We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.

1. Cryo-titular Preparação e Manutenção NOTA: A estação de bombeamento de seca, que consiste em uma estação de bombeamento turbo e um ou mais controladores de palco frios, é usado principalmente para três finalidades: a) É um lugar seguro para guardar os titulares crio quando eles não estão sendo usados. A maneira correta de armazenar os titulares é deixá-los na estação sob vácuo. b) evaporar a humidade e formação de geada que ocorre quando o azoto líquido é removido do dewar e a ponta do suporte da crio é exposto; isto é conseguido com o ciclo de aquecimento. c) Para regenerar o dessecante zeólito, e para alcançar um elevado vácuo nos vasos dewar cryoholder. Isso é necessário para a realização de uma temperatura constante ao fazer microscopia eletrônica crio. <ol><li> Ciclo de Warm-up. <ol><li> Inserir o suporte do crio em uma das portas de bombagem de uma estação de bombeamento. Ligue um dos tubos de evacuação para a saída de metal por baixo da válvula de vácuo do titular. FazerCertifique-se de que todas as válvulas na estação (V1, V2 e V3) e no porta-crio estão fechados. </li><li> Ligue o controlador de fase fria e conectá-lo ao titular através do cabo de controle. Ligue o interruptor de alimentação da estação de bombeamento turbo. </li><li> Inicie a opção ciclo Warm-up no controlador fase fria. Quando o vácuo na estação de bombeamento turbo lê 10 -3 Torr ou melhor, abra o V2 da válvula de borboleta, espere até que o vácuo estabiliza e, em seguida, abra o V1 válvula de borboleta. </li><li> Execute o ciclo de aquecimento por cerca de 30 min até que a temperatura no suporte é estável acima de 20 ° C. Fechar V1, e, em seguida, interromper o ciclo. </li></ol></li><li> Ciclo de zeólita. Execute o Ciclo Zeolite Entre 4 horas e O / N antes de uma sessão CryoEM, e uma vez por semana, se não em uso. <ol><li> Iniciar o ciclo de opção de zeólito e seleccionar o tempo necessário para atingir um bom vácuo, na gama de 1-2 x 10 -4 Torr, e, assim, o tempo de retenção longo. Quando o vácuo atinge 10 -3Torr, abra a válvula Dewar evacuação, V3. A estação de bombeamento, então, evacuar a linha para o titular; aguarde até que o vácuo estabiliza. </li><li> Abra a válvula no porta-crio. Quando o ciclo está completo, fechar as válvulas na ordem inversa na qual foram abertos: a válvula no suporte, em seguida, V3, V2, V1 e finalmente. Desligue a estação de bombeamento turbo eo controlador de fase fria, e desligue o porta-crio a partir do controlador fase frio e da estação de bombeamento turbo. </li></ol></li></ol> 2. Grade Preparação <ol><li> Limpeza. NOTA: Ao usar grades furados comerciais, recomenda-se para as limpar antes do uso, a fim de remover qualquer polímero residual que foi usado no processo de fabricação. Fazei isto em um prato de vidro Petri com 5 camadas de papel de filtro definidas na parte inferior. <ol><li> Coloque as grades no papel de filtro com o lado de carbono perfurado virado para cima. </li><li> Usando uma pipeta de pasteur de vidro, molhar o papel com várias gotas of clorofórmio em torno das grades até que eles começam a flutuar. </li><li> Cobrir a placa de Petri com a tampa ligeiramente aberta em um exaustor O / N. </li></ol></li><li> NOTA: o suporte de carvão fino (passos de 2,2-2,3) pode ser omitido como a camada de gelo pode ser formado directamente através dos pequenos orifícios na grelha de carbono perfurado. <ol><li> Utilizando um par de pinças, clivar uma parte de mica para expor duas novas superfícies. Coloque as novas superfícies expostas de mica face-up em um pedaço de papel branco em uma placa de Petri. </li><li> Coloque a placa de Petri na redoma de um evaporador de carbono. Comece a sequência da bomba de vácuo para baixo até que está abaixo de 2 x 10 -6 Torr. Para evaporar quaisquer impurezas na superfície da haste de carbono, realizar um pré-evaporação com a placa de Petri cobertas. Em seguida, o ar da redoma de vidro e retire a tampa da placa de Petri. </li><li> Realizar a sequência de bomba para baixo até que o vácuo é inferior a 10 -6 Torr e o revestimento de mica com uma camada fina (~ 5 nm) de carbono. Use proteção para os olhos durante carbonoevaporação. Monitorizar a espessura do filme de carbono pela escuridão resultante no papel que tinha sido colocada sob o folhas de mica. </li></ol></li><li> Transfira a Fina Carbono para o TEM Grid. <ol><li> Cortar um pedaço de 0,5 x 1 cm de mica revestida a carbono e flutuar fora sobre a superfície plana do filtrado, a água desionizada. Use papel lente óptica para obter uma superfície plana de água. Usando a pinça, coloque o lado de carbono holey do grid em contato com a superfície superior da camada de carbono flutuante e buscá-lo. </li><li> Repita os passos 2.3.1 e 2.3.2 até que um número suficiente de grades estão preparados. </li></ol></li><li> Glow Discharge. NOTA: A descarga luminosa converte a camada de revestimento de carbono naturalmente hidrofóbico das grades em hidrofílico. Este passo é opcional. <ol><li> Coloque as grades com o lado de carbono voltado para cima sobre uma lâmina de vidro de 7,5 x 2,5 centímetros coberto com Parafilm. Coloque-o para dentro da câmara do equipamento de descarga luminescente e fechar a câmara. </li><li> Bombada redoma de vidro e de descarga luminescente para 20 segundos a 25 mA e 7 x 10 -2 mbar. NOTA: Durante este tempo um brilho púrpura luz torna-se visível. Retire a lâmina de vidro com as grades e usá-los no prazo de 1 hora, caso