This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

NOTA: A escolha do material de partida folha e padronização das condições de crescimento da planta é fundamental uma vez que estes fatores podem afetar muito a qualidade, a variabilidade e rendimento da AWF (Figura 1). Os parâmetros a considerar são mostrados na Tabela 1 e são discutidos em mais pormenor na discussão. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parâmetro </td><td colspan="3"> Exemplo padronizações </td></tr><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris </td><td> Solanum lycopersicum </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> Tipo Folha </td><td> Primeiras folhas verdadeiras totalmente expandidas, saudável </td><td> 2 º e 3 º folhas a partir de baixo, 4 maiores folhetos tomadas folheto apical não utilizados para extração apoplast </td><td> Roseta folhas completamente expandidas </td></tr><tr><td> Idade da planta </td><td> 21 dias </td><td> 7-9 weeks </td&gt; <td> 7 semanas </td></tr><tr><td> Hora do dia </td><td> Médio do período de luz (12:00) </td><td> Médio do período de luz (12:00) </td><td> Médio do período de luz (12:00) </td></tr><tr><td> Hidratação </td><td> Todas as plantas bem regada 1 hr de pré-colheita </td><td> Todas as plantas bem regada 1 hr de pré-colheita </td><td> Todas as plantas bem regada 1 hr de pré-colheita </td></tr><tr><td> Luz </td><td> Luz 16 horas, 400 mmol m -2 s -1 </td><td> Luz 16 horas, 400 mmol m -2 s -1 </td><td> 10 h de luz (dia short) a partir da semana 2, 400 mol m -2 s -1 </td></tr><tr><td> Umidade </td><td> 70% </td><td> 70% </td><td> 70% </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 22 ° C luz, 18 ° C escuro </td><td> 22 ° C luz, 18 ° C escuro </td><td> 21 ° C </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Exemplos de parâme padronizadoters de folhas usadas em extrações AWF. 1. Generating apoplast lavar Fluid NOTA: Durante este materila perigosos protocolo inculding patógenos microbianos das folhas infectadas não devem ser lavados pelo ralo; procedimentos, em vez de descarte deve ser usado. <ol><li> Escolha aparelhos com base no tamanho da folha: <ol><li> Se infiltrar folhas menores (por exemplo, de Arabidopsis, feijão), utilizando uma seringa sem agulha. Use um frasco de vácuo para se infiltrar em folhas que são muito grandes para caber em uma seringa. Use o método de balão de vácuo para se infiltrar em várias folhas simultaneamente. </li><li> Divide folhas que são demasiado grandes para o método de infiltração disponível em secções mais pequenas utilizando uma lâmina de barbear. Seções foliares Lave bem cortadas em água destilada antes da infiltração para remover contaminantes citoplasmáticos que exalam a partir de células danificadas. </li></ol></li><li> Infiltração da folha usando uma seringa de 60 ml: <ol><li> Retire a folha a partir doplanta no pecíolo com uma lâmina de barbear. Para folhas compostas, tais como tomate, retire os folhetos no peciólulo. </li><li> Lavar a folha recém excisado por submersão em água destilada para remover os contaminantes da superfície da folha. Seque a folha borrando suavemente com papel absorvente ou papel. </li><li> Medir o peso das folhas antes de infiltração. </li><li> Enrole cuidadosamente e / ou dobrar a folha em uma seringa de 60 ml e encher a seringa com água destilada (outros fluidos de infiltração pode ser utilizada, ver discussão). Ejetar o ar dentro da seringa, baixando o êmbolo até aproximadamente à marca de 40 ml. </li><li> Cubra a ponta da seringa ou com um dedo de luva ou um pedaço de Parafilm, em seguida, criar uma pressão negativa no interior da seringa puxando o êmbolo para fora, para a marca de 60 ml. Solte lentamente o êmbolo. NOTA: libertando rapidamente a pressão pode resultar na lise celular e contaminação citoplasmática. </li><li> Desligue a ponta da seringa e ejetar o ar, então ligar a ponta e pressionemais para baixo sobre o êmbolo para criar uma quantidade modesta de pressão positiva. </li><li> Repita os passos 1.2.5 - 1.2.6 até que a folha está completamente infiltrado, como pode ser visto pela cor escurecida das áreas infiltradas. </li><li> Remover a folha a partir da seringa. Suave mas completamente apagar a folha com papel absorvente para remover o líquido da superfície. </li><li> Medir o peso da folha infiltrada. Calcula-se a diferença em peso antes e depois da infiltração, que se aproxima intimamente do volume infiltração. </li></ol></li><li> Infiltração Folha por balão de vácuo: <ol><li> Retire a folha da planta no pecíolo usando uma lâmina de barbear. </li><li> Lavar a folha recém excisado por submersão em água destilada para remover os contaminantes da superfície da folha. Seque a folha borrando suavemente com papel absorvente. </li><li> Medir o peso das folhas antes de infiltração. </li><li> Coloque a folha (ou folhas se infiltrando folhas múltiplas) em 250 ml de um lado maior ou co balão braçontaining água destilada (outros fluidos de infiltração pode ser usado, consulte Discussão). Totalmente cobrir as folhas com o líquido. </li><li> Aplicar um vácuo ao balão. Agite suavemente para soltar as bolhas de ar a partir das folhas. Cuidadosa e lentamente libertar o vácuo. NOTA: libertando rapidamente o vácuo pode resultar na lise celular e contaminação citoplasmática. </li><li> Repetir o passo 1.3.5, até a folha está completamente infiltrado, como pode ser visto pela cor escurecida das áreas infiltradas. </li><li> Remover a folha do balão. Suave mas completamente apagar a folha com papel absorvente para remover o líquido da superfície. </li><li> Medir o peso da folha infiltrada. Calcula-se a diferença em peso antes e depois da infiltração, que se aproxima intimamente do volume infiltração. </li></ol></li><li> Recuperação de AWF por