Este trabalho foi financiado por doações do Fundo Nacional Belga para fi Scienti c Research (FNRS), o Interuniversitário atração poloneses Programa-belga política científica e os &quot;Communauté Française de Belgique-ações de Recherches Concertées&quot; a FC, a partir do Israel Science Foundation Jerusalém ( ISF) para MM (Grant # 1311-1312) e NM (Grant # 1312-1312).

1 Preparação das Soluções <ol><li> Prepare isotónica (600 mOsm) e hipotónico (500 mOsm) soluções contendo 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, e 8 H 2 (N-morfolino) Ácido -etanossulfónico (MES), pH 5,7 e ajustar a osmolaridade com as quantidades apropriadas de D-sorbitol: 540 mm para o isotônico e 440 mm para a solução hipotônica. Verificar a osmolaridade da solução (dentro de 3% do valor alvo), utilizando um osmómetro. </li><li> Prepara-se uma pasta seca de &#39;mistura enzimática &quot;contendo as enzimas seguintes: 0,55 g de celulase, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polivinilpirrolidona K 30, 0,33 g de BSA (ver Tabela 1 abaixo), a mistura de pó seco por vórtice, fazer alíquotas de 5,7 mg e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2 Isolamento de protoplastos de Arabidopsis mesófilo <ol><li> Prepara-se uma placa de Petri (10 cm) com cerca de 6 gotas (aproximadamente. 30 ul cada) de solução isotónica. </li><li> Descasque as abaxial epiderme (inferior) de folhas de Arabidopsis, cut a folha desenrolada em quadrados de cerca de 4 x 4 mm 2, em seguida, coloque os quadrados sobre a solução isotônica cai com o lado abaxial exposta para baixo, tocando a solução. </li><li> Dissolve-se 5,7 mg da mistura de enzima em 165 ul solução isotónica (3,3% w / w) em um tubo de 1,5 mL, misturar suavemente por pipetagem de um minuto ou então até se dissolver, e colocar várias gotas semelhantes da solução enzimática na mesma Petri prato. </li><li> Transferir os pedaços de folhas para a solução enzimática gotas, fechar o prato de vedação com a tampa rodada de um parafilme e incubar durante 20 min, o prato flutuante em um banho de água regulado para 28 ° C. </li><li> Adicionar algumas gotas de mais a solução isotónica com o prato (2 gotas por cada gota solução de enzima). Transferir cada pedaço de folha de uma nova gota solução isotónica e, em seguida, sequencialmente, a um segundo ponto (para lavar a solução enzimática de distância). Levante a peça pelas bordas usando uma pinça, agite-o na segunda queda (como um saquinho de chá) para liberar os protoplastos.Recolher as gotas com os protoplastos (usando uma pipeta de ponta de 100 ul cortado) para um tubo de 1,5 ml. </li></ol> 3. O hipotônico Desafio Ensaio: Inchaço celular Arabidopsis mesofilo <ol><li> Prepare o sistema de perfusão (Figura 1A), enchendo uma coluna com a solução isotónica e outra coluna com a solução hipotónica. Abra a válvula, deixe algum fluxo de solução (primeiro a hipotônica, em seguida, o isotônico) para encher o tubo todo o caminho para o colector de admissão (Figura 1B). Verifique se não há bolhas de ar, e em seguida, fechar a válvula. </li><li> Selar uma lamela, utilizando massa de silicone (Tabela 1), para fazer uma parte inferior para a câmara no interior da corrediça de plexiglass (Figura 1B, ver também o esquema da câmara na Figura 1C). Para fazer com que a parte inferior da câmara (a superfície voltada para cima da lamela exposto dentro do anel de gordura) &quot;pegajoso&quot; para protoplastos, revesti-la-com carga positiva-rolamento de sulfato de protamina (1% em água; Tabela 1) ou poli-L-lisina (0,1% em água, Tabela 1). Espalhe esta &quot;cola&quot; sobre a lamela utilizando uma ponteira, esperar por 1-2 min, lavar 3-4 vezes com a solução isotônica e sacudir para longe a solução restante. </li><li> Encher a câmara com a solução isotónica. Em seguida, adicione uma gota de protoplastos contendo solução para a câmara, usando uma ponteira cortado e esperar 3-4 minutos para os protoplastos para resolver. Cubra a câmara com uma tampa transparente (Figuras 1D, 1E) tocar a superfície da solução (evitar bolhas de interceptação abaixo). </li><li> Coloque o slide (suavemente!) Em uma mesa de microscópio invertido, conectá-lo ao sistema de perfusão ea bomba (proteção contra bolhas de ar na tubulação!) E ligar o fluxo de solução isotônica para perfusão constante de 1 mL / min (taxas mais rápidas pode ser utilizado, até 4 ml / min). </li><li> Para a gravaçãoas mudanças de volume, um microscópio invertido é usado, com um objectivo de 20X e com uma câmara de vídeo CCD ligada a um computador PC. Use o plugin &#39;CMU 1394 Camera Driver&#39; do software ImageJ (veja a tabela de materiais específicos para os endereços de download destes dois pedaços de software) para gravar um filme de vídeo de 60 segundos de protoplastos imóveis selecionados (presumivelmente, aqueles que estão presos ao fundo) a uma taxa de uma imagem / segundo (1 Hz). Iniciar a gravação com uma lavagem de 15 seg de a solução isotónica (isto constitui a linha de base), para comutar a uma solução hipotónica para 45 segundos (para completar um total de 60 segundos a partir do início da perfusão). Salve o filme em formato