Esta pesquisa recebeu apoio do Projeto QNano http://www.qnano-ri.eu que é financiado pelas infra-estruturas da Comunidade Europeia de Investigação no âmbito do Programa Capacidades FP7 (Grant No. INFRA-2010-262163). Agradecemos também o conselho de pesquisa Formas de apoio financeiro.

Nota: Todos os parâmetros indicados no presente protocolo são válidas para os instrumentos e modelos aqui indicados. Alguns desses parâmetros (marcadas com * no texto) pode ser diferente, se um outro fabricante ou modelo é usado. 1. Start-up da FIB / SEM <ol><li> Monte o nanomanipulator frio custom-built (NM) dica sem anexar as tranças Cu ao anticontaminator (AC). Em vez disso, faz-se que as tranças são ligados ao resto do NM acima do ponto de isolamento para impedir a carga durante o passo de afiar (1.2). <ol><li> Feche a câmara de SEM, bomba para alto vácuo e imagem a ponta NM. </li><li> Se a dica é sem corte, curvado ou contaminado pelo uso anterior, apontá-lo por meio do feixe de íons: selecionar padrões de fresagem poligonais ao longo dos lados da ponta, de modo que após a moagem, a ponta se reduzirá para 1 m ou menos. </li><li> Uma vez que os lados da ponta ter sido moído de distância, rodar manualmente por 90 ° de toda a haste NMdo lado de fora da câmara de MEV. </li><li> Ajustar os padrões de fresagem poligonais para se adaptar à extremidade girado e repetir moagem a partir de um ângulo diferente. </li></ol></li><li> Uma vez que a ponta foi melhorado para ser inferior a 1 mícron, retraia o NM e inserir a agulha do sistema de injeção de gás (GIS); reposicionar a agulha estar em cerca de 1 mm acima da distância de trabalho (em vez dos habituais 175 um). </li><li> Se estiver usando um precursor Pt, mudar sua temperatura de funcionamento de 24-26 ° C (em vez dos habituais 40 ° C). Estes passos são necessários para crio-deposição 13 do Pt. </li><li> Abra a câmara de SEM e preparar o FIB / SEM para modo crio montando o palco amostra crio eo AC. </li><li> Desligue o NM para a posição inserido e conectar suas tranças Cu para o AC. Certifique-se de não tocar acidentalmente a ponta NM. O sistema é arrefecido com a MN inserido para certificar-se de que a perda de flexibilidade da trança de Cu a temperaturas criogénicas não irá dificultar o movimento NMmento. </li><li> Purgar os tubos de arrefecimento com azoto gasoso seco durante alguns minutos. </li><li> Bomba da câmara preparação crio ea principal câmara de amostra de alto vácuo. </li><li> Adicionar nitrogênio líquido para os Dewars esfriar ambas as câmaras. Aguardar até que a temperatura desejada seja atingida. </li></ol> 2. Congelação Amostra <ol><li><ol><li> Monte duas grades TEM para amostras FIB no suporte transferência do SEM. Prenda-os, apertando os parafusos correspondentes, com uma chave de fenda. </li><li> Montar um topo apropriado de amostra para amostra e adiciona uma porção do espécime. Dependendo do tipo de amostra, a amostra pode ser fixada com cola criogénico ou com uma pinça. Use quantidades tão pequenas quanto possível assegurar o congelamento ideal. </li><li> Monte o suporte de transferência do SEM para o dispositivo de transferência de vácuo (VTD). </li></ol></li><li><ol><li> Adicionar nitrogênio líquido na estação slushing e bombear até obter lama nitrogênio. </li><li> Abra o slestação ushing e mergulhar-congelar titular transferência do SEM. Bomba para baixo novamente até ferver é completada e lama é obtido novamente. Deve notar-se que uma etano ou propano lama ou congelamento de alta pressão são as técnicas mais adequadas para obter a vitrificação da amostra. </li></ol></li><li><ol><li> Recolha porta-a transferência de SEM para a