centrifugação: <ol><li> Coloque a folha sobre um pedaço de 4 polegadas (10 cm) de largura Parafilm. Utilizando uma ponta de pipeta de 5 ml (ou um objeto de tamanho similar),arregaçar a folha dentro do Parafilm. </li><li> Insira a folha enrolado com ponteira em uma seringa de 20 ml. Posicione todas as bordas da folha de corte para cima. Insira a seringa em um tubo de polietileno ou policarbonato 50 ml limpo. </li><li> Centrifuga-se o interior do tubo de seringa durante 10 min a 1000 xg num rotor basculante a 4 ° C. NOTA: O exame visual das folhas seguintes centrifugação deve revelar que a maioria do fluido infiltração foi expulso. Escuras manchas verdes indicam que é necessário tempo de centrifugação adicional. </li><li> Pipeta a AWF recuperado em novos tubos de 1,5 ml. NOTA: O volume de AWF deve corresponder aproximadamente o volume de infiltração para que folha; se o volume é menor que o tempo de centrifugação adicional ou a velocidade de centrifugação é necessária. </li><li> Centrifuga-se as amostras a 15.000 xg AWF durante 5 min para eliminar quaisquer células ou partículas. Alternativamente, passam a AWF através de um filtro de 0,22 um para remove células e material particulado. </li><li> Pipeta-se o sobrenadante para um novo tubo. Manter as amostras em gelo até o armazenamento. </li><li> Armazenar as amostras AWF a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Ensaios para citoplasmática Contaminação <ol><li> Manter as amostras AWF em gelo para minimizar reacções enzimáticas (por exemplo, de proteólise) e realizar os ensaios imediatamente após os passos de centrifugação são completa. NOTA: Para os ensaios de metabolitos, as amostras podem ser congeladas imediatamente depois da extracção e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Para um malato desidrogenase standard (MDH) protocolo de ensaio ver 15; caso contrário, use um kit de ensaio MDH disponíveis comercialmente. </li><li> Para um padrão desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PDH) ver protocolo de ensaio 16; caso contrário, utilizar um kit de ensaio comercialmente disponível de G6PDH. </li><li> Para a quantificação dos metabolitos citoplasmáticos tais como glucose-6-fosfato (G-6-P) usar GC-MS tal como descrito no passo 5 </strong&gt;. Caso contrário, utilizar um kit disponível comercialmente para o ensaio directo de G-6-P. </li></ol> 3. Cálculo do Factor de Diluição apoplasto <ol><li> Preparar dois volumes do fluido de infiltração acima utilizado no passo 1.2.4 ou 1.3.4 (por exemplo, água destilada). Adicionar pó de carmim de indigo a uma solução a uma concentração final de 50 | iM, não acrescentam nada ao outro. </li><li> Medir a absorvância a 610 nm (OD 610) de 200 ul da solução de infiltração de carmim de indigo com um leitor de placas. Corrija esse valor, subtraindo o OD 610 de 200 ml de solução de infiltração sem indigocarmina. Substitua este valor corrigido como OD 610infiltrate na equação abaixo. </li><li> Realizar pelo menos três infiltrações folha replicado como acima (passo 1.2 ou 1.3), com ambas as soluções de infiltração (com e sem indigocarmina). </li><li> Após a infiltração, rinse as folhas em água destilada para remover qualquer remanescente de carmim de indigo presentes nas superfícies exteriores. </li><li> Prossiga com centrifugação como acima (passo 1.4). </li><li> Determine o OD média 610 de 200 mL da extrações AWF indigo carmim. Corrija esse valor, subtraindo o valor médio OD 610 de 200 mL de indigocarmina livre AWF. Substitua este valor corrigido como OD 610AWF na equação abaixo. </li><li> Calcular o fator de diluição (ou seja, dobrar diluição) a partir dos valores de absorção corrigidas como: Apoplast fator de diluição = OD 610infiltrate / (610infiltrate OD - OD 610AWF) </li><li> Concentração ou atividade Multiplique os valores de AWF pelo fator de diluição para estimar a concentração / atividade no fluido apoplástico in planta. </li></ol> 4. Concentração de AWF a força completa por liofilização <ol><li> Ligue o congelamento de cabelo e umGUARDE para estabilizar na temperatura e pressão de trabalho. </li><li> Piscina a quantidade desejada de amostras AWF frescos ou armazenados. </li><li> Distribua as amostras uniformemente entre dois tubos de centrífuga ml. </li><li> Determinar o volume de reconstituição: Volume de reconstituição = volume antes de fator de diluição de liofilização / apoplast </li><li> Com as tampas fechadas, congelar os tubos em azoto líquido. </li><li> Transferir os tubos congelados para uma ou mais refrigerados vasos de secagem por congelação. Durante a transferência dos tubos, recoloque a tampa com um que foi perfurado com um objeto pontiagudo para permitir a troca de gás. </li><li> Prenda os navios para o congelamento de cabelo e liofilizar as amostras completamente. </li><li> Retirar amostras da máquina e reconstituir o AWF por adição da quantidade calculada de água destilada. </li><li> Substituir a tampa não perfurada e armazenar as amostras a -80 ° C. </li></ol> 5. Metabolite Análise por cromatografia gasosa Mass Spectrometry 17 &lt;ol&gt; <li> Pipetar 200 l de AWF para um tubo de 1,5 ml </li><li> Adicionar 700 ul de metanol contendo 10 ug / ml ribitol como um padrão interno. </li><li> Aquece-se a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 11.000 x g. </li><li> Transferir 700 uL de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 375 mL de clorofórmio frio e vortex por 10 s. </li><li> Adicionar 500 uL de dH2O e vortex durante 10 seg. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 2200 x g. </li><li> Transferir 150 ul da camada aquosa superior num novo tubo de 1,5 mL, em seguida, secar as amostras completamente num concentrador de vácuo sem calor. </li><li> Dissolve-se as amostras em 30 uL de piridina contendo 20 mg / ml de cloridrato de metoxiamina. </li><li> Incubar a 70 ° C, agitando vigorosamente durante 2 hr. </li><li> Adicionar 50 ul de MSTFA (N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida). </li><li> Incubar a 37 ° C enquanto agitando durante 30 min. </li><li> Amostras de transferência da GC-MS compfrascos de vidro atible. </li><li> Realizar a análise de GC-MS das amostras. Consulte Lisec et al. 2009 17, para obter detalhes sobre GC-MS configuração e desempenho do equipamento. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Otimizando a fonte de tecidos de plantas A variação biológica e técnica pode ser grande ao realizar extracções apoplasto, assim, um fluxo de trabalho altamente padronizada é útil para aumentar a continuidade entre experiências (Figura 1). É importante notar que a fonte do tecido da planta tem de ser normalizado, incluindo o tipo de folha, a idade da folha, crescimento / condições ambientais e o tempo de dia (Tabela 1). Existem grandes diferenças na facilidade com que as diferentes folhas são infiltradas e o AWF subsequentemente recuperado por centrifugação; essas diferenças estão relacionadas com o número de estômatos, o tamanho da abertura e resistência mesophyll 12,14. Mesmo entre os diferentes cultivares de feijoeiro há grandes diferenças na facilidade e rendimento do processo de extracção AWF; por exemplo, as folhas da variedade Tendergreen usados ​​aqui são mais passíveis de extração AWF usando esse método do que a cultivar Maravilha canadense. DentroP. vulgaris as primeiras folhas verdadeiras são o maior e mais fácil de se infiltrar, tornando-as a escolha óbvia para extrações apoplásticas. O volume de ar e água apoplástico foi mostrado para variar com a idade da folha em várias espécies que conduzem a diferenças na AWF extractabilidade 12,14. Em P. vulgaris, folhas mais velhas tornam-se substancialmente mais difícil de se infiltrar e rendem menos AWF sob centrifugação; Por conseguinte, as folhas foram recolhidas quando atingiram plena expansão. As folhas que são difíceis de se infiltrar, subsequentemente, exigem velocidades mais elevadas de centrifugação para recuperar a AWF. Deve-se, portanto, cuidadosamente tela vários tipos de folhas diferentes e variedades antes de decidir sobre uma fonte de tecido para extrações AWF grande escala. Condições de crescimento das plantas também devem ser normalizados, tanto quanto possível, dentro do contexto do experimento. O uso de câmaras de crescimento é preferível, pois permitem que a umidade constante, temperatura e lighregimentos intensidade t de ser mantidas. A colheita de folhas devem sempre ocorrer na mesma altura do dia porque as concentrações de metabolitos, enzimas, etc., variam durante o ciclo diurno 14. Finalmente, para assegurar que a unidade deixa todos têm a pressão de turgescência semelhante, as plantas devem ser regadas logo antes (~ 1 hora) a colheita. Optimização da infiltração e centrifugação folha Citoplasmática contaminação indesejável da AWF devido à lise celular parcial resultará se a tensão mecânica encontrada pelas células é demasiado alta durante as etapas de infiltração ou centrifugação. Portanto, o procedimento para um determinado tipo de folha deve ser um trade-off entre a maximização do rendimento otimizado e minimizando a contaminação citoplasmática da AWF. Em todos os casos, deve usar-se a mais baixa velocidade de centrifugação a AWF que pode ser recuperada para evitar a possível ruptura mecânica das células da folha. Otimização do centrifugação velocidade deve ser determinada empiricamente para cada tipo de folha através da monitorização do volume recuperado e apoplasto contaminação ao longo de um intervalo de velocidades de centrifugação. Tem-se observado que as actividades da enzima marcador, tal como o MDH, G6PDH e isomerase de glucose-fosfato, permanecerá baixo até que uma força centrífuga limiar é ultrapassado, acima do qual estas actividades aumentar rapidamente, presumivelmente devido a fugas citoplasmática 9,12,14. A utilização de Parafilm para apoio durante o passo de centrifugação, como foi observado por Baker et al., 2012 11, pode melhorar a eficácia da extracção e podem AWF minimizar os danos mecânicos à lâmina foliar causada pela dobragem e compressão excessiva. Além disso, o uso de Parafilm melhora a visualização da folha após a centrifugação quando se deve examinar a folha de danos e completude da extração AWF. Nouchi 12 descrevem a otimização da recuperação AWF de seções de folhas de arroz corte, que são difficult para se infiltrar e exigem velocidades mais altas de centrifugação para recolher AWF por causa de suas pequenas aberturas estomáticas. Melhoria da molhagem da superfície da folha do arroz, quer por pré-embebição das folhas em água destilada ou a adição de um agente tensioactivo ao fluido de infiltração, facilitado o processo de infiltração. A velocidade de centrifugação superior (6.000 xg) também foi utilizado durante o monitoramento de contaminação apoplástico 12. Ao usar seções foliares corte há sempre o risco de que a contaminação citoplasmática será mais prevalente, mesmo com lavagem exaustiva dos locais das feridas; folhas cortadas deve, portanto, ser utilizado apenas quando necessário. Para muitos estudos água destilada é utilizada como fluido de infiltração 11. No entanto, os compostos podem ser adicionados ao fluido de infiltração, tal como sais ou tampões, para melhorar a extracção de certos compostos apoplásticas 13, especialmente proteínas. Lohaus 14 avaliaram o efeito da força iônica e osmótica on a composição da AWF recuperado e encontrou-os a ser insignificante. As alterações no pH do meio de infiltração, no entanto, pode afectar a composição AWF 14. Manuseamento e armazenagem do fluido apoplástico extraído