TIF. NOTA: Escolha um campo de visão com o maior número de células possível, cumprindo os seguintes critérios: esféricas e com um contorno de células bem focada em seu maior perímetro (Figura 2A). </li></ol> 4. análise do volume celular mudar usando ImageJ NOTA: Para analisar asérie de imagens de uma célula inchaço, use o campo &#39;Imagem Explorer&#39; e &#39;plugins protoplastos Analyzer&#39; no software ImageJ (escrito por Xavier Draye) 14. Começando com os protoplastos escolhidos em seu primeiro ponto de tempo, o plug-in &#39;protoplastos Analyzer&#39; irá detectar automaticamente as bordas protoplastos (contornos) e calcular a evolução temporal de suas áreas durante o experimento (os plugins estão disponíveis com o programa de análise de PfFit, abaixo) . <ol><li> Comece ImageJ. Para abrir o filme, clique em &quot;Arquivo&quot; no painel de ImageJ, então, consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: &#39;Importar&#39; então &#39;Imagem Explorer&#39;. Realce o filme escolhido, em seguida, clique com o botão direito sobre ele, então clique em &quot;protoplastos Analyzer &#39;. Percorra o filme (usando um controle deslizante na parte inferior da imagem de protoplastos) para identificar protoplastos que permanecem em grande parte imóveis durante o experimento - estes serão analisados. De volta à primeira image, usando o mouse, desenhe círculos (escolhidos a partir das ferramentas de desenho ImageJ) em torno dos protoplastos selecionados (Figura 2B) e clique em &#39;OK&#39; na tabela de &quot;Parâmetros de detecção&quot; que apareceram. </li><li> Para iniciar o algoritmo de detecção de protoplastos, clique em &#39;Local&#39; na imagem do painel superior protoplastos, em seguida, &quot;processo&quot; no menu suspenso. Examine os círculos verdes em torno das protoplastos selecionados (Figura 2C) durante todo o filme. Salve o &#39;resultado&#39; em um arquivo do Excel. Saia do ImageJ. NOTA: No caso de um ponto vermelho aparece (para indicar um mau contorno apto - geralmente devido a um pobre contraste da imagem), execute novamente com parâmetros diferentes. </li><li> Para separar as linhas pertencentes a cada célula (que - se duas ou mais células foram analisadas simultaneamente - serão interligados, porque a análise é feita quadro a quadro), em Excel, classificar os dados salvos pela coluna número de células (&#39;objeto&#39; ). </li><li> Para Determine o fator de conversão pixel-a-mm para obter o valor real de P f, tirar uma imagem de uma régua micrométrica via o mesmo objetivo 20X microscópio. Arraste uma linha (escolhidos entre as ferramentas de desenho ImageJ) a imagem régua ao longo e ler o número de pixels equivalente ao comprimento da régua na parte inferior do painel principal do ImageJ. Converta os valores de área de pixel arbitrários no arquivo Excel em mM 2. Salve o curso áreas hora (para cada célula separadamente) como um arquivo de texto (duas colunas de números únicos). NOTA: Esta será uma entrada para o programa &#39;PfFit&#39; de ajuste de volume. </li></ol> 5 Modelagem da Taxa de osmolaridade Mudança na Câmara Experimental Usando ImageJ eo f Fit Matlab Programa P <ol><li> Adicionar 2 mg de xilenocianol (Tabela 1, abaixo) a 100 ml de solução isotónica (para produzir o &#39;Indicador Dye&#39;). </li><li> Prepare o sistema de perfusão (como em 3.1) com o Indicador Dye eo h não tingidosolução ypotonic. </li><li> Selar a lamela utilizando graxa de silicone para o fundo da câmara de acrílico, em seguida, preencher com cuidado a câmara com o Indicador Dye, cobri-lo com uma lamela (como acontece com os protoplastos antes) e colocá-lo no palco microscópio. </li><li> Ligue a câmara para o sistema de perfusão e a bomba, e ligar o corante indicador de fluxo para uma perfusão constante em l ml / min. </li><li> Gravar um filme de 60 segundos, à taxa de 1 Hz. Inicie a gravação com 15 segundos de Indicador Dye, mudar para a solução hipotônica para 45 seg. Parar de filmar. Lave com o Indicador Dye (pelo menos durante 30 segundos), em seguida, começar um novo filme. Repita cerca de 5-6 vezes e salvar todos os filmes </li><li> Use o software ImageJ para analisar as imagens de vídeo da transmitância Indicador Dye para obter um curso da mudança transmitância tempo em média. <ol><li> Comece ImageJ, clique em &quot;Arquivo&quot; e, em seguida, &quot;Open&quot;, e navegar para o filme. Para cada filme, desenhar a 10 pixels de largura verticaisretângulo em qualquer lugar na 1 ª imagem do filme. Clique em &#39;Imagem&#39; no painel principal do ImageJ, clique em &#39;Cortar&#39; no menu suspenso. </li><li> Para alinhar os 60 quadros (do filme de 60 segundos) em uma linha, clique novamente &#39;Imagem&#39;, em seguida, clique consecutivamente nos menus suspensos enquanto eles se desenrolam: &#39;Pilhas&#39; e &#39;Fazer Montagem &quot;(colunas 60, linhas 1). Desenhe um 1 pixel alta retângulo horizontal em qualquer lugar ao longo de toda a linha de imagens e clique em &quot;Analisar&quot; no painel principal do ImageJ, em seguida, clique em &quot;perfil enredo&quot; no menu suspenso. NOTA: A &#39;Lote de Montagem de&#39; janela aparecerá (não