contrário, eles terão de ser descarregada brilho novamente. </li></ol></li></ol> 3. Amostra Plunge-congelamento NOTA: Use óculos de segurança e calçado apropriado ao usar este instrumento para proteger contra nitrogênio e etano líquidos salpicados. <ol><li> Ligue o aparelho de congelamento de mergulho. Encha o reservatório do umidificador com água destilada. Regule a temperatura desejada, e as condições de humidade relativa de tempo mergulhando blot, força blot e tempo de adsorção (22 ° C, 95%, 2 seg, 2 e 40 seg, no exemplo aqui apresentado). Coloque novo papel de filtro blotting. </li><li> Arrefecer o recipiente etano para baixo através do enchimento do reservatório exterior com azoto líquido até que a estabilidade é atingida (cerca de 10 min). Uma vez que o azoto líquido pára boiling, coloque a ponta do tubo que vem do tanque de etano na câmara interior e abrir a válvula muito lentamente. Liquefazer o etano na câmara interna e preenchê-lo até 1 mm a partir do topo. Evitar o congelamento do etano. CUIDADO: etano é extremamente inflamável e explosivo. </li><li> Certifique-se de pinças são alinhados dentro do aparelho de mergulho de congelamento. </li><li> Ligue umidade. Coloque uma grade sobre a pinça e coloque 3-5 ul da amostra sobre a superfície de carbono (lado maçante) da grade holey. Esperar para a amostra adsorver à grade e executar a blotting para alcançar uma fina camada líquida. </li><li> Flash congelar a grade mergulhando-o no etano líquido. Remova o conjunto da pinça à rede a partir do etano líquido segurando as pinças de forma constante, e transferi-lo para a câmara exterior com nitrogênio líquido. Transferir a grelha para uma pequena caixa de grade imerso em azoto líquido. Certifique-se de manter a amostra vitrificados em nitrogênio líquido o tempo todo durante a transferência para qualquer tanque de armazenamentoou ao titular da crio. NOTA: As caixas de grelha pode ser armazenada num grande capacidade (35-50 L) Dewar de azoto líquido durante pelo menos 1 ano. Para o armazenamento conveniente que pode ser colocada num tubo Falcon de 50 ml com dois orifícios perfurados na parte superior e uma linha de pesca ligado à sua tampa que pode ser puxado a partir da boca do dewar. </li></ol> 4. Transfira o Cryo-grade para o TEM <ol><li> Insira o suporte da crio na estação de trabalho de transferência de crio. Tome cuidado para não danificar a ponta do titular durante a inserção. Verificar a presença de pequenas fibras e pó sobre a haste e o anel de vedação do suporte do crio utilizando uma lupa, se houver qualquer removê-lo com papel de lente óptica. </li><li> Encher o dewar do suporte de crio e a estação de trabalho vaso com azoto líquido. Evite derramar o nitrogênio líquido, utilizando o funil preso que vem com a estação de trabalho. </li><li> Conecte o suporte do crio para o controlador de fase fria para monitorar a temperatura, e manter-se adicionar nitrogênio líquido &amp; #160; até que a temperatura estabiliza em cerca de -194 ° C. Certifique-se de que o nível de azoto líquido está sob o nível do selo de vácuo tanto na estação de trabalho do navio e do dewar titular crio. Pré-resfriar as pinças de grade, o anel de clipe e o fim brusco da ferramenta anel clipe na estação de trabalho. Também pré-arrefecer um conjunto de grandes pinças e uma chave de fenda em outro Dewar preenchido com nitrogênio líquido. </li><li> Transfira rapidamente a caixa grade crio contendo as grades hidratados congelados para o nitrogênio líquido na estação de trabalho usando as grandes pinças. Abra a caixa de grade do crio com a chave de fenda, pegue a grade hidratado congelada e colocá-lo na sede porta amostra. </li><li> Coloque o anel de clipe na parte superior da grade e pressione-a com o fim brusco da ferramenta anel clipe até que esteja firmemente encaixado no lugar. Feche a crio-obturador. Remova a caixa de ferramentas e crio grade a partir da estação de trabalho. </li><li> Mova toda a estação de trabalho com o titular e de rede para o console microscópio a fim de mini-mizar o tempo de transferência da rede em ar ambiente. </li><li> Top fora do TEM anti-contaminator com azoto líquido, que tinham sido previamente cheia e arrefeceu-se durante pelo menos 20 min. Pré-inclinar a platina do microscópio para -60 °. NOTA: Isso vai minimizar a perda de nitrogênio líquido como o titular está inserido na câmara. </li><li> Iniciar o ciclo câmara pré-bomba no microscópio. Certifique-se de que a válvula para o canhão de electrões é fechada (especialmente se for um FEG MET). Aguarde até que a sequência de câmara pré-bomba para terminar (cerca de 2 min) antes de inserir o suporte do crio. NOTA: Este é indicado pela luz vermelha no palco sendo extinto. </li><li> Insira o suporte na câmara e rode-o 90 ° no sentido horário; conectar o cabo de fase controlador frio para titular o crio para monitorar a temperatura. Espere novamente até que a luz vermelha se extingue e rodar tanto no palco e com o titular de volta para a posição 0 ° para inserir o suporte na oi do TEMcoluna vácuo gh. </li><li> Certifique-se de que a temperatura nunca vai acima de -160 ° C para evitar a formação de gelo cristalino. </li><li> Encher o Dewar do titular da crio. Aguarde 15-45 min até que o titular tenha termicamente equilibrada eo vácuo TEM recuperou antes de gravar imagens. </li><li> Se for detectada borbulhante do nitrogênio líquido, alterar a altura de enchimento de nitrogênio líquido, ou tocar suavemente a origem borbulhando com um cotonete. </li></ol> Coleta