é importante. AWF demonstrou conter uma grande quantidade de proteases e outras enzimas 13,20, bem como compostos orgânicos voláteis. Portanto, para reduzir a alteração da composição da AWF após a recuperação, recomenda-se manter as amostras em gelo ou de outro modo armazenado a -80 ° C. Além disso, ensaios enzimáticos de AWF deve ser realizada o mais rapidamente possível após a extracção para limitar a inactivação da enzima devido à proteólise, diluição prolongada ou congelar-descongelar. O processo de infiltração dilui o fluido apoplástico e é frequentemente necessário determinar a extensão desta diluição. A etapa de centrifugação também pode diluir a AWF com água de compartimentos intracelulares. Um fator de diluição é precisoed para estimar in vivo apoplast concentrações químicas quando as medições são feitas em AWF. Um fator de diluição também é necessário para concentrar AWF volta com força total quando ele está sendo usado como um apoplast imitando meio de crescimento para os micróbios - combinando, assim, das concentrações dos metabólitos vivo com a maior precisão possível. Diversas variações existir no método descrito no passo 4 para a determinação do factor de diluição AWF medindo a diluição de um composto marcador adicionado ao fluido de infiltração. Para todos os métodos de cálculo de diluição AWF assume que o fluido que a infiltração não é apreciavelmente absorvidas ou diluído por as células da folha durante o processo de recuperação AWF. Esta hipótese tem sido verificada anteriormente para a fase de infiltração 14, mas é não verificado para a etapa de centrifugação. O composto marcador também não deve ser absorvido, transportado ou modificado enquanto no apoplasto. Indigo carmim é o mais utilizado e testado completamente de corantes usadospara cálculos de diluição AWF. Indigocarmina exibe uma baixa absorção de resina de troca catiônica e paredes celulares isoladas e mostrou-se adequado para cálculos AWF em Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum e Glycine max 11,21,22. No entanto, em alguns tipos de folhas, por exemplo, arroz e pepino, indigocarmina parecia não estar totalmente recuperado após a infiltração, o que levaria a uma subestimação do factor de diluição AWF 12,21. A falta de recuperação de indigocarmina pode ser devido à sua susceptibilidade à clivagem em sulfonato de isatina de superóxido por 23, que é conhecido por ser produzido no apoplasto, especialmente sob tensão 24. A clivagem de indigotina em sulfonato de isatina irá resultar numa perda de absorvância a 610 nm e um aumento em 245 nm. Se esta reacção ocorre de forma apreciável no apoplasto, ou se esta reacção pode ser inibida pela adição de agentes de limpeza de superóxidos, infiltratfluido ion não foi investigado até o momento. Dextrano azul foi usado em vez de carmim de indigo para quantificação do factor de diluição AWF em arroz folhas 12, embora a sua estabilidade e de recuperação da AWF não foi relatada. Alternativamente, os compostos radiomarcados tais como [14 C] de sorbitol ou outros padrões internos quantificáveis ​​pode ser usado em vez de corantes e a diminuição da radioactividade ou concentração medida e usada para calcular o factor de diluição, de um modo análogo 11,14,25. Limitações da técnica Existem algumas ressalvas para o método de isolamento AWF infiltração-centrifugação. Em primeiro lugar, a diluição do apoplasto durante a infiltração pode provocar uma resposta a partir da planta. Se as células vizinhas folha detectar uma concentração diminuída para certos componentes do fluido apoplástico, eles podem responder excretando Outros metabolitos, distorcendo a interpretação de concentrações do metabolito. Emuma avaliação deste problema foi observado que nem o tempo entre a infiltração e centrifugação nem diferenças moderadas na força iónica do líquido infiltração afectou a composição do AWF extraída 14,22. Portanto, quaisquer artefatos decorrentes da diluição apoplast são pensados ​​para ser mínima. Uma segunda desvantagem é que o potencial de eluição de AWF por centrifugação não capturar todas as moléculas presentes no apoplasto por várias razões. Alguns compostos, em particular os catiões e as proteínas podem ser firmemente associada com a parede celular carregada negativamente e não eluir com a AWF 13. Outras moléculas, tais como as proteínas podem ser muito grandes para eluir eficientemente para fora do apoplasto para as velocidades de centrifugação utilizados 14. Espécies reactivas de oxigénio são uma importante classe de composto produzido no apoplasto, mas, devido à natureza de curta duração destes compostos, e não especificadas requisitos para a sua produção, sua presence não é bem capturado por extracção AWF. Não se sabe como AWF representa com precisão a composição in vivo do fluido apoplasto e pode variar entre espécies. Existem vários ensaios para determinar a contaminação citoplasmática, embora nenhum são universalmente aceites. Ensaios de enzimas predominantemente citoplasmáticos (por exemplo, G6PDH, fosfato isomerase hexose, MDH) tem a vantagem de ser de fácil execução, mas pode não se correlacionam bem com vazamento citoplasmática 14,18. A avaliação dos metabólitos citoplasmáticos (por exemplo, fosfatos de hexoses, clorofila) é talvez mais indicativa, mas não está tão bem estabelecida 11. No entanto, um ou outro tipo de ensaio pode ser útil para a quantificação relativa de contaminação apoplástico entre amostras. Idealmente, várias medições independentes devem ser utilizados para validar a integridade da amostra AWF. Embora reconhecendo as suas limitações, a infiltração-centrifugatina técnica descrita aqui permanece uma técnica simples e robusta no estudo de proteínas apoplásticas, metabólitos primários e secundários e iões inorgânicos.