mostrado), e uma lista de dados de transmitância pode ser aberta a partir do seu menu. Cada imagem do filme é representado nesta lista de 10 valores de transmitância originadas na sua 10 pixels de largura retângulo e, conseqüentemente, a &quot;base de tempo&quot; (o número seqüencial de imagem) é 10 vezes mais. </li><li> Copie as listas da dat transmitânciaum (uma lista por vídeo) para um arquivo Excel. Calcular a média dos cursos de tempo de transmitância obtidas a partir dos vários filmes dos resplendores Indicador Dye. Gerar uma base de tempo real através da multiplicação do número sequencial de imagem por 0,1. Salve o curso de tempo média (duas colunas) para um arquivo de texto. NOTA: Antes de média, se desejar, traçar os períodos individuais, para rejeitar quaisquer irregularidades. Certifique-se de que o filme inclui, pelo menos, 5 segundos finais de transmitância em estado estacionário do corante indicador. </li></ol></li><li> Inicie o programa de encaixe P f Fit Matlab (painel de &#39;Indicador Fit &quot;, Figura 3) para calcular os vários parâmetros do curso de tempo da osmolaridade. NOTA: com base nas concentrações iniciais e finais conhecidos da solução no banho, o curso do tempo da concentração osmótica mudança da solução é calculada a partir do curso de tempo de concentração (calculado, por sua vez, a partir do indicador de transmitância tintura), supondo que ele segue a mesma dinâmica como aconcentração de corante. P f Fit é um programa disponível para uso gratuito. O &#39;PfFit_Installer_web.exe&#39; pode ser baixado a partir de: P f Guia Fit Usuário &#39;com explicações e definições é acessível através de Jove como um arquivo suplementar, que ajuda a familiarizar o usuário com a P f programa Fit. </li><li> No painel &#39;Indicador Fit&#39;, importe os dados do curso o tempo médio do transmitância Indicador Dye (&quot;arquivo de dados Indicador &#39;, Figura 3A) e inserir manualmente os parâmetros da experiência atuais e as estimativas iniciais dos parâmetros&quot; width &quot;e&quot; t_half &#39;descreve a evolução temporal da concentração Indicador Dye (Figura 3B. Clique em &quot;Executar&quot; para ver as parcelas dos cursos de tempo da concentração Indicador Dye (dados reais e em forma, Figura 4A), e do calculado banho modelado () osmolaridade (Figura 4B). NOTA: agood ajuste aos dados é essencial (uma recomendação: comece com os valores mostrados na Figura 3). </li></ol> 6 Determinar o f P usando o Matlab programa de adaptação P f Fit NOTA: Além dos pressupostos básicos com relação ao comportamento de um protoplasto como um verdadeiro e perfeito osmï¿½etro 11, a determinação do P f repousa na presunção de que P f pode mudar com o tempo, que essa dinâmica de P f subjacente ao tempo Claro que a variação de volume da célula e que três parâmetros são suficientes para descrever: fi P (o valor inicial de P f), Pista Pf (a taxa de variação linear de P f) e de retardo (o período desde o início do banho mudança osmolaridade até o início da alteração do volume da célula). Diferentes modelos podem ser testados, incluindo diferentes combinações desses parâmetros e seus valores, incluindo valores nulos 11. P <sub&gt; f Fit procura a melhor combinação destes parâmetros para se obter - pelo cálculo - a reprodução mais fiel do curso da variação de volume da célula 11, o tempo calculado experimental, por sua vez, a partir da série de áreas de células importado-contorno (ver também o Suplementar &#39;P f Guia Fit Usuário &quot;). <ol><li> Mude para o &#39;Volume Fit&#39; painel (Figura 5). Escolha para a importação do arquivo de dados de áreas (o arquivo de texto com o curso do tempo das &quot;áreas&quot; dos protoplastos analisados, Figura 5A). Escolha &#39;Last Indicador de montagem&#39; como fonte de parâmetros (Figura 5B, ver o &#39;P f Guia Fit Usuário&#39; de alternativas). NOTA: Estes parâmetros (Figura 5D) são então usadas para regenerar a mudança osmótico no banho para os volumes correspondentes ao procedimento. </li><li> No painel &#39;Volume Fit&#39; (Figura 5C), inicializar (preencher as estimativas iniciais para os parâmetros F) P: P f, Slope Pf e Delay (uma recomendação: começar com 1, 1, e 30, respectivamente), escolheu a modelo &#39;Class&#39; (uma recomendação: começar com II e marca &#39;cheques&#39; para todos os três parâmetros a serem instaladas). Clique em &quot;Executar&quot; e, em seguida globo ocular a figura provisória (Figura 5E) e ajuste o parâmetro Delay eo comprimento do registro, se necessário. </li><li> Examine o gráfico resultados (Figura 6) para avaliar a qualidade em forma e gravar o erro em forma. Altere os parâmetros de inicialização alguns Dobre cada, e re-&#39;Run &#39;. NOTA: Não desanime quando o programa fica preso - basta reiniciar o programa! </li><li> Repita esse procedimento várias vezes, começando com diferentes combinações de parâmetros de inicialização, visando o menor valor do erro em forma. </li><li> Copie a lista dos resultados de ajuste diretamente a partir da tela, ou encontrá-los em tele PfFit gerado pelo arquivo &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39;. </li></ol>