de Dados 5. baixa dose NOTA: A técnica de recolha de dados em dose baixa é usada para minimizar o dano de radiação de electrões para a amostra através da limitação da exposição a 20 electrões / A 2. Isto é conseguido pela alternância entre três configurações: &quot;Pesquisar&quot;, com pequeno aumento (~ 5,000X) e amplo campo de visão, &quot;foco&quot;, com ampliação elevada (~ 150,000X) e pequeno campo de visão, e &quot;exposição&quot;, com o final desejado Magnificação e contendo a área de interesse a ser gravado. Anule o feixe entre os modos. <ol><li> Configurar o Programa de baixa dose TEM e <ol><li> Retirar a crio-obturador e abrir as válvulas de coluna. </li><li> Centralize o palco e definir a altura eucentric (Z), utilizando o wobbler alpha para balançar o palco ± 15 °. Ajuste a posição Z até que não haja movimento apreciável enquanto a fase é de balanço. Ative o programa de baixa dosagem e selecione o detector para cada modo. </li><li> No modo de exposição encontrar uma área da grade que tem nenhum carbono, ajustar a iluminação, seleccionando o local de abertura do condensador e o tamanho óptimo de modo que a área a ser gravada é completamente iluminado. Certifique-se de espalhar o feixe na direção overcondensation. </li><li> No modo de busca, encontrar um pequeno recurso que será facilmente identificáveis ​​a maior ampliação. No modo de exposição, centro esse recurso com o joystick (o controlador de estágio xy). Comece com menor ampliação se a façanhaure não está no campo de visão. </li><li> No modo de pesquisa, trazer esse recurso para o centro do campo usando as xy dose de controles de baixa de deslocamento de imagem. Ir para o modo de exposição e mover o recurso ao longo do eixo de inclinação com o joystick até que esteja fora da área a ser gravado (0,5-3 micron). Vá para o modo de se concentrar e centralizar a função usando os controles de deslocamento de imagem XY. Comece com menor ampliação, se o recurso não está no campo de visão. </li><li> Manter o feixe centrado em todos os momentos. </li></ol></li><li> Coleta de Dados <ol><li> Retirar a crio-obturador e abrir as válvulas de coluna. Ative o programa de baixa dose. </li><li> No modo de pesquisa, identificar um quadrado grade contendo fina, gelo homogênea. </li><li> Escolher um furo adequado e colocá-lo no centro do campo. Alternar para o modo de se concentrar e focar a imagem. Então underfocus a imagem entre 0,5-4,5 microns. </li><li> Alternar para o modo de exposição e gravar a imagem. </li><li> Alternar para o modo de busca e repita os passos 5.2.3-5.2.4.Mover-se através da praça grade evitando pré-expondo bons furos para ser gravado. </li><li> Termine o quadrado da grade e se mudar para outro bom. </li><li> Reajustar altura (Z) e continuar a recolha de dados. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

TEM seguido por SPA contribuiu muitas estruturas 3D macromoleculares, aproximando-se 2.000 entradas na BDME em meados de 2014. Em geral, para uma dada macromolécula, uma estrutura 3D de baixa resolução é primeiro determinada a partir de dados NS, que pode ser seguido por uma superior que estrutura resolução cryoEM 3D. O alto contraste dos limites moleculares fornecidos por NS, o que facilita a reconstrução 3D primeiro, é depois refinada por cryoEM com a sua capacidade de mapear a estrutura interna da macromolécula no seu estado completamente hidratado, e a possibilidade de alcançar uma resolução muito maior. Outra vantagem de cryoEM é a eliminação de desidratação tensão que pode resultar no desmoronamento da macromolécula. Além disso, existe a possibilidade de omitir o suporte de carbono, o que elimina os efeitos de absorção possível da superfície e mostra a conformação que adopta a macromolécula em solução. Coloração Cryo-negativo, uma combinação de cryoEM e NS, oferece alto contraste de uma forma totalmente hidráulicaclassificado espécime e pode também levar a reconstrução 3D SPA utilizando, no entanto, foi utilizada menos frequentemente, com menos de 10 entradas BDME, em parte porque o próprio mancha pode interferir com a integridade da macromolécula 31. Duas outras técnicas TEM conducentes à reconstrução 3D são cristalografia de elétrons 2D e tomografia eletrônica. Cristalografia de electrões 2D requer um cristal planar ou tubular; difração de elétrons do cristal é usado para a reconstrução 3D levando potencialmente a resolução atômica 32. Na tomografia de electrões de espécimes fixados vitrificados ou tradicionalmente, um componente macromolécula ou sub-celular é rodado no interior da ETM para reconstrução tomográfica subsequente 33, com a vantagem de que os objectos singulares pode ser reconstruído; No entanto, actualmente, esta técnica tem um limite de resolução varia de 40 a 20 por 34,35. Entre todas estas técnicas moleculares TEM, SPA de dados NS e cryoEM tem sido o mais amplamenteutilizado. O protocolo ilustrado aqui é dedicado a obtenção de imagens cryoEM adequados para análise SPA; no entanto, a maior parte do protocolo é também aplicável a cryoEM de cristais 2D e amostras tomográficos. A sessão cryoEM sucesso depende do sucesso combinado de muitos passos críticos; aspectos importantes a ter em mente, a explicação de artefatos cryoEM comum e como evitá-los são descritos nos parágrafos seguintes. Esta seção também descreve as diretrizes de coleta de dados para a obtenção de alta qualidade reconstruções em 3D usando o método SPA. Evite transição para cristalino de gelo. Um aspecto central é que a amostra