Agradecemos ao Dr. Till Böcking pelo protocolo original de preparação de moléculas. 
Este trabalho foi apoiado pela bolsa NSF 1121972(SS).

1. Preparação química
<ol><li>Preparação e armazenamento de PLL-g-PEG-Biotin e avidin:<ol>
<li>Dissolva o polímero PLL-g-PEG-biotina no buffer PBS de acordo com as instruções do fabricante com uma concentração de 1,0 mg/ml.</li>
		<li>Alíquota de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura (ver Tabela 1) e armazenar a -80 °C por até um ano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação e armazenamento de Avidin/NeutrAvidin<ol>
<li>Dissolva o Avidin/NeutrAvidin não rotulado no buffer PBS de acordo com as instruções do fabricante com uma concentração de 1,0 mg/ml.</li>
		<li>Alíquota de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura (ver Tabela 1) e armazenar a -20 °C por até 3 anos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra de vírus: Prepare amostras de vírus de acordo com a necessidade experimental e o protocolo de laboratório antes deste ensaio. Utilize a etapa 1.3.1 para o método 5A, ou 1.3.2 para o método 5B.<ol>
<li>Prepare amostras de vírus para o método 5A antes do estágio 2. Utilize amostras virais preparadas dentro de 1-2 dias após a preparação, ou alíquota de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura (ver Tabela 1) em seguida, o congelamento de flash em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C por até um ano. Quando descongelar, use imediatamente.</li>
		<li>Prepare amostras de vírus para o método 5B semelhante ao 1.3.1. Descongele as alíquotas do vírus antes do 5B e armazene a 4 °C não mais do que 24 horas antes de misturar com anticorpos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare anticorpos biotinilados apropriados para o experimento.</li>
</ol>2. Limpeza de deslizamento de cobertura em preparação para tratamento químico
<ol><li>Coloque as tampas em um rack de talo teflon de tamanho apropriado que os mantém em uma orientação vertical e submerge-os em um béquer cheio de álcool etílico filtrado (0,2 μm) (prova de 190).</li>
	<li>Sonicate as tampas no álcool etílico filtrado (190 à prova) por 30 min.</li>
	<li>Remova as manchas de álcool e enxágue extensivamente com água ultrauso.</li>
	<li>Coloque as tampas enxaguadas em um rack Teflon limpo separado e béquer preenchido com 1 M NaOH.</li>
	<li>Sonicate as tampas no 1 M NaOH por 30 min.</li>
	<li>Remova as tampas do NaOH e enxágue-as extensivamente com água ultrauso.</li>
	<li>Seque as tampas enxaguadas com um fluxo de nitrogênio e coloque-as em um rack de Teflon limpo e seco.</li>
	<li>Inspecione as tampas para obter qualquer filme visível ou partículas que permaneçam na mancha de cobertura. Se algum material visível permanecer, a mancha não foi adequadamente limpa e enxaguada. Se não estiver devidamente limpo, repita as etapas 2.1-2.7.</li>
	<li>Limpe as tampas com oxigênio-plasma por 2 minutos. Esta etapa é opcional, mas recomendada.</li>
</ol>3. Formação da camada de filme fino PLL-g-PEG
<ol><li>Imediatamente após a secagem no fluxo de nitrogênio (ou o oxigênio-plasma opcional), coloque uma tampa horizontalmente em uma placa de Petri estéril. Pipet no centro da tampa uma quantidade apropriada de PBS tamponada tamponada PLL-g-PEG-biotina (ver Tabela 1).</li>
	<li>Coloque outra mancha de cobertura limpa em cima do fluido em um método de sanduíche. Observe que este método consiste em ter dois coverlips incubando seus filmes químicos orientando seus "rostos ativos" tratados quimicamente uns aos outros, separados apenas pela camada química atual. Certifique-se de que há fluido suficiente para que o volume entre as duas tampas esteja completamente preenchido com fluido, mas que nenhum fluido vaze entre as tampas (ver Tabela 1). O "rosto ativo" a partir de agora designa rostos de deslizamento que estiveram em contato com o fluido na configuração do sanduíche.</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e pegue o sanduíche com um par de pinças. Tenha cuidado para não beliscar o excesso de fluido. Use o polegar e o dedo indicador para beliscar o sanduíche levemente e deslize as tampas em direções opostas horizontalmente em relação uma à outra, em seguida, separe as duas tampas uma da outra sem tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com água ultrauso, canalando 25 ml de água ultrauso sobre a face ativa 2-4x, e depois seque as tampas com um fluxo de nitrogênio. Certifique-se de observar quais rostos de deslizamento de cobertura estão ativos.</li>
	<li>Utilize as tampas imediatamente, ou armazene O/N com o rosto ativo em uma placa de Petri estéril colocada em um ambiente de baixa umidade livre de poeira.</li>
</ol>4. Aprimoramento da ligação avidin