câmara de vácuo do VTD e selá-lo. </li><li> Alivie a estação slushing ea câmara preparação câmara crio. </li><li> Combine o selo VTD com a câmara da câmara de preparação crio e bomba. </li><li> Quando um bom nível de vácuo é alcançado, envolver o pino câmara para abrir o selo do VTD ea câmara externa; insira o suporte de transferência do SEM. Há marcas nos contatos deslizantes nas câmaras de preparação que indicam a posição da amostra para pulverização e fratura. </li></ol></li><li> Se necessário, a amostra pode ser: fraturado com a faca frio; sublimada, definindo uma temperatura mais elevada (geralmente -1006: C); revestido com Au / Pd ou Pt por meio do sputterer frio (300 V, 10 mA, 60 seg de 2-3 nm Au / Pd a tampa) *. Sublimação não deve ser utilizado para amostras de faiança para evitar a sua recristalização. </li><li><ol><li> Use a faca fria para abrir as tampas de proteção das ranhuras da grade de TEM. </li><li> Traga o estágio frio na câmara de amostra para a altura de recepção de 16 mm (*). </li><li> Desligue o HT na FIB / SEM e abrir a câmara interior. </li><li> Use o VTD para transferir o suporte do SEM para a câmara de amostra. Escurecer a iluminação no quarto pode ajudar nesta etapa. </li><li> Uma vez que o titular do SEM está na fase fria, desengatar o VTD, empurrando e girando. </li><li> Recolha a haste VTD todo o caminho para a câmara de vácuo VTD e fechar a câmara interior, a câmara exterior eo selo VTD. A câmara exterior agora pode ser ventilado para remover o selo VTD. Este último passo não é obrigatório, mas é recomendado como a vara VTD podem ser facilmente retirados por acidente, o que pode causar danosà VTD ou a câmara. </li></ol></li></ol> 3. Ion Milling <ol><li> Ligue a alta tensão em ambas as colunas e definir os parâmetros de imagem apropriados (tensão de aceleração: 10 kV para o feixe de elétrons de 30 kV para o feixe de íons; tamanho spot: 3; distância de trabalho: 5 mm, feixe de íons atuais: 10-100 pA para imagens, 1-3 nA para fresamento) *. </li><li> Use o feixe de elétrons para encontrar uma característica de interesse e para a aquisição de imagens para documentar o estado da amostra antes da extração da lamela. </li><li> Depois de uma região de interesse (ROI) para extracção tem sido identificado, marcá-lo por padrões de feixe de iões, a menos que a topografia da amostra em si permite uma fácil identificação da ROI, mesmo após a deposição de Pt. Para uma maior precisão, utilizar o método descrito por 14 Pettersson et al. As marcações deve ser profunda, ampla e longe o suficiente para ser ainda visível após ter sido coberto pela deposição de crio-Pt (que é não-selectivo e vai cobrir vários mm2 da superfície da amostra). </li><li> Aquecer o gás precursor de 24-26 ° C, e introduzir a agulha SIG para uma altura de cerca de 1 mm acima da superfície da amostra (ver também o passo 1.3). </li><li> Enquanto imagem com o feixe de elétrons, abra a válvula de gás por alguns segundos. A taxa de deposição de crio-Pt é 100-500 nm / seg ou mais, dependendo da distância da agulha SIG, a rugosidade da amostra e do sistema do utilizador. É aconselhável executar alguns depoimentos de teste para determinar os parâmetros ideais. </li><li> A deposição crio-Pt-prima é muito áspera e não homogênea. Cure o depósito sobre o ROI por meio de um feixe de íons de 1.000 pA em baixa ampliação (por exemplo 2.000 X). Ao contrário da deposição de crio, esta cura é local e selectiva deve ser efectuada apenas a ROI. A finalidade deste primeiro crio-deposição é proteger a superfície da amostra de danos do feixe de iões e para reduzir curtaining durante o desbaste de iões 13. </li><li> Inclinar