<html> O apoplasto planta é o espaço intercelular, que circunda as células vegetais. Este é um ambiente dinâmico em que muitos processos metabólicos e de transporte ter lugar. O principal componente estrutural do apoplasto é a parede celular, que é montado e modificado por enzimas, proteínas estruturais e metabolitos localizados dentro do apoplasto. Nas células vegetais saudáveis ​​apoplasto é geralmente mantida em um estado de acidez permitindo aminoácidos, açúcares e outros nutrientes a ser importado a partir do apoplasto para o citoplasma por H + symport 1. Durante o transporte de sacarose, move-se a partir de fontes de sacarose através do apoplasto fotossintéticas e na vasculatura floema; sacarose é, então, transportado por um potencial osmótico mantido por invertases apoplásticas clivagem sacarose nos órgãos pia 2. Açúcares e outros nutrientes pode também ser transportada para cima e acumulam-se em cavidades estomática transpiração através da corrente 3. &quot;&gt; O apoplast também representa um nicho ecológico onde muitos patógenos estabelecer seu estilo de vida parasitária. Fitopatógenos bacterianas têm a capacidade de se multiplicar para altas densidades no apoplasto, o que eles acessam através de aberturas naturais, como estômatos ou através de feridas 4. A concentração de amino ácidos e outros compostos nitrogenados em tomate apoplast foram mostrados para ser suficiente para suportar as necessidades nutricionais de bactérias e fungos patogénicos 5,6. respostas de defesa primárias, para patógenos microbianos também ocorrem no apoplasto, ou seja, a produção de espécies reativas de oxigênio por peroxidases extracelulares . e oxidases e o fortalecimento da parede celular através de cross-linking e calejado deposição 7 A parede celular da planta é rica em metabólitos secundários com atividades anti-microbianas, a natureza bioquímica destes metabólitos secundários varia entre as espécies 8. Como resultado do acima-mençãoed e outros processos, folha fluido apoplástico contém uma variedade de proteínas, açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabolitos secundários, metais e outros catiões (por exemplo, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). As concentrações de soluto no apoplasto dos ramos são amplamente controlada pelo equilíbrio dos processos de transporte que ocorrem entre o apoplasto e o xilema, floema e citoplasma 9. No entanto, as reações metabólicas e crescimento microbiano também consumir ou produzir solutos apoplásticas. A composição da apoplast é conhecido por ser diferente entre as espécies de plantas e de genótipos e em resposta às mudanças nas condições ambientais, incluindo a luz, nutrição e estresses bióticos e abióticos 9. Ao estudar a composição do apoplasto e como ela muda, incluindo propriedades, tais como redox e potencial osmótico, pH, nutrientes / metabolito disponibilidade e actividades enzimáticas, pode-se obter novas perspectivas sobre as plantas como rerespondem ao seu meio ambiente. Compreensão ou caracterizar as alterações moleculares que ocorrem na solução apoplasto é complicado porque é um compartimento espacialmente estruturado e dinâmico em que os metabolitos e / ou iões podem ser voláteis, transiente ou associada com a parede celular e membrana de plasma. Além disso, são necessárias diversas técnicas analíticas para cobrir a gama de diferentes tipos de produtos químicos. Para estudar a composição do apoplasto solúvel, o fluido geralmente precisa ser extraído do tecido. Existem vários métodos para extrair apoplasto fluido a partir de vários tecidos, incluindo um novo método proposto tira de filtro 10, mas o método de extracção de folhas mais aceite para a infiltração-centrifugação. Esta técnica tem sido avaliado previamente 11-13 e Lohaus et al. 2001 14 fornecer uma análise aprofundada de muitos dos parâmetros técnicos do método. Como o próprio nome, a infiltração-centrifugação técnica é um método de dois passos que envolve essencialmente a substituição do espaço de ar apoplástico com uma infiltração de fluido aquoso, que se mistura com o fluido apoplástico nativa, seguido por recuperação da infiltração / mistura fluida apoplástico por centrifugação suave das folhas. À medida que o fluido recuperado é diluída e não contém todos os compostos presentes no apoplasto (ver abaixo), este fluido é geralmente conhecido como apoplasto fluido de lavagem (FA), ou líquido de lavagem, por vezes intercelular, em vez de fluido apoplástico. A técnica de infiltração-centrifugação é facilmente escaláveis ​​que permite que amostras individuais ou agrupados AWF de volume adequado para ser gerado e submetido a uma ampla gama de técnicas bioquímicas e análise a jusante (por exemplo, electroforese de proteínas, medição da actividade enzimática, RMN, diversos tipos de cromatografia e de massa espectrometria). Folha AWF também é útil como um meio de crescimento que imita apoplasto para estudar a interacção de planta colonizar micróbios with seu ambiente 5. Nos seguintes protocolos que descrevem como executar a técnica de infiltração-centrifugação usando Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen folhas, e fornecer alguns exemplos de análises a jusante com foco em metabolômica. É importante ressaltar que os métodos para avaliar a qualidade da AWF são fornecidos junto com o conselho para otimizar o procedimento para os diferentes tipos de folhas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:291px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Eppendorf Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:291px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:139px;">22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">razor blade</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>12-640&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">60 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">20 ml syringe</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">300613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">4 inch parafilm</td>
			<td style="width:291px;">Bemis</td>
			<td style="width:139px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">side arm flask</td>
			<td>SciLabware</td>
			<td>12972831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum source</td>
			<td style="width:291px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">5 ml pipette tips</td>
			<td style="width:291px;">Fisher</td>
			<td>50-813-28&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:309px;">centrifuge</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:291px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">indigo carmine</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">I8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microplate reader</td>
			<td style="width:291px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;">Infinite 200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">96 well plates</td>
			<td style="width:291px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">freeze dryer</td>
			<td style="width:291px;">SciQuip</td>
			<td style="width:139px;">Christ Alpha 2-4 LD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">microcentrifuge</td>
			<td style="width:291px;">biorad</td>
			<td>166-0612EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">oxaloacetic acid</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">D-glucose-6-phosphate</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>G7250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">NADH</td>
			<td style="width:291px;">Roche</td>
			<td>10128023001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">MDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K654-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G6PDH assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td>MAK015-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">G-6-P assay kit</td>
			<td style="width:291px;">Biovision</td>
			<td>K657-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">ribitol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">A5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methanol</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">chloroform</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">472476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">vacuum concentrator</td>
			<td style="width:291px;">Thermor Scientific</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">methoxyamine hydrochloride</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">226904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide</td>
			<td style="width:291px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">394866</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example