<ol><li>Coloque um deslizamento de cobertura tratado PLL-g-PEG com rosto ativo em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Pipeta uma quantidade apropriada de avidin descongelado no buffer (preparado na etapa 1.2) para o meio da face ativa.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido no método do sanduíche. Observe a face ativa das tampas. É importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido durante a incubação (ver passo 3.2).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 25-30 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com água ultrauso, canalando 25 ml de água ultrauso sobre a face ativa 2-4x e, em seguida, seque as tampas com um fluxo de nitrogênio. Observe a face ativa das tampas. Use imediatamente para a próxima etapa.</li>
</ol>NOTA IMPORTANTE: Existem dois métodos distintos para completar a preparação da amostra, dependendo do tipo de ensaio que o experimento implica. O experimentador deve prosseguir com o estágio 5A no qual o vírus está ancorado no vidro antes que qualquer tratamento adicional de anticorpos necessário para imagens de super resolução seja adicionado. 5B descreve um método alternativo de rotular o vírus na solução antes de ancorá-lo ao vidro. Os dados representativos deste manuscrito são preparados utilizando 5A. Um método apropriado deve ser selecionado de acordo com o tipo de ensaio experimental.
5A. Face Active Face Tether
<ol><li>Imediatamente após a secagem com um fluxo de nitrogênio no estágio 4.6, coloque uma tampa tratada de avidin face ativa em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Pipeta uma quantidade apropriada de anticorpo biotinilado descongelado no tampão no meio da face ativa (ver Tabela 1).</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Note a face ativa das tampas, é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2.).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS ao pipetar 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x, não secar e usar imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Coloque um anticorpo tratado de capa ativa face em uma placa de Petri estéril, e pipeta uma quantidade apropriada de vírus descongelado no buffer no meio da face ativa.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Observe a face ativa, pois é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2.).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS, tubulando 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x. Não seque as tampas, em vez disso coloque-as em um rack de Teflon e béquer preenchido com PBS imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Utilize as amostras preparadas imediatamente ou armazene em um buffer apropriado a 4 °C por até três dias sem perda significativa de integridade. NOTA IMPORTANTE: Se as amostras forem usadas em um ensaio AFM, a preparação estará completa e poderá ser utilizada imediatamente ou armazenada conforme descrito na etapa 5A.20 - 5A.21. Se as amostras forem utilizadas em um ensaio de imagem de fluorescência de super resolução, proceda à rotulagem de anticorpos descritas nas etapas 5A.12 - 5A.19.</li>
	<li>Coloque ambas as tampas tratadas pelo vírus face active face em uma placa de Petri estéril e tampão de bloqueio de proteína suficiente nas tampas para obter volume de fluido suficiente para cobrir os 95% centrais do deslizamento de cobertura sem fluir qualquer tampão de bloqueio fora da tampa (tipicamente 100 - 200 μl.) Incubar na RT por 60-90 min.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o tampão de bloqueio removendo as tampas uma de cada vez da placa de Petri e despejando o fluido da tampa em um béquer de resíduo. Tenha cuidado para não deixar cair o deslizamento.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS ao pipetar 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x, não secar e usar imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Coloque um único tampão de bloqueio tratado de capa ativa em uma placa de Petri estéril, e pipeta uma quantidade apropriada de anticorpo viral fluorescente rotulado no buffer no meio do rosto ativo.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Note qual rosto está ativo, é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 30 minutos.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS ao pipetar 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x, não secar e usar imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Não seque as tampas, em vez disso coloque-as em um rack de Teflon dentro de um béquer cheio de PBS. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Utilize as amostras preparadas imediatamente ou armazene em um buffer apropriado a 4 °C por até três dias sem perda significativa de integridade.</li>
</ol>5B. Em Ataque de anticorpos de solução
Este método é um aprimoramento opcional da estratégia de rotulagem para a imagem fluorescente de super-resolução. Aplicando o ataque em solução, um melhor revestimento de anticorpos na superfície viral pode ser alcançado.