necessita para se manter em estado vítreo a partir do momento de observação ao longo TEM-mergulhando crio. Assim, depois de mergulhar a amostra em etano líquido todos os passos subsequentes são realizados em azoto líquido (-196 ° C) ou temperaturas hélio líquido (-269 ° C). Aquecendo acima -135 ° C transforma água vítrea ema água cristalina; em seguida, rearranjos macromoleculares pode ter lugar e os cristais de água dominam a imagem (Figura 3A); a amostra deve ser descartado. Accidental amostra warm-up poderia acontecer se crio-mergulhar, a transferência da grelha congelado entre recipientes (mesmo que protegidos por uma gridbox), e / ou crio titular inserção na TEM são muito lentos, ou se as pinças de manipulação não eram suficientemente pré- arrefecida. Deterioração vácuo significativo na TEM upon-transferência crio (ar que entra as armadilhas amostra frio mais quente) pode também aquecer a amostra. Finalmente, o excesso de irradiação da amostra também pode resultar na transição para cristalino gelo. Minimizar a contaminação de gelo. Dado o pequeno volume de amostra (3-5 ul) aplicada à grade TEM, evaporação poderia concentrar componentes do tampão (sal, detergentes) e, portanto, afetar a integridade macromolecular incluindo a perda de estado mui. A alta umidade relativa (UR) microambiente ou câmara contornars este problema. Alternativamente crio-mergulhar pode ser feito em uma sala fria ambiental suficientemente ventilado. Depois mergulha-RH crio deve ser tão baixo quanto possível para evitar a contaminação de gelo, ou a condensação de humidade ambiente na crio-grade, como o crio-grade si actua como uma câmara de frio. Contaminação de gelo é constituído por partículas com alto contraste e não subestrutura com tamanhos que variam entre ~ 5 nm e vários micra que interferem com, ou mesmo bloquear totalmente a imagem. Evite correntes de ar, falando / respiração para a crio-grade durante a transferência de ar, e reduzir RH ambiente. Recipientes de azoto líquido abertas com água condensada (visível como partículas suspensas brancas) também deve ser descartada. Maximize macromoleculares orientações / views. Para suporte de amostra, uma escolha a ser feita é entre os verdadeiros grids holey e carbono fina sobre grids holey. Isso depende (i) como a amostra se espalha sobre filme de carbono contra os buracos de carbono, (ii) disponíveis conce amostrantration, como furos nus pode necessitar de uma concentração de 100 vezes maior do que o apoio de carbono para uma densidade de partícula semelhante na imagem (a partir de ~ 0,02 a 2 uM), e (iii) A forma aleatória é a distribuição de orientações da macromolécula. Note-se que a alta brilho, o que torna o hidrofílico de carbono, terá um efeito importante em todos os três aspectos e que este será sample-dependente. No que se refere à orientação da macromolécula, enquanto que uma vista de repetição é desejável para a determinação estrutural inicial pela reconstrução cónica aleatório, de pontos de vista macromoleculares aleatoriedade é desejável quando optimizar a reconstrução 3D para resoluções mais elevadas. No nosso exemplo, RyR1 interage com o carbono, com vista favorita &#39;quatro vezes &quot;(Figura 2D) e exige grades holey de aleatoriedade de orientações e maior resolução 36. Maximize SNR. A melhor estratégia para aumentar a SNR é reduzir as fontes de ruído de fundo. Gelo excessivoespessura e (se houver) de espessura de filme de carbono para além do que é necessário para suportar e incorporar a proteína irá adicionar ruído extra. Assim, a espessura do gelo deve ser reduzida ao mínimo necessário, controlando blotting tempo, pressão, RH, e a qualidade do papel de filtro. Para suporte de carbono, a (~ 5 nm) de filme fino de carbono é mergulhado sobre o filme de carbono holey mais grosso: o carbono holey espessura proporciona resistência mecânica, enquanto a amostra é fotografada em cima do buraco coberto de carbono fina. Por outro lado, note que extremamente fina de gelo e / ou fumo pode resultar em um suporte facilmente quebrado que pode se transformar em um web (Figura 3D). Para maximizar a SNR, quaisquer componentes desnecessários tampão deve ser evitada. Para as proteínas de membrana, o detergente tem um preço significativo em contraste (ver Figura 2D, painel da direita). Além disso, reduzindo a tensão superficial do detergente muda a maneira em que a amostra se espalha sobre o suporte. Algumas proteínas de membrana requerem a presença de lípido para além detergent, o que reduz ainda mais o contraste. Para superar esta amostra pode ser diluída num tampão com uma concentração inferior de detergente e sem lípido imediatamente antes de mergulhar crio-37. Novas detergentes alternativos 16 e o uso de nanodiscos 38 para estabilizar a componente de domínio transmembrana parecem ser abordagens bem sucedidas para proteínas de membrana de imagem por cryoEM. Esforce-se para imagens de alta qualidade e se preparar para a correção CTF. Espécimes vitrificados exigir valores elevados de desfocagem para gerar imagem suficiente (fase) contraste onde o CTF, a função que relaciona a intensidade com a frequência, tem várias transições de zero, ponto em que não há nenhuma informações. Enquanto correção CTF não é necessário para baixa resolução reconstrução 3D, quando se aponta para a maior resolução, para recuperar uma representação exata do objeto 3D, imagens com diferentes defoci precisam ser coletados para que a correção CTF computacional pode ser feito.Determinação CTF