O apoplasto é um compartimento extracelular distintos em tecidos de plantas, que se situa do lado de fora da membrana do plasma e inclui a parede da célula. O compartimento apoplástico das folhas da planta é o local de diversos processos biológicos importantes, incluindo a formação da parede celular, nutriente celular e absorção de água e de exportação, as interações planta-endofíticos e respostas de defesa para patógenos. O método de infiltração-centrifugação está bem estabelecida como uma técnica robusta para a análise da composição apoplasto solúvel de várias espécies de plantas. O fluido obtido por este método é comumente conhecido como fluido de lavagem apoplasto (FA). O protocolo a seguir descreve um método de infiltração a vácuo e centrifugação otimizado para extração de Phaseolus vulgaris AWF (Feijão) cv. Tendergreen folhas. São discutidas as limitações deste método e a otimização do protocolo para outras espécies de plantas. Recuperado AWF pode ser utilizado numa vasta gama de experimen jusantets que buscam caracterizar a composição do apoplast e como ela varia em resposta às espécies de plantas e genótipo, o desenvolvimento da planta e das condições ambientais, ou para determinar como os microrganismos crescem em apoplast fluido e responder às mudanças em sua composição.

Os resultados típicos para extracções realizadas em AWF healthy 3 semanas de idade de P. vulgaris cv. Tendergreen folhas, utilizando água destilada como fluido de infiltração estão apresentados na Tabela 2. Jovem P. vulgaris folhas são passíveis de infiltração, e a velocidade de centrifugação utilizado aqui (1000 xg) a remoção da maioria de infiltração de fluido por centrifugação pode ser visto directamente que as folhas de reverter para a sua cor original verde. P. vulgaris folha de matéria fresca foi em média de 1,1 xg antes da infiltração e rendeu 0,5 ml de AWF por grama de peso fresco. A concentração de proteína da AWF foi determinada como sendo de 0,18 ± 0,08 mg / ml usando um ensaio de proteína de Bradford padrão. O fator de diluição para estas folhas, calculado através da medição de diluição indigo carmim, foi de 2,3 ± 0,3 vezes. Os valores acima podem variar substancialmente entre as espécies e experiências-piloto são necessários para determinar o rendimento de AWF por grama de folha fresca nósight, bem como a concentração de proteína AWF e factor de diluição que pode ser esperado para um dado tipo de folha. Danos para a integridade das células pode ocorrer tanto durante a fase de infiltração, se as alterações na pressão são demasiado rápida, e durante o passo de centrifugação, se a força centrífuga é demasiado elevada. Por conseguinte, é necessário utilizar amostras AWF para marcadores de contaminação citoplasmática; idealmente, múltiplos ensaios independentes são realizados. Aqui, os resultados de três ensaios possíveis são relatados na Tabela 2. Na extracções correctamente realizados de P. vulgaris AWF, G6PDH foi indetectável por um ensaio enzima padrão. Isto é consistente com outros relatórios onde a atividade G6PDH torna-se detectável apenas acima de um limite a força centrífuga 12. Em contraste, um nível basal de actividade de desidrogenase de malato (2,5 U / ml) foi detectável em todos P. amostras vulgaris AWF utilizando um ensaio metabólico padrão. O aumento da centrífuga parace acima de um limite de 1.000 xg resultou em aumento das actividades de MDH (resultados não mostrados). Como o apoplasto partir de outras espécies é conhecido por conter actividade endógena MDH 18, a quantidade detectada aqui é considerada verdadeira actividade apoplástico e aumentos significativos acima deste nível de linha de base são indicativos de contaminação. Os metabolitos que se acredita serem predominantemente citoplasmática, tal como hexose-6-fosfato, também podem ser utilizados para avaliar a contaminação de AWF. Aqui, a análise