<ol><li>Misture soluções de anticorpos em proporções de acordo com a necessidade de experimentos. Exemplo 1:4 proporção de 0,01 mg/ml anticorpo biotinilado para 0,01 mg/ml anticorpo fluorescente rotulado dará uma boa afinidade de ligação e permitirá uma boa recuperação de envelope em um ensaio de imagem de super-resolução.</li>
	<li>Misture porções iguais das soluções de anticorpos e vírus, respectivamente, preparadas em (5B.1) e (1.3). Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo algumas vezes na alíquota. Esta solução resultante pode ser armazenada até que seja necessária por até 24 horas a 4 °C.</li>
	<li>Após a conclusão da etapa 4.6, coloque um talo tratado avidin com rosto ativo em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Pipeta uma quantidade apropriada de vírus com solução de anticorpos (preparada na etapa 5B.2) no meio da face ativa.</li>
	<li>Coloque outra mancha (face ativa para baixo) em cima do fluido em um método de sanduíche. Observe a face ativa, pois é importante que as faces ativas estejam em contato com o fluido para incubação (ver passo 3.2).</li>
	<li>Coloque a tampa da placa de Petri sobre o sanduíche de cobertura e incubar na RT por 45-60 min.</li>
	<li>Retire a tampa da placa de Petri e separe as duas tampas conforme descrito na etapa 3.4, certificando-se de acompanhar e não tocar nos rostos ativos.</li>
	<li>Enxágüe ambos os rostos ativos com PBS, tubulando 25 ml de PBS sobre a face ativa 2-4x. Não seque as tampas, em vez disso coloque-as em um rack de Teflon e béquer preenchido com PBS imediatamente. Certifique-se de acompanhar quais rostos de coverlip estão ativos.</li>
	<li>Utilize amostras preparadas imediatamente ou armazene a 4 °C por até três dias sem perda significativa de integridade.</li>
</ol>6. Medição da propriedade do material de microscopia da força atômica
<ol><li>Ligue os lasers AFM e abra o software AFM. Selecione o modo de varredura apropriado para o ensaio desejado a partir da caixa de diálogo de abertura. Todas as janelas necessárias devem ser abertas por padrão; se não consultar o manual do usuário para abrir as janelas desejadas.</li>
	<li>Selecione uma cantilever apropriada à medição desejada e insira-a na carcaça cantilever de acordo com as diretrizes do fabricante. Existem uma ampla gama de condições e tipos de experimentos para os quais há uma variedade de cantilevers. O experimentador deve pesquisar cantilevers de acordo com sua necessidade.</li>
	<li>Insira a carcaça cantilever na cabeça AFM de acordo com as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>Se a amostra for usada em condições úmidas, remova a amostra do buffer de armazenamento e prossiga para a etapa 6.7.</li>
	<li>Se a amostra for usada em condições ambientais (secas), remova a amostra do seu tampão de armazenamento e enxágue-a brevemente mergulhando em um béquer de água ultrauso. Nota: Isso deixará uma fina camada de hidratação na amostra que pode induzir atração capilar com cantilevers tendo uma baixa constante de mola.</li>
	<li>Se a amostra for utilizada em condições ambientais (secas), seque suavemente a amostra com um fluxo de nitrogênio.</li>
	<li>Seque suavemente a parte de trás da tampa com um papel filtro sem poeira, certificando-se de não tocar na face ativa da amostra.</li>
	<li>Coloque a amostra no suporte de amostra AFM apropriado e coloque a amostra no estágio AFM.</li>
	<li>Se a amostra for imageada em condições úmidas, pipeta uma pequena quantidade de tampão no centro da amostra (~10 μl).</li>