e correção está incluída nos pacotes de software principais SPA 4-7; detalhes podem ser encontrados em outros lugares 39. Para a correção CTF ideal, use uma série de defoci. Uma boa estratégia é alternar entre 3-4 valores de desfocagem. Os valores dependem do tamanho da macromolécula (tamanhos maiores requerem menos de desfocagem), a espessura do gelo / carbono (diluente de amostra requer menos de desfocagem), e a tensão (tensão mais baixa requer menos desfocagem). Para 200 kV, uma boa variedade de partida de valores é de 2,5, 3, 3,5 e 4 mm de desfocagem. O CTF se manifesta como anéis de alta e baixa intensidade alternada (Thon anéis 40) na representação espaço recíproco, o espectro de potência. Exibindo o espectro de potência irá revelar o potencial de resolução; a frequência de o mais vasto anel Thon visível é o mais próximo de uma estimativa priori da resolução atingível. O espectro de potência deve ser verificada periodicamente, e astigmatismo (não circular) anéis Thon (Figura 3C) devem ser corrigidas com o stigmator objetivo. Anéis Thon deve ser visível, pelo menos, até a resolução desejada. Um conjunto de dados cryoEM obtido usando este protocolo pode ser processado directamente por SPA, a fim de gerar uma reconstrução 3D. Mesmo com uma amostra ideal, a qualidade da reconstrução 3D vai depender do desempenho e especificações do equipamento de transmissão, e no processamento de imagem. Com as melhorias contínuas em ambas as frentes, e com menção especial para os detectores de elétrons diretos recentemente desenvolvidas, a possibilidade de obter reconstruções 3D em resolução atômica de forma mais consistente está mais perto do que nunca.

O objetivo do cryoEM é obter imagens microscópicas de elétrons de macromoléculas em seu estado hidratado nativo. Em virtude da incorporação da macromolécula em água vitrificados, uma amostra de frozen-hidratado pode ser introduzido directamente e visualizados no instrumento TEM. Vitrificação, alcançado pelo flash congelamento (10.000 o C / s), congela a amostra sem a cristalização de água e garante que rearranjos moleculares durante o congelamento são insignificantes. O excesso de dispersão de electrões da amostra em relação ao tampão circundante fornece um pequeno, mas suficiente contraste para ver a macromolécula na ausência de qualquer mancha 1. Processamento de imagem computadorizada pode então ser usado para recriar estrutura 3D da macromolécula. Grandes macromoléculas na faixa de ~ 500 kDa- vários MDa são amostras ideais para cryoEM (que representam mais de 80% da Microscopia Eletrônica de Banco de Dados (EMDB) entradas); estes incluem proteínas, complexos de proteína, proteína-ácido nucleico complexes, e proteínas de membrana embutido numa bicamada. Estas macromoléculas são menos susceptíveis de ser cristalizado (com menos do que 2% entradas na base de dados PDB), no entanto, é muitas vezes o caso de que os pedaços menores resolvidos por cristalografia de raios-x ou RMN pode ser encaixado dentro do envelope 3D criado por cryoEM. Por outro lado, algumas das maiores estruturas resolvidas por cryoEM são identificáveis ​​no interior da célula completa por secção fina TEM 2. Assim, cryoEM pontes efetivamente o tamanho e resolução de lacunas entre as estruturas subcelulares e atômicas. CryoEM reflete melhor estrutura nativa da macromolécula que o método mais clássico de coloração negativa (NS), onde a macromolécula é desidratado e rodeado por uma camada de heavy metal de mancha pelo qual a região de exclusão cria uma mancha fortemente contrastada imagem &quot;negativa&quot; 3. Em ambos os casos, o feixe de electrões produz imagens 2D projecção das macromoléculas, como partículas, onde a shape depende da orientação da macromolécula em relação ao feixe de electrões. Muitas partículas, pelo menos, ~ 1000 e com um limite superior, pode ser analisado no computador com &quot;análise única partícula&quot; (SPA) de software para aumentar a relação sinal-ruído (SNR) embora média, e para encontrar parâmetros de orientação espacial da partícula necessário para recriar a estrutura 3D da macromolécula por volta 4-7 projeção. NS, com maior SNR, é usado para a caracterização preliminar da amostra e para gerar de novo uma reconstrução 3D; sua resolução raramente ultrapassa 20 Å, que é imposta pela desidratação e o tamanho do grão do metal pesado. Em geral, para determinação estrutural cryoEM 3D, uma reconstrução 3D de baixa resolução é obtido a partir de NS primeiro e depois cryoEM é usado para refinar este mapa inicial de baixa resolução para estudar ainda mais a macromolécula em seu estado nativo hidratado, para ver sua estrutura interna, e aumentar a sua resolução. Nãote que se o modelo NS foi distorcida (o exemplo mais comum é o achatamento resultante da desidratação 8) e as partículas cryoEM tinha baixa SNR, então a distorção poderia levar para o modelo cryoEM (o artefato viés modelo, que é comum em baixo SNR conjuntos de dados 9). Distorção estrutural resultaria na incompatibilidade entre os NS e cryoEM partículas e matérias entre as partículas de matérias-cryoEM e projecções correspondentes do modelo 3D ortogonal à direcção de achatamento. Viés modelo pode resolver por si só como o modelo 3D passa por ciclos de refinamento sucessivas. Se tal não suceder, o que seria detectado como a falta de correspondência entre as partículas cryoEM matérias e projeções correspondentes do modelo 3D, em seguida, um modelo de novo deve ser construído a partir dos dados cryoEM. Uma