a amostra para52 °, de modo que a superfície é perpendicular ao feixe de iões. Moinho de distância duas trincheiras em socalcos de ambos os lados do ROI. As dimensões típicas para as trincheiras são 20-30 mM na direcção (X) paralelo à lamela que ser extraído, 10-15 mM na direcção perpendicular (Y) e com uma variável, inclinada de profundidade (Z), com o ponto mais profundo fechar para o ROI. A inclinação deverá ser de 45-55 °. Em alguns instrumentos, terraços trincheiras só pode ser moído com o ponto mais profundo no topo. Nesse caso, uma usina sob o ROI, em seguida, girar a imagem 180 ° e moinho a segunda do outro lado. A profundidade de moagem pode ser seleccionada, se a taxa de pulverização catódica do material é conhecido. Para a maior parte da amostra congelada-hidratado, a taxa de pulverização catódica de gelo pode ser utilizado 7. </li><li> Incline a amostra de volta para 0 ° e use o feixe de íons para cortar as laterais e inferior da lamela, certificando-se as marcas de corte passar por toda a lamela (possivelmente eles deixarão marcas moagem no moinho socalcosed no passo anterior). Deixar apenas duas pequenas pontes de ligação a lamela com o resto da amostra. </li><li> Insira a agulha GIS (pode mudar um pouco da amostra). Manobra do NM até sua ponta está em contato físico com a lamela, de preferência ao lado. Verifique se o NM não está obstruindo a visão feixe de íons das duas pequenas pontes de ligação. </li><li><ol><li> Abra a válvula de GIS por alguns segundos e monitorar a deposição crio por imagem contínua com o feixe de elétrons. </li><li> Quando uma camada de 1-2 mM adicional de Pt foi crio-depositado, fechar a válvula. </li><li> Curar o Pt (ver passo 2.6) apenas em poucos mM em torno do ponto onde o NM está em contacto com a lâmina. </li><li> Use uma corrente de feixe de iões de alta para cortar a lamela livre. As duas pontes de ligação devem ser moídos de distância, bem como o excesso de Pt, que podem ter sido formados novos pontos de contacto entre a lâmina e o resto da amostra. Não retirar a agulha GIS ainda. </li></ol></li&gt; <li> Manobrar cuidadosamente o NM para extrair a lamela das trincheiras e movê-la, pelo menos, 500 mm acima da superfície da amostra. Só após esta etapa, retrair a agulha GIS. </li><li> Abaixe o estágio da amostra alguns mm e movê-lo até que um dos grades TEM está em vista. Movimente a área de fixação no grid para a posição de trabalho e inserir a agulha GIS. </li><li><ol><li> Manobrar cuidadosamente o NM para trazer a lamela anexado em contato físico com a área de fixação da grelha TEM. Não deve haver qualquer pressão ou tensão entre a lamela, a grelha TEM e o NM. </li><li> Abra a válvula de gás para alguns segundos e crio-depósito de uma camada de 1-2 mM adicional de Pt. </li><li> Cure a Pt (veja o passo 2.6) somente em poucos mM em torno do ponto de contato entre a lamela ea grade TEM. </li></ol></li><li> Use uma corrente de feixe de íons de alta para cortar a lamela livre do NM. Isto pode ser realizado por moagem de distância ou a ponta NM ou do lado da amostra. Em tele primeiro caso, a ponta terão de ser afiada de novo antes que a próxima utilização, tal como descrito na etapa 1.2. </li><li> OPCIONAL: nesta fase, é possível usar o VTD levar titular transferência do SEM e guarde-O / N em um Dewar preenchido com nitrogênio líquido. Esta transferência e armazenagem de O / N é susceptível de provocar a formação de gelo sobre a superfície da lamela se cristais de gelo são já presente e / ou se o azoto líquido é exposto a ar húmido; mas tal contaminação serão removidos pelo passo seguinte num relativamente curto espaço de tempo. À medida