	<li>Coloque a cabeça AFM sobre a amostra.</li>
	<li>Se a amostra estiver molhada, certifique-se de que a ponta cantilever e AFM penetrem na camada superficial, e que não haja bolhas entre a carcaça cantilever e cantilever.</li>
	<li>Alinhe o laser AFM com o cantilever de acordo com as recomendações do fabricante, a fim de obter o sinal ideal.</li>
	<li>Meça a frequência ressonante cantilever e defina a frequência de varredura de acordo com o tipo de experimento.</li>
	<li>Abaixe a ponta AFM para a superfície e otimize as configurações do sinal.</li>
	<li>Realize uma varredura AFM quadrada de 20 μm no modo de sua escolha. O modo Tapping (AC) foi utilizado na geração de dados representativos. Identifique os candidatos ao vírus por altura aproximada, que normalmente pode ser vista como picos afiados na superfície do vidro.</li>
	<li>Selecione um candidato a vírus e centralize a cabeça de varredura acima dele.</li>
	<li>Realize uma varredura quadrada de 250 nm (ou varredura de super-resolução apropriada) sobre o vírus selecionado, a fim de obter sua topologia e orientação.</li>
	<li>Selecione um ponto sobre o vírus para a medição da propriedade do material (por exemplo, o centro de um vírus esférico para uma medição de módulo de Young) e realize a medição de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>7. Método de imagem de super-resolução
<ol><li>Abra o software de imagem de super resolução e calibra o software de acordo com as diretrizes do fabricante.</li>
	<li>Calibrar o equipamento de imagem de super resolução de acordo com as instruções do fabricante utilizando contas fluorescentes.</li>
	<li>Monte o buffer de imagem amostral a partir de estoques pouco antes da imagem, combinando 50 μl de 1 M MEA e 100 μl de Gloxy de 10x a 850 μl de buffer de estoque. Mantenha o tampão de imagem no gelo durante o experimento.</li>
	<li>Remova uma mancha de cobertura preparada com amostra de seu buffer de armazenamento e enxágüe-o 5x mergulhando-o em um béquer de água ultrapura.</li>
	<li>Seque a face de deslizamento não ativo utilizando um papel filtro sem poeira. Certifique-se de não tocar no rosto ativo.</li>
	<li>Insira em um suporte de amostra do sistema de imagem e adicione 250 μl de tampão de imagem ao suporte da amostra. É razoável trocar o tampão de imagem na amostra a cada 2 horas para manter resultados consistentes.</li>
	<li>Cubra o porta-amostras com parafilme para diminuir a interação atmosférica com o ambiente da sala.</li>
	<li>Coloque o suporte de amostra no equipamento de imagem para imagens.</li>
	<li>Leve a amostra ao foco utilizando as instruções do fabricante.</li>
	<li>Imagem a amostra de acordo com a técnica de super-resolução que está sendo empregada. Certifique-se de ajustar as condições de imagem para otimizar o sinal, diminuindo as ativações simultâneas de fluoroforos foto-comutadores. NOTA IMPORTANTE: As condições de imagem são dependentes da amostra e variam de acordo com a necessidade experimental. Um experimento típico utilizando alexa 647 eficientemente inicializado para seu estado escuro no buffer de imagem pode então ser ativado por foto através da aplicação de luz UV de 405 nm. As imagens são obtidas por um subconjunto esparso de moléculas Alexa 647 dentro de uma amostra densamente rotulada e localizando cada fluoróforo com uma precisão limitada principalmente pelo número de fótons coletados. Este procedimento é iterado repetidamente pelo software até que um número desejado de ciclos de aquisição tenha acontecido. O experimentador deve ter essa configuração correlacionada com cada fluoróforo na amostra tendo sido foto-branqueada.</li>
