidade de emissão nos dois comprimentos de onda de excitação, uma estimativa muito mais precisa da concentração de cálcio pode ser feita.
A dupla excitação ou corantes de emissão, como a Fura-2, são chamados de indicadores de cálcio ratiométricos. Corantes não-ratiométricos que têm comprimentos de onda de excitação e emissão únicos existem. No entanto, eles são mais suscetíveis ao fotobleaching, que é o enfraquecimento ou perda de fluorescência com exposição prolongada à luz.
Um passo fundamental antes de usar um corante em um experimento é calibrar as medidas de fluorescência retiradas do corante com soluções de concentrações de cálcio conhecidas. Isso permitirá que os cientistas estimem com precisão as concentrações intracelulares de cálcio com base nas intensidades de emissão medidas durante os experimentos.
Agora que aprendemos como os indicadores de cálcio funcionam, vamos explorar como imaginar o fluxo de cálcio em neurônios banhados.
Comece preparando o indicador de cálcio de corante de escolha, como o Fura-2, e misturando-o com soluções fisiológicas adicionais. Vórtice a solução para garantir a mistura adequada. Uma vez misturado suficientemente transferir em um prato. Agora coloque o deslizamento de tampa com os neurônios cultivados no prato com a solução de corante. Em seguida, incubar os neurônios no escuro para o tempo necessário na temperatura apropriada, que neste caso é de 30 minutos a 37 °C. Após o período de incubação, transfira o deslizamento para um prato sem o corante.
O próximo passo é montar o deslizamento de cobertura na câmara de imagem do microscópio. Uma vez montado, conecte a linha de entrada do sistema de perfusão e encha lentamente a câmara. Fixar a câmara no estágio do microscópio e instalar as linhas de perfusão de saída, garantindo o fluxo contínuo em todo o sistema de perfusão.
Agora que o estágio do microscópio está pronto, leve os neurônios ao foco usando luz visível. Teste o corante iluminando as células em comprimentos de onda de 340 e 380 nm. Lembre-se que com o Fura-2, os neurônios não ativados devem emitir mais luz quando excitados por 380 nm, já que o cálcio não está ligado.
Em seguida, ajuste as configurações da câmera para otimizar o alcance dinâmico antes de iniciar o experimento. Colete uma imagem em cada comprimento de onda e use a região de interesse ou ferramenta ROI para medir a intensidade de fundo em cada comprimento de onda. Insira os valores de fundo no software de controle para que possam ser subtraídos de imagens subsequentes.
Uma vez concluída a configuração inicial, escolha os cinco campos de exibição que devem ser visualizados para o experimento e salve as coordenadas no software de controle. Durante o experimento, o estágio automatizado se move para um campo, coleta uma proporção da intensidade do campo em comprimentos de onda de 340 e 380 nm, e passa para o próximo campo até que todos os campos sejam coletados.
Em alguns experimentos, um agente farmacológico é adicionado ao fluido de perfusão que causa alterações nos níveis de cálcio intracelular. Uma solução de potássio alto, que despolariza os neurônios, pode fazer com que a concentração intracelular de cálcio aumente como mostrado nesta série de imagens de lapso de tempo e serve como um bom controle positivo. Uma vez concluída a coleta de dados, proceda à análise.
Para analisar os resultados, selecione regiões de interesse que incluam neurônios ou partes de neurônios usando o software. Em seguida, use o software para medir a proporção de imagens de intensidademétrica de ambos os comprimentos de onda em cada ROI em todas as imagens coletadas. Com essas informações, pode ser feita uma avaliação quantitativa das alterações nas concentrações intracelulares de cálcio ao longo do tempo.
Agora que você tem uma compreensão de como a imagem de cálcio nos neurônios é alcançada, vamos olhar para algumas das maneiras que este método valioso é aplicado em pesquisas hoje.
Em primeiro lugar, a imagem de cálcio é usada para investigar como o fluxo de cálcio intracelular fluxua em relação à atividade neural.
Neste estudo, os neurônios individuais foram preenchidos com um corante indicador de cálcio enquanto estavam registrados com grampo de remendo. O controle preciso do potencial de membrana habilitado pela técnica de grampo de remendo fornece uma visão da dinâmica do fluxo de cálcio.
A imagem de cálcio permite que os pesquisadores investiguem a atividade de rede altamente síncronica dos neurônios.
Aqui, neurocientistas usaram imagens de cálcio para avaliar o sinal fluorescente de 40 neurônios. Com essas informações, podem ser determinadas propriedades da rede, como propagação de sinais e correlações neurais.
A dinâmica do cálcio também pode revelar como os neurônios processam sinais do mundo exterior, como cheiros.
Neste experimento, os órgãos de sensoriamento de feromônio extraídos de um nariz de rato foram cultivados na cultura. Os neurônios dentro do tecido foram incubados com Fura-2 e imageados enquanto eram apresentados com odores como urina ou feromônios purificados. Manipulando a expressão de proteínas receptoras odorantas em neurônios olfativos, é possível visualizar diretamente como uma única proteína influencia a capacidade de uma célula responder a cheiros únicos.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE à imagem de cálcio em neurônios. Neste vídeo, discutimos as propriedades por trás da técnica e revisamos um experimento típico.
Dado os muitos papéis importantes do cálcio, a imagem de cálcio continuará sendo uma ferramenta vital na compreensão dos neurônios e como eles interagem uns com os outros.
Obrigado por assistir!