de GC-MS detectado zero ou traço níveis de G-6-P em extrações AWF. Em contrapartida, nas secções de raiz de milho corte, G-6-P foi detectada após a extracção AWF em todas as velocidades de centrifugação e aumento na concentração a velocidades mais elevadas, indicando contaminação citoplasmática 10. Análise de metabolitos por GC-MS de P. vulgaris folha AWF produz tipicamente 40-60 metabolitos identificáveis ​​e um número aproximadamente igual de compostos não identificáveis ​​(Figura 2). Ougânica ácidos, açúcares simples, e aminoácidos representam a maior parte dos metabolitos identificáveis, no entanto, os metabólitos secundários de plantas também foram detectados e quantificados a partir AWF 11. Vários exemplos de picos destas classes de moléculas diferentes são marcados na Figura 2 Outras técnicas analíticas a jusante são aplicáveis ​​para estas amostras AWF para quantificar várias moléculas, por exemplo:. ICP-MS, RMN, HPLC, espectroscopia de absorção atómica, espectrometria de massa de proteína. O componente proteico do apoplasto é também representada na AWF como mostrado na Brilliant Blue gel corado com Coomassie de SDS-PAGE na Figura 3. Entre outras funções, as enzimas apoplásticas são responsáveis ​​pela síntese da parede celular e a criação de extracelular reactiva espécies de oxigênio. Estudos de proteómica AWF de várias espécies identificadas dezenas de proteínas individuais e mostraram que o componente proteico do apoplasto responde a Enviroestresse nmental 13,19. Idealmente extrato AWF deve estar livre de contaminação por proteínas citoplasmáticas como Rubisco; no entanto, na prática isso é difícil de alcançar. A presença de uma banda de proteína de Rubisco em ~ 53 kDa por SDS-PAGE a seguir proporciona um outro ensaio qualitativo para a integridade de amostras AWF. Por exemplo, a amostra carregada na pista 2 na Figura 3 contém uma maior quantidade de contaminação de Rubisco de que a pista 1. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Phaseolus vulgaris AWF </td></tr><tr><td> Volume de AWF (ml g -1 folha FW) </td><td> 0,49 ± 0,09 </td></tr><tr><td> Conc proteína. (Mg ml-1) </td><td> 0,18 ± 0,08 </td></tr><tr><td> Factor de diluição </td><td> 2,3 ± 0,3 </td></tr><tr><td> Actividade de G6PDH (U ml-1) </td><td&gt; Não detectada </td></tr><tr><td> Glc-6-P (mg ml-1) </td><td> não detectada </td></tr><tr><td> MDH actividade (U ml-1) </td><td> 2,5 ± 0,9 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Os resultados típicos para extrações AWF de P. vulgaris cv. Tendergreen folhas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig1highres.jpg" /> Figura 1. fluxo de trabalho de extração apoplast padrão. Os números referem-se passos no protocolo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig2highres.jpg" /> Figura 2. Um exemplo GC-MS cromatograma da P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Os picos exemplo metabolito numerados são os seguintes: 1-malonato, 2-fosfato, succinato de 3, 4-desconhecido, 5-malato, 6-asparagina, 7-ribitol (r internoAndard), 8-citrato, 9-glucose, 10-inositol, ácido cafeico-11, 12-sacarose. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52113/52113fig3highres.jpg" width="250" /> Figura 3. Um exemplo de SDS-PAGE corado com Coomassie de gel de P. Vulgaris extractos de folha AWF. Este gel proporciona uma comparação entre os componentes da proteína de duas extracções AWF que diferem na quantidade de contaminação citoplasmática abundante pela enzima plastidial de Rubisco. Após a extracção AWF ambas as amostras foram submetidas a precipitação da proteína de acetona em um excesso de 4 vezes (v / v) de acetona fria e ressolubilizado em água a um décimo do volume original. As pistas 1 e 2 contêm 40 ug de proteína. A banda correspondente à cadeia de Rubisco grande (~ 53 kDa) está indicada por uma seta. R M: marcadores de peso molecular de proteínas.