	<li>Quando a imagem estiver concluída, desligue o equipamento de imagem de acordo com as instruções do fabricante. O software pode ser deixado em aberto para análise de dados.</li>
	<li>A análise dos dados depende fortemente do experimento; no entanto, em todos os casos, identificar vírus pela sua largura total pela metade do máximo, o que é comparado com as dimensões conhecidas do vírus, certificando-se de levar em consideração o tamanho adicional dos rótulos fluorescentes.</li>
	<li>Para uma melhor visualização, visualize as amostras utilizando a opção de renderização Isosulfa ou a opção de renderização volumosa, ambas normalmente encontradas em software de imagem de superres resolução.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes neste artigo.

Imagens de virion única com imagens de fluorescência AFM e alta resolução podem ser usadas como uma metodologia alternativa à tomografia CryoEM. Cada uma dessas metodologias tem seus pontos fortes específicos. Por exemplo, afm pode ser feito em virions WT sem necessidade de marcar a amostra ou as proteínas virais internas. A localização das estruturas virais é desconvolvada de suas contribuições para as propriedades elásticas do virion.
Imagem de super-resolução de virion único em combinação com as abordagens genéticas reversas virais recém-desenvolvidas torna-se uma técnica poderosa para localização de proteínas virais de baixo número de cópia20. Vírus recombinantes com a substituição de suas proteínas por proteínas fundidas a proteínas fluorescentes podem ser feitos e purificados usando essas abordagens genéticas reversas. Embora a imagem de super resolução tenha especificidade em parte devido à marcação genética, requer o uso dos vírus mutantes.
AfM e imagens de superrespeição são métodos complementares que utilizam preparações amostrais muito semelhantes. Os métodos descritos neste artigo, que são adotados formam ensaios de imagem de molécula única anterior, permitem ancoragem de virions únicos com poucos efeitos na topologia dos virions.

Interações não específicas baseadas em carga são rotineiramente usadas para adesão de virions na microscopia de força atômica1,2. Essas técnicas funcionam especialmente bem quando usadas em virions não desenvolvidos com capsídeos muito rígidos3-6. Embora essas técnicas sejam muito eficazes na imobilização da amostra, elas não impedem a ligação inespecífica de proteínas à superfície. A ligação não específica pode criar um problema ao tentar imaginar virions com técnicas de fluorescência AFM e super-resolução que requerem incubações da amostra com vários anticorpos. Aqui descrevemos um método de preparação amostral para imobilização específica de virions.
Poli (etileno glicol) (PEG) enxertado em poli (L-lysine) (PLL) e adsorvido em uma superfície de vidro fornece um bloco significativo para as interações eletrostáticas de proteínas com vidro7. Ensaios de molécula única que requerem imobilização de moléculas únicas em superfícies de vidro aproveitaram esta propriedade e a usaram para criar uma técnica específica de imobilização de molécula única baseada em PEG8-10. Esta preparação também foi utilizada para imobilizar gaiolas de clathrin na superfície de vidro11, bem como criar um revestimento de fibronectina homogênea para a adesão celular de controle 12.
