Os reflexos mais simples das experiências emocionais mais sublimes estão todos enraizados em estruturas moleculares, genéticas e celulares no cérebro. Como um dos mais novos campos da neurociência, a neurociência celular e molecular aproveita a biologia molecular para explorar como genes, moléculas de sinalização e morfologia celular influenciam o sistema nervoso

Este vídeo apresentará descobertas marcantes no campo, abordará questões-chave na pesquisa de neurociência celular e molecular e finalmente mostrará alguns métodos proeminentes que podem ser aplicados para responder a essas perguntas.

Vamos começar por dar uma olhada nas raízes científicas deste campo relativamente jovem.

Antes havia técnicas moleculares, anatomistas e biólogos celulares dominavam a história inicial da neurociência.

No entanto, na década de 1930, um fluxo de físicos, químicos e teóricos para as fileiras de biólogos iniciou a revolução molecular, culminando na descoberta de Watson e Crick da estrutura de DNA e na formalização do dogma central, que explica como o DNA codifica as proteínas que agem como unidades funcionais das células. Pela primeira vez, os neurocientistas foram capazes de investigar o papel de genes e proteínas específicos desempenhados na função do sistema nervoso.

Por exemplo, na década de 1960, Seymour Benzer foi capaz de conectar mudanças comportamentais em moscas de frutas a mutações genéticas específicas, identificando genes-chave expressos em neurônios que controlam o comportamento, como a locomoção.

No mesmo período, Eric Kandel demonstrou que processos complexos como o aprendizado também tinham uma base molecular. Usando o molusco marinho Aplysia, ele analisou extratos de tecido neuronal, e implicou a molécula de sinalização intracelular cíclica AMP em um caminho crítico para o aprendizado.

Então, na década de 1980, membros do laboratório de Shosaku Numa foram os primeiros a clonar moléculas-chave na função neurônio, como o canal de sódio fechado de tensão. Análises dos domínios funcionais dentro dessas grandes proteínas de membrana melhoraram desde então nossa compreensão de como o controle dos movimentos de íons leva ao disparo de neurônios.

Outra descoberta importante nos mecanismos moleculares por trás da comunicação neuronal veio na década de 1990, quando Thomas Sudhof descobriu que íons de cálcio alteram a forma de proteínas que ancoram vesículas cheias de neurotransmissores à membrana celular, explicando como os potenciais de ação levam à liberação precisamente cronometrada de sinais químicos na sinapse.

Da neurofisiologia ao comportamento, as descobertas na neurociência molecular melhoraram nossa compreensão de muitas disciplinas neurocientíficas.

Apesar dessa história produtiva, ainda há muito o que aprender! Vamos rever algumas perguntas que estão sendo feitas nos laboratórios hoje.

Uma área de pesquisa pergunta quais genes influenciam a função neuronal. Por exemplo, as expansões de nucleotídeos em genes específicos são conhecidas por estarem envolvidas em várias doenças caracterizadas pelo declínio constante da saúde dos neurônios, como a doença de Huntington.

Outro grupo de genes sob investigação codifica fatores de transcrição: proteínas que regulam a expressão de genes específicos. Identificar os alvos de DNA de fatores de transcrição específicos do sistema nervoso pode nos dar uma visão melhor do programa genético que nos faz pensar.

Alternativamente, neurocientistas podem perguntar como as moléculas regulam o comportamento neuronal. Por exemplo, eles podem estudar o maquinário molecular que regula os movimentos de íons através da membrana celular, resultando na propagação de potenciais de ação. Pesquisas aqui nos deram anestésicos como lidocaína, que bloqueia canais específicos de íons e interrompe a transmissão de sinais de dor para o cérebro.

Alternativamente, os cientistas podem examinar os locais de interação entre os neurônios, conhecidos como sinapse. Aqui, eles podem perguntar quais moléculas estão envolvidas na preservação da integridade da sinapse, e como essas conexões podem ser restauradas em estados de doenças.

Plasticidade neuronal é a capacidade do sistema nervoso de se adaptar quimicamente e fisicamente em resposta à experiência. Algumas pesquisas neste campo são focadas em mudanças morfológicas dependentes da experiência em estruturas neuronais elaboradas, conhecidas como arbóreas dendríticas, que formam sinapses através de estruturas altamente dinâmicas referidas como espinhas dendríticas. Outros estão interessados em como a experiência pode modificar a distribuição de receptores neurotransmissores em membranas sinápticas, o que pode fortalecer o poder de sinalização de uma sinapse em um fenômeno conhecido como potencialização a longo prazo, ou LTP.

Como você pode ver, neurocientistas celulares e moleculares abordam a neurobiologia a partir de uma visão microscópica, mas a gama de processos que eles estudam é expansiva.