boa abordagem poderia ser a de usar o algoritmo reconstituição angular 10, que pode produzir vários volumes 3D possíveis e, em seguida, usar o modelo NS 3D para escolher o melhor modelo possível cryoEMque poderão ser aperfeiçoadas 11. Uma estratégia melhor ainda é aumentar o SNR do dataset cryoEM (ver secção dedicada na Discussão). A qualidade bioquímica da macromolécula purificada tem uma influência maior no resultado final. A macromolécula, purificado a partir de tecido ou expressas em sistemas heterólogos, precisa de ter um elevado grau de pureza e ser estruturalmente intacto. Ele também não deve formar agregados nem deve desagregar. Para definir uma conformação particular, as condições de preparação deve promover um estado conformacional uniforme. Para estudar complexos, é óptimo que o seu k D está na gama nM, de outra forma fixadores têm sido utilizados com sucesso para estabilizar as interacções de afinidade inferiores 12,13. Imagens cryoEM não transformados deu informações valiosas sobre as dimensões, linhas gerais, estado de agregação / multimerizaï¿½o, homogeneidade e estrutura interna da macromolecule. No entanto, o potencial da técnica é muito melhorada com processamento de imagem. A estrutura 3D revela arquitetura global da macromolécula, a localização de ligandos e subunidades, as alterações conformacionais 3D, e permite a ancoragem de estruturas atómicas determinadas por cristalografia de raios-x ou RMN. A quantidade de informação de uma reconstrução 3D aumenta passo a passo como a resolução é maior: em geral resolução de 15-20 permite encaixe inequívoca de estruturas atômicas, em 10/09 hélices A alfa são visíveis como varas, a 5 Å é possível discernir folhas beta, e em resoluções de 3,5 Å e melhor é possível construir um modelo atômico 14. A possibilidade de obter imagens informativas e uma reconstrução 3D utilizando SPA de relativamente pequenas quantidades de amostra fazer cryoEM uma técnica atraente, como 3-5 ul de pelo menos 0,05 mg / ml são suficientes para preparar uma grelha TEM. Os requisitos mínimos instrumentaispara cryoEM são uma crio-êmbolo caseiro ou comercial, um microscópio eletrônico com alto vácuo ultra, mídia de gravação de imagem e kit de baixa dosagem, um porta-crio com a sua estação de bombeamento, um aparelho de descarga luminescente e um evaporador. Recursos não-essenciais, mas ainda mais desejados do TEM são câmera CCD (presente em todos os TEMs modernos) ou um detector eletrônica direta, arma de emissão de campo (FEG), filtragem de energia e software de coleta de dados de alto rendimento. Este software, em princípio, permite coletar dezenas de milhares de partículas em uma única sessão cryoEM 15, no entanto o aumento das necessidades de armazenamento de dados e posterior supervisionado necessidade de tempo de pós-processamento para ser levado em consideração. FEG combinadas com a função de transferência de contraste (CTF) correção subjaz a maioria das reconstruções 3D que atingiram resolução suficiente para visualizar hélices alfa. Nesse ponto, o nível de resolução é também sample-dependente: atingir 10 Å de resolução é menos comum para as proteínas da membrana enquanto que sealta ordem de simetria está presente, em seguida, resolução atômica é mais viável. O recente desenvolvimento de detectores de elétrons diretos permitiu resolução atômica, mesmo para macromoléculas com baixo (4x) ou sem simetria, onde a qualidade dos mapas de densidade eletrônica cryoEM corresponde estes derivados de dados de difração de raios-x 16,17. Exemplos práticos que ilustram os recursos da técnica são fornecidos aqui para quatro tipos importantes de macromoléculas onde cryoEM tem um papel principal Continuada em sua determinação estrutural. (I) Com sua simetria icosaédrica que aumenta o conjunto de dados por 60 vezes e seu grande tamanho que permite fiel e alinhamento reprodutível, as estruturas de vários vírus icosaédricas foram resolvidos para quase atômica resolução por cryoEM seguido de SPA 18. Mostramos um exemplo de uma classe de vírus icosaédricos, os vírus adeno-associados (AAV), para a qual as estruturas de quase-atómicos por cryoEM e por cryoEM hy / x-raymétodos Brid existir 19,20. (Ii) As macromoléculas com uma estrutura helicoidal incluem microtúbulos, filamentos e vírus. As unidades repetitivas ao longo do eixo helicoidal pode ser analisado por uma versão mais complexa de SPA adaptada à geometria helicoidal 21. No exemplo, mostramos Tobacco mosaic virus (TMV), um vírus de RNA que foi resolvido com a resolução atômica por cryoEM 22. (Iii) proteínas solúveis Grandes têm sido amplamente estudados. Entre estes, macromoléculas que formam cilindros multimï¿½icas simétricas constituem uma arquitetura recorrente frequentemente resolvidas com resolução subnanometer 23,24. Aqui nós mostramos imagens de KLH, uma transportadora de oxigênio invertebrado, onde um modelo molecular híbrido foi criado a partir de cryoEM / raio-x métodos cristalografia híbridos 25. (Iv) As proteínas da membrana são uma importante classe de proteínas; eles constituem cerca de 1/3 das proteínas codificadas pelo genoma humano, mas eles são difíceis de caracterizar estruturalmente devido a complexidades associadas com transmembrane domínio estabilização 26, que constitui menos de 1,5% das estruturas resolvidas por qualquer técnica estrutural combinado. O papel de cryoEM e reconstrução 3D na sua determinação estrutural é exemplificada com o receptor de rianodina (RyR), uma grande eucariótica intracelular de Ca 2+ canal importante na contracção muscular e sinalização cérebro. As maiores estruturas resolução cryoEM até à data, com 10 Å de resolução, revelar estrutura secundária 27.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="661">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:132px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:243px;">Ethane</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">371745</td>