Adotamos o método de preparação da amostra baseado na adsorção PLL-g-PEG em superfícies de vidro a partir de metodologias de imagem de molécula única e aplicamos-na a imagens de virions únicos do vírus da estomatite vesicular (VSV). Estes virions únicos foram imagens usando microscopia de força atômica (AFM). Experimentos semelhantes também foram realizados em contas funcionais como controle. Os virions também foram imagens pela microscopia de fluorescência de super resolução foram um anticorpo VSV-G rotulado com Alexa 647 foi usado para criar uma imagem do envelope de virions únicos. A imagem fluorescente de alta resolução utiliza a localização de moléculas únicas para criar uma imagem13-15. a imagem bi-planar fPALM permite a localização de moléculas únicas com resolução de 20 nm em plano e 50 nm ao longo do eixo óptico15,16. Esta técnica bi-planar foi utilizada para imagens fluorescentes de super-resolução presentes neste estudo. Uma técnica alternativa que tem resultados semelhantes é a STORM13,17,18.
Tanto as imagens fluorescentes afm quanto super-resolução fluorescentes de VSV ancoradas no vidro pelos procedimentos descritos neste artigo, mostraram ligação específica de virions ao vidro com interações mínimas não específicas19. Aqui apresentamos os protocolos de preparação da amostra para os experimentos de imagem fluorescente de ultra-resolução e afm e super-resolução. Resumindo: As tampas de vidro limpas são funcionalizadas por adsorção de uma mistura de PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-biotina. É típico que este filme fino seja projetado para fornecer entre 15-25% biotina funcionalizada em uma superfície revestida. As tampas são incubadas com avidin tetramérica. Um anticorpo viral biotinilado é então usado para criar um local de ligação único para os virions. A ligação do anticorpo pode ser feita de duas maneiras.
O primeiro método é otimizado para AFM, no entanto, permanece adequado para imagens de fluorescência de super-resolução. Neste método, a superfície revestida de avidin é tratada com anticorpo biotinilado antes da adesão viral. Os virions imobilizados são tratados com anticorpos rotulados Alexa 647 para cobrir o envelope e permitir imagens de fluorescência de super resolução dos virions.
O segundo método é atacar o vírus em solução com o anticorpo biotiningado e o anticorpo alexa 647 rotulado antes de aderir aos vírus à superfície tratada avidin; este método é otimizado para experimentos de imagem de fluorescência de super resolução em que a recuperação do envelope viral é importante. Este método tem a vantagem de permitir o revestimento uniforme de anticorpos na superfície viral. O anticorpo biotiningado pode ser misturado com anticorpos virais rotulados alexa 647 em proporções que permitem adsorção suficiente do vírus para a superfície tratada avidin, mantendo uma alta concentração de rótulo fluorescente no exterior do envelope viral. Estes anticorpos virais rotulados alexa 647 não são biotinilados e seu excesso pode ser lavado para reduzir o ruído de fundo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glass coverslips (fPALM)</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">72225-01</td>
			<td style="width:167px;">25 mm Coverslips</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">SuSoS&#160;</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.5 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NeutrAvidin biotin-binding protein</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A2666</td>
			<td style="width:167px;">Stock: 0.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21245</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">&#945;-VSV-G&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">ab34774</td>
			<td style="width:167px;">1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gluox</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>G2133-250KU&#160;</td>
			<td>Glucose oxidase type seven from Aspergillius&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Catalase</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C40-100mg&#160;</td>
			<td>Catalase from Bovine liver&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td>30070-10G&#160;</td>
			<td>Cysteamine (MEA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stock Buffer</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NTE</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:71px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">35 CIRCLE #1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for single virion atomic force microscopy and super-resolution fluorescence imaging

A imobilização de virions em superfícies de vidro é um passo crítico na imagem de virion única. Aqui apresentamos uma técnica adotada a partir de ensaios de imagem de molécula única que permite a adesão de virions únicos a superfícies de vidro com especificidade. Esta preparação baseia-se no enxerto da superfície do vidro com uma mistura de PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-Biotina, adicionando uma camada de avidin, e finalmente criando âncoras de virion através da fixação de anticorpos específicos do vírus biotinilado. Aplicamos essa técnica em uma série de experimentos, incluindo microscopia de força atômica (AFM) e imagens de fluorescência de super-resolução. Este método de preparação da amostra resulta em uma adesão de controle dos virions à superfície.