Agora que você está familiarizado com algumas das perguntas emocionantes que são feitas em laboratórios de neurociência celular e molecular, vamos olhar para as ferramentas disponíveis para respondê-las.

Primeiro, para investigar o controle genético da função dos neurônios, os cientistas têm técnicas muito poderosas à sua disposição. Por exemplo, microarrays podem quantificar a expressão de um grande número de genes simultaneamente. Uma microarray é uma superfície com dezenas de milhares de trechos de "sondas" de DNA encalhados. O material genético extraído de um neurônio é permitido se ligar às sondas, e marcadores fluorescentes são usados para visualizar precisamente quais sequências estão presentes na amostra.

Alternativamente, pcr em tempo real ou quantitativo, utiliza equipamentos que podem medir indiretamente a quantidade relativa de transcrições específicas de mRNA através de um método baseado em PCR. Esta abordagem é extremamente útil para detectar os níveis de expressão de genes individuais.

Por último, mas não menos importante, a tecnologia transgênica é uma ferramenta importante para a investigação da função genética no sistema nervoso. Por este método, os pesquisadores podem produzir animais com porções de seus genomas removidos, conhecidos como nocautes, ou com genes modificados inseridos em seu código genético, conhecidos como transgênicos. Os tecidos do sistema nervoso desses animais podem ser analisados de várias maneiras de determinar como as mudanças na expressão genética afetam a função celular.

Para estudar o controle molecular da sinalização neuronal, os pesquisadores muitas vezes preferem estudar tecido cerebral fora do animal, seja em pequenos pedaços de tecido ou em células dissociadas cultivadas in vitro chamadas culturas neuronais primárias. Uma vantagem desse sistema simplificado é a capacidade de manipular eficientemente a expressão de genes de interesse na sinalização neuronal por transfecção. Os resultados dessas manipulações genéticas podem então ser observados pela visualização da localização de proteínas, análise da morfologia celular ou registros eletrofisiológicos.

Por fim, avanços dramáticos na tecnologia de imagem estão permitindo que os cientistas estudem a plasticidade neuronal de novas maneiras excitantes. Por exemplo, os pesquisadores podem usar microscopia de dois fótons para visualizar camadas profundas de tecidos vivos em grande detalhe. Depois de criar uma "janela" no crânio, essa técnica pode ser usada para imagem da morfologia das células cerebrais antes e depois dos animais passarem por uma experiência, permitindo que os pesquisadores vejam como é o aprendizado no nível neuronal.

Ferramentas de imagem também são usadas para investigar componentes moleculares do sistema nervoso em tecidos preservados. A microscopia de fluorescência é frequentemente usada em combinação com a imunohistoquímica, na qual as amostras são manchadas com anticorpos fluorescentes que marcam a localização celular de proteínas específicas.

Tendo revisado tanto questões importantes quanto as ferramentas usadas para respondê-las, vamos olhar para algumas aplicações de pesquisa de neurociência celular e molecular.

Primeiro, aplicando técnicas de microarray a uma pequena população de neurônios, os pesquisadores podem examinar as diferenças na expressão de vários genes em subtipos neuronais específicos. Aqui, foram extraídos neurônios únicos da retina e extraído do RNA celular, permitindo aos pesquisadores traçar o perfil da expressão de mRNAs a partir de células com diferentes características funcionais e morfológicas.

Técnicas moleculares também podem ser aplicadas para entender melhor a resposta do sistema nervoso à lesão. Quando gânglios de raiz dorsal, ou DRGs, são removidos de camundongos adultos para cultura neuronal primária, os axônios são necessariamente cortados. Transfectando os neurônios DRG dissociados com construções de silenciamento genético, é possível testar o efeito de proteínas individuais no recrescimento de novos axônios.

Técnicas especializadas de imagem podem ser usadas para estudar como proteínas como receptores neurotransmissores são transportadas de e para a membrana sináptica. Neste experimento, neurônios cultivados foram transfectados com um gene codificando uma proteína de membrana marcada fluorescentemente. Usando um microscópio confocal, pequenas regiões da membrana foram então fotobleachadas, o que significa que os fluoroforos naquela área foram destruídos. Com o esquema de branqueamento utilizado aqui, a recuperação progressiva da fluorescência, ou FRAP, reflete o transporte de novas proteínas fluorescentes para a membrana plasmática. A taxa em que esse movimento ocorre pode ser quantificada e comparada em muitas condições experimentais.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à neurociência celular e molecular. Neste vídeo discutimos as descobertas históricas que fizeram da neurociência celular e molecular o campo que é hoje, algumas questões-chave no campo, e as técnicas usadas para respondê-las.

Como sempre, obrigado por assistir JoVE Science Education!