			<td style="width:167px;">99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable</td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:243px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:132px;">Airgas</td>
			<td align="right" style="width:119px;">27135</td>
			<td style="width:167px;">99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5326</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Mica sheets, 1 x 4 cm</td>
			<td style="width:132px;">Ted Pella</td>
			<td align="right" style="width:119px;">54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Graphite rods, presharpened size 1/8&#8221; dia x 2 &#188;&#8221; long tip 0.039&#8221; dia neck type</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">70220-45</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">350 ml cryo-dewars</td>
			<td style="width:132px;">Pope</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids&#160; Quantifoil</td>
			<td style="width:132px;">Quantifoil</td>
			<td style="width:119px;">Q10525</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Cu 400 mesh holey grids C-Flat</td>
			<td style="width:132px;">Protochips</td>
			<td style="width:119px;">CF-1.2/1.3-4C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:243px;">Glow discharge device</td>
			<td style="width:132px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">Model E7620</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Turbo pumping station</td>
			<td style="width:132px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;">Model 655</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:243px;">Carbon evaporator</td>
			<td style="width:132px;">Denton Vaccum</td>
			<td style="width:119px;">Model 502B</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:243px;">Freeze plunger</td>
			<td style="width:132px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Vitrobot Mark IV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/ctf</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software EMAN</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:243px;">Image Processing software Spider</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:243px;">Image Processing software Freealign&#160;</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">3D visualization software Chimera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Native Keyhole Limpet Hemocyanin</td>
			<td style="width:132px;">Biosyn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

do's and don'ts of cryo-electron microscopy: a primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3d reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Execução cuidadosa de todas as etapas protocolo apresentado na Figura 1 permite a visualização de hidratado, macromoléculas não-coradas congelados. Resultados para quatro amostras representativas com diferentes características estruturais são mostrados. As imagens microscópicas obtidos pelos métodos de NS e cryoEM são comparadas (Figura 2). Imagens (i) NS de AAV5 revelam partículas semelhantes a vírus de diâmetro em torno de 130 Å. A coexistência de estruturas de cheios e vazios corresponde a quebrada (que permitem a entrada de manchas) e capsids estruturalmente intactas, respectivamente. CryoEM mostra estruturas uniformemente vazios; na verdade, essas partículas virais não contêm material genético 28. NS mostra partículas redondas predominantes Considerando cryoEM mostra partículas principalmente hexagonais, refletindo sua forma icosahedral. (Ii) As imagens dos helicoidais TMV mostrar barras de diâmetro 180 Å e comprimento variável, muitas vezes mais do que 0,1 mm, com uma repetição helicoidal de 23 Å visível tantoem NS e em cryoEM. O canal central 40 Å está cheio de manchas nas imagens NS e vazio nas imagens cryoEM. (Iii) Native KLH, um didecamer de 8 MDa, monta em barris característicos de 350 Å diâmetro e comprimento de 400 Å. NS e cryoEM revelar de KLH vistas laterais retangulares e circulares fim-on visualizações. Ambas as técnicas revelar seis estrias perpendiculares ao eixo de simetria e as unidades morfológicas igualmente espaçados dentro de cada camada. CryoEM revela uma estrutura interna vazia. (Iv) do receptor de rianodina, um grande canal tetramérica intracelular de 2,26 MDa, é visto como um quadrado de 275 x 275 Å 2. Características de superfície intrincados, como uma cruz central e uma depressão central manifesto como a acumulação de manchas por NS, e as regiões de menor densidade por cryoEM. Enquanto NS mostra contraste semelhante em todas as quatro amostras ensaiadas, a comparação dos painéis cryoEM expõe o SNR inferior (de contraste) do RyR1 devido à presença de detergente para solubilizar a proteína de membrana. Exemplos típicos de artefatos cryoEM são mostrados para RyR1: gelo cristalino, a contaminação de gelo, astigmatismo, e estruturas web-like (Figura 3). Suas causas e prevenção são ainda descritas na seção de discussão. SPA e 3D reconstrução do frozen-hidratado RyR1 revela sua estrutura simétrica de quatro vezes, o que reflete a organização