Imagem de virion única usando AFM:
O protocolo de preparação da amostra descrito acima foi utilizado na ancoragem de virions tipo selvagem à superfície do vidro. Os virions VSV têm forma de bala de 180 nm de comprimento e 80 nm de diâmetro. Como há uma variedade de virions para os quais essa técnica pode ser aplicada, o conceito também é demonstrado aqui em contas biotinylated de 36 nm também. Os experimentos AFM resultantes são mostrados na Figura 1. É importante notar que os virions VSV têm um módulo de Young mais baixo (100 MPa) em comparação com os vírus não desenvolvidos (GPa). As imagens particulares de single virion VSV foram obtidas no modo de toque em condições ambientais com um cantilever rígido. O objetivo tem sido deformar o vírus a ponto de que a densidade proteica extra dentro do vírus se torne visível como um galo dentro da imagem AFM. Este método é usado para detectar a densidade proteica extra dentro da cavidade do vírus19.
Imagem de super resolução de virion único:
Os anticorpos VSV-G rotulados alexa 647 foram usados para revestir o envelope de virions VSV individuais para experimentos de super-resolução usando o método 5A. Para demonstrar a densidade de amarração e a baixa ligação inespecífica, uma grande varredura da amostra é mostrada na Figura 2A. A recuperação do envelope viral em um virion representativo é mostrada na Figura 2B (isosuperfície azul).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figura 1. Imagens AFM de contas e VSV na superfície PEGG funcionalizada. AfM scan de 36 nm contas biotiniladas(A, B) e uma virion VSV(C)ancorada na superfície com um anticorpo VSVG biotinilado. A AFM foi feita no modo de topografia de ar CA. O raio da ponta é <25 nm e as medições foram realizadas sob modulação de força e toque de luz. A ponta tinha uma constante de força de 3 N/m e frequência ressonante de 75 kHz com incerteza de 15 kHz. Enquanto as contas mantiveram sua altura durante a varredura AFM, a virion VSV tem um módulo de jovem significativamente menor e é significativamente deformada em altura. Nesta imagem, a virion foi especificamente imagem com uma cantilever rígida no modo de toque que produziu uma pequena convolução de ximia (usada para determinar a ponta vs extremidade contundente do vírus) e a diferença de altura entre a ponta e a extremidade contundente do vírus é usada para detectar densidade proteica extra na extremidade bruta do vírus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figura 2. Imagens baseadas em fluorescência de virions VSV na superfície funcionalizada PEGG. A) virions VSV recombinantes imobilizados na superfície PEGG usando um anticorpo anti VSVG biotinína, visualizado em fluorescência de campo largo. B) Reconstrução de fluorescência de alta resolução do envelope de VSV anexado à superfície PEGG através de um anticorpo anti VSVG biotinitado e decorado com anticorpos anti-VSVG rotulados Alexa 647 (o método 5A foi usado para criar essas imagens). A superfície azul é uma projeção isosuperfície 2D. A esquerda mostra um modelo do vírus em forma de bala. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Tamanho do deslizamento de cobertura</td>
			<td style="width:93px;">fluido</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Alíquotas fluidas de acordo com o tamanho do deslizamento de cobertura.

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Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K visualizações.  University of Utah. A fixação de virions a uma superfície é um requisito para imagens de virion única por imagens de fluorescência de super resolução ou microscopia de força atômica (AFM). Aqui demonstramos um método de preparação de amostras para adesão controlada de virions a superfícies de vidro adequadas para uso em AFM e imagens de fluorescência de super resolução.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Biologia

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...