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The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como exemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

the-infiltration-centrifugation-technique-for-extraction-apoplastic

Research

JoVE Journal

Biology

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

36.6K visualizações.  University of Oxford. This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Vídeo: The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Biologia

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Teste de tolerância à nicotina em Aphids Usando uma experiência Dieta Artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid peptide (A&#946;) and intraneuronal accumulation of hyperphosphorylated tau protein. Because cerebrospinal fluid (CSF) is in direct contact with the extracellular space of the brain, it provides a reflection of the biochemical changes in the brain in response to pathological processes. CSF from AD patients shows a decrease in the 42 amino-acid form of A&#946; (A&#946;42), and increases in total tau and hyperphosphorylated tau, though the mechanisms responsible for these changes are still not fully understood. Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for CSF sampling from the mouse. This extremely gentle sampling technique allows serial CSF samples to be obtained from the same mouse at 2-3 month intervals which greatly minimizes the confounding effect of between-mouse variability in A&#946; or tau levels, making it possible to detect subtle alterations over time. In combination with A&#946; and tau ELISA, this technique will be useful for studies designed to investigate the relationship between the levels of CSF A&#946;42 and tau, and their metabolism in the brain in AD mouse models. Studies in Tg mice could provide important validation as to the potential of CSF A&#946; or tau levels to be used as biological markers for monitoring disease progression, and to monitor the effect of therapeutic interventions. As the mice can be sacrificed and the brains can be examined for biochemical or histological changes, the mechanisms underlying the CSF changes can be better assessed. These data are likely to be informative for interpretation of human AD CSF changes.

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse

Transgenic (Tg) mouse models of AD provide an excellent opportunity to investigate how and why A&#946; or tau levels in CSF change as the disease progresses in human patients. Here, we demonstrate a refined cisterna magna puncture technique for serial CSF sampling from the mouse.

A técnica de coleta de líquido cefalorraquidiano Serial da Cisterna Magna em rato

Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease that is pathologically characterized by extracellular deposition of &#946;-amyloid ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Mecanismos Herbívoro caracterizando Resistance: Spittlebugs em Brachiaria Spp. como Exemplo

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. These structures are almost always localized on plant surfaces. Among them are nectaries or glandular trichomes. The secreted compounds are often employed in interactions with the biotic environment, for example as attractants for pollinators or deterrents against herbivores.
Glands that are unique in several aspects can be found in carnivorous plants. In so-called pitcher plants of the genus Nepenthes, bifunctional glands inside the pitfall-trap on the one hand secrete the digestive fluid, including all enzymes necessary for prey digestion, and on the other hand take-up the released nutrients. Thus, these glands represent an ideal, specialized tissue predestinated to study the underlying molecular, biochemical, and physiological mechanisms of protein secretion and nutrient uptake in plants. Moreover, generally the biosynthesis of secondary compounds produced by many plants equipped with glandular structures could be investigated directly in glands.
In order to work on such specialized structures, they need to be isolated efficiently, fast, metabolically active, and without contamination with other tissues. Therefore, a mechanical micropreparation technique was developed and applied for studies on Nepenthes digestion fluid. Here, a protocol is presented that was used to successfully prepare single bifunctional glands from Nepenthes traps, based on a mechanized microsampling platform. The glands could be isolated and directly used further for gene expression analysis by PCR techniques after preparation of RNA.

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Plants glands are specialized structures responsible for the biosynthesis and secretion of many compounds involved in interactions with the biotic environment. To enable studies on their molecular and biochemical features, a mechanical micropreparation technique was established in order to isolate single metabolically active glands, here from the carnivorous plant Nepenthes.

Isolamento de Viável multicelular Glândulas de tecido da planta carnívora, Nepenthes</i

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedimento para avaliar a eficiência de floculantes para a Remoção de partículas dispersas de extractos de plantas

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...