homotetrameric da proteína (Figura 4A). O domínio citoplasmático forma um prisma quadrado de 275 x 275 x 120 a 3 e contém vários domínios globulares reprodutíveis formando uma estrutura de andaime-like. O domínio transmembrana forma um prisma quadrado cônico menor com dimensões máximas de 115 x 115 x 60 a 3. Aos 10 Å de resolução, é possível visualizar hélices alfa (Figura 4B). Mapeamento diferença 3D pode revelar a posição de ligandos importantes, neste caso, a diferença mapa 3D de FKBP12, uma proteína de 12 kD considevermelho uma subunidade de RyR1, é sobreposta sobre RyR1 (Figura 4C) 29. Finalmente, mudanças de conformação fornecer uma visão dinâmica da macromolécula. Neste caso RyR1 previamente estabilizada em condições, quer fechados ou abertos revela uma translocação massa do fechado para o estado aberto (Figura 4D) 27. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma da técnica de microscopia eletrônica de crio. O diagrama destaca os principais passos do protocolo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig2.jpg" /> Figura 2. Comparação de NS cryoEM e para uma variedade de amostras. (A) AAV5, um vírus icosaédrica. (B) do TMV, um vírus helicoidal. Inserções mostram a repetição helicoidal, de 23 Å. (C) Native KLH. (D) RyR1; visualizações representativos são destacados (f, vista e s quatro vezes, vista lateral). Todas as amostras são gravadas sob condições de baixa dosagem e com a mesma ampliação de uma 50,000X sob uma tensão de aceleração de 200 kV. Barras de escala, 10 nm. Todas as amostras de NS estão em suporte de carbono, as amostras cryoEM A, C, D são em carbono fina sobre quantifoil, e amostra cryoEM B é diretamente sobre buracos quantifoil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig3.jpg" /> Figura 3. Galeria de imagens que mostram artefatos cryoEM comuns em uma amostra RyR1 cryoEM. (A) cristalina de gelo. Contaminação (B) Gelo (setas). (C) O astigmatismo. RyR1s na imagem astigmatic são pouco visíveis. A inserção da direita mostra o SPECT poderrum da imagem com anéis Thon assimétricas. A inserção da esquerda mostra o espectro de uma imagem não astigmatic para referência de energia. (D) estruturas Web-like. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52311/52311fig4.jpg" /> Figura 4. CryoEM e 3D reconstrução do receptor rianodina. . (A) representação Isosurface (B) Docking de uma estrutura cristalina do N-terminal 30 do RyR1 mostrando boa concordância entre as coordenadas atômicas e o envelope cryoEM; setas apontam para duas hélices alfa que se projectam a partir da estrutura. Ponta de seta indica uma das quatro hélices, que circundam a poro do canal iónico. As linhas ponteadas indicam os limites da membrana. (C) RyR1 e eis 3Dcação do ligando FKBP12 (cor laranja). (D) alterações na conformação do RyR1 em que vai do fechado (laranja) para a conformação aberta (malha preta). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52311/52311fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

45.7K visualizações.  Virginia Commonwealth University. This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Vídeo: Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Biologia

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

Microarrays de DNA: Controle de Qualidade da amostra, Hibridação Array e Digitalização

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal colony. Proper collection of tissues for further histological processing can impact the quality of testing results. This article describes the conduct of a basic gross examination including identification of heart, liver, lungs, kidneys, and spleen, as well as how to collect those organs. Additionally four of the more difficult tissue/sample collection techniques are demonstrated. Lung collection and perfusion can be particularly challenging as the tissue needs to be properly inflated with a fixative in order for inside of the tissue to fix properly and to enable thorough histologic evaluation. This article demonstrates the step by step technique to remove the lung and inflate it with fixative in order to achieve optimal fixation of the tissue within 24 hours. Brain collection can be similarly challenging as the tissue is soft and easily damaged. This article demonstrates the step by step technique to expose and remove the brain from the skull with minimal damage to the tissue. The mesenteric lymph node is a good sample type in which to detect many common infectious agents as enteric viruses persist longer in the lymph node than they are shed in feces. This article demonstrates the step by step procedure for locating and aseptically removing the mesenteric lymph node. Finally, identification of infectious agents of the respiratory tract may be performed by bacterial culture or PCR testing of nasal and/or bronchial fluid aspirates taken at necropsy. This procedure describes obtaining and preparing the respiratory aspirate sample for bacterial culture and PCR testing.

This article describes the procedures for conducting a basic postmortem examination of a mouse or rat, and the collection of basic organs, as well as more challenging sample types from for histological, microbiological, and PCR evaluation.

Necropsia de diagnóstico e coleta de tecido e amostra selecionada em ratos e camundongos

There are multiple sample types that may be collected from a euthanized animal in order to help diagnose or discover infectious agents in an animal ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.