que as etapas anteriores pode ter levado várias horas para completar, pode ser apropriado para o fazer, uma vez que após o passo seguinte tal armazenamento O / N não é recomendado, pois não haveria nenhuma maneira de remover a contaminação de gelo, exceto por sublimação (que não pode ser realizado se a vitrificação da amostra deverá ser mantida). </li><li> Incline a amostra a 52 ° e use o feixe de íons de fina que a do elétron transparência 7. Recomenda-se começar com mais elevado, rougsuas correntes de feixe para remover a maior e proceder à multa polimento da superfície com correntes de feixes inferiores, eventualmente reduzindo também a tensão de aceleração. A espessura final da lamela deverá ser de 100-200 nm ou menos, para a análise de uma ultra-estrutura de 100-200 kV ou MET-se a 500 nm para a tomografia de 300 kV TEM, dependendo da composição da amostra. Durante o desbaste, as tensões internas da amostra pode causar a lamela para enrolar ou dobrar. Em tal caso, a região diluído deve ser restrito. Isto aconteceu por exemplo, nas Figuras 11 e 12. </li></ol> 4. Cryo Transferência para TEM <ol><li><ol><li> Lave a estação de transferência de crio com gás nitrogênio seco por alguns minutos. </li><li> Adicionar nitrogênio líquido para o Dewar do TEM AC e para a estação de transferência de crio. </li><li> Insira o suporte TEM a transferência crio no slot apropriado da estação de transferência de crio e encher sua Dewar também. Espere até que cada amostraonent atingiu a temperatura desejada (cerca de 15 min). Se possível, o controlador de suporte de MET a-transferência de crio deve ser ligada para controlar a temperatura durante a transferência. É importante perceber que a ponta do suporte da ETM (onde o sensor de temperatura encontra-se) estarão em contacto com a estação de transferência de crio e, por conseguinte, irá arrefecer mais rapidamente do que o resto do suporte de MET. Por conseguinte, recomenda-se que o tempo necessário para que todo o suporte de transferência MET-crio para arrefecer é medida previamente, e que o sistema é permitido thermalize para, pelo menos, a mesma quantidade de tempo. </li><li> Encha um copo criogênico com nitrogênio líquido e mergulhar nele: a ferramenta TEM amostra de fixação, uma chave de fenda e uma pinça, a fim de esfriar suas dicas para a temperatura desejada. Todas as ferramentas devem ser devidamente isoladas na outra extremidade de modo a não causar queimaduras de frio para a mão do operador. </li></ol></li><li> Combine o VTD para a câmara externa. Traga o veado frioe à altura de transferência (16 milímetros *). Desligue a alta tensão. </li><li><ol><li> Abra o selo VTD, a câmara externa ea câmara interior. </li><li> Use a vara VTD para travar no suporte transferência do SEM, empurrando e girando no sentido horário. </li><li> Recolha porta-a transferência de SEM para a câmara de preparação crio. </li><li> Use a faca fria para fechar as tampas de proteção das grades TEM. Isto é necessário para reduzir a possibilidade de contaminação de gelo durante a transferência. </li><li> Utilizar a haste VTD para mover a amostra para a câmara de vácuo do VTD. </li><li> Feche as câmaras pressurizadas e selo. </li></ol></li><li> Alivie a câmara exterior e retire o VTD. Combine o VTD à porta SEM da estação de transferência de crio. Enquanto a lavagem com nitrogênio seco, use o pino na estação para abrir o selo do VTD e deslize o suporte a transferência de SEM no Dewar da estação de transferência de crio. </li><li><ol><li> Adicionar azoto líquido suficiente para que o nível na estação de transferência de crio seja suficientemente elevadaapenas para submergir a