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development.">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. 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Exp. Bot. 58, 377 (2007).</li><li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount.">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li><li>Hosy, E., Duby, G., V&#233;ry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context.">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li><li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants.">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Aqui descrito é um procedimento simples e muito eficiente para medir a P f isoladas de protoplastos de plantas, em princípio, aplicável também a outras células esféricas, por exemplo., Os oócitos de rã 11. Este método baseia-se na medição da P f em resposta a um desafio osmótico para a célula. Em contraste com os outros métodos com base nesta abordagem, no entanto, a alteração das soluções, ou seja, da osmolaridade, não é instantânea, mas gradual, d...

A absorção de água eo fluxo através das membranas celulares é um requisito fundamental para a existência de plantas, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Ao nível celular, aquaporinas (AQPs) desempenham um papel fundamental na regulação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) da membrana celular 1-3. Até à data, vários métodos têm sido utilizados para medir a endógena P f de protoplastos de diferentes órgãos da planta (ou seja, raízes, mesofilo, endoderme, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uma das abordagens para medir P f é expor os protoplastos a um desafio osmótica e para controlar a velocidade inicial da sua alteração de volume (isto é., O declive da fase linear inicial da alteração de volume). Dois métodos diferentes foram previamente descritos com base nesta abordagem, tanto com base em uma troca instantânea de soluções. O primeiro consiste em immobilizing o protoplasto com uma micropipeta de sucção e interrupção do fluxo de solução a 5 e a segunda transferência de protoplasto de uma solução para outro, utilizando uma micropipeta 6. Estes métodos transferência de sucção micropipeta e micropipeta, que permitem a aquisição de imagens logo no início da troca rápida solução (para capturar a fase linear precoce de alteração de volume), provavelmente envolverá um esforço físico para protoplastos e requerem equipamentos especializados e micromanipulação especialista. O método aqui descrito minimiza a perturbação das células, e não envolve a micromanipulação permite derivação de P f quando o banho de perfusão não é instantânea. Após a digestão enzimática, os protoplastos, submersas numa solução isotónica, são imobilizados no fundo lamela de vidro de Plexiglass (aka Lucite ou perspex) por câmara de interacção de cargas. Em seguida, durante um banho de perfusão constante,a solução isotônica é nivelado afastado por uma solução hipotônica gerando um desafio hipoosmótico aos protoplastos. O inchamento do protoplasto é vídeo gravado e, em seguida, através da combinação da informação sobre a evolução no tempo do banho de perfusão e o curso de tempo da expansão celular, a P f é determinada por procedimentos de processamento de imagem e de ajuste de curva. As vantagens deste método é que a experiência é muito eficiente, ou seja, é possível acompanhar algumas células simultaneamente em um único ensaio, e que não requer equipamento especial ou habilidades específicas de micromanipulação. Várias aplicações para este método são possíveis. Por exemplo, a determinação da P f nativo de uma variedade de células de diferentes tecidos e plantas, tais como mesófilo e agrupar as células da bainha de folhas de Arabidopsis 7, milho mesofilo ou células do córtex da raiz de 8-10 ou de suspensão de células cultivadas 11,12. Em additina, é possível determinar P f de células de animais, tais como células esféricas 11 oócitos. Outro exemplo envolve a análise da actividade AQP pela expressão transitória de seu gene nos protoplastos (ou quaisquer outros genes que possam afetá-los, por exemplo, genes de quinases) e determinação de sua contribuição para a P f; por exemplo, a expressão de tomate AQP SlTIP2; 2 em Arabidopsis mesofilo protoplastos por transformação PEG e determinação do SlTIP2; 2 relacionada com a P f 13. Finalmente, o exame do efeito sobre o f P de diferentes substâncias (moléculas / medicamentos, hormonas, etc) adicionado às soluções podem também ser examinadas, por exemplo, o bloqueador de AQP HgCl 2 7. O protocolo seguinte descreve o isolamento de protoplastos de células e determinação da sua P f Arabidopsis mesófilo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

Estudar mecanismos de regulação AQP é crucial para a compreensão das relações de água, tanto no celular e todo os níveis de plantas. Apresentada aqui é um método simples e muito eficiente para a determinação do coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) em protoplastos de plantas, em princípio aplicável também a outras células, tais como esféricas oócitos de rã. A primeira etapa do ensaio é o isolamento de protoplastos a partir do tecido de planta de interesse por digestão enzimática para uma câmara com uma solução isotónica adequada. A segunda etapa consiste em um ensaio de desafio osmótica: protoplastos imobilizados no fundo da câmara é submetido a uma perfusão constante de partida com uma solução isotónica e seguido de uma solução hipotónica. O inchaço da célula é de vídeo gravado. Na terceira etapa, as imagens são processadas desligada para proporcionar mudanças de volume, e o curso de tempo das alterações de volume está correlacionada com a evolução no tempo da mudança de osmolarança do meio de perfusão da câmara, usando um procedimento de ajuste de curva escrito em Matlab (a &#39;PfFit&#39;), para se obter P f.

A fim de determinar o P f e comparar a actividade de diferentes AQPs, mesófilo protoplastos de folha de Arabidopsis são utilizados. Estes protoplastos foram encontrados a ter baixos basal (fundo) P f níveis 7 e pode servir como um sistema de expressão funcional para permitir medições P f reprodutíveis. Os protoplastos a partir de uma folha madura a partir de uma planta Arabidopsis seis semanas de idade foram isolados e três construções de...

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

15.9K visualizações.  The Hebrew University of Jerusalem.  Medir o coeficiente de permeabilidade à água osmótica (P f) de células pode ajudar a compreender os mecanismos de regulação de aquaporinas (AQPs). P f determinação em protoplastos de células de plantas esféricas aqui apresentados protoplastos envolve o isolamento e análise numérica da sua velocidade inicial da alteração de volume, como um resultado de um desafio osmótica constante durante a perfusão de banho. 

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Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Separação de células de fluorescência Activated de Protoplastos Usina

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Medir a rigidez à flexão de células bacterianas Usando uma armadilha óptica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Mecanismos Herbívoro caracterizando Resistance: Spittlebugs em Brachiaria Spp. como Exemplo

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Como exemplo

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Rápida análise de fenótipos circadianos em Arabidopsis Protoplastos transfectadas com um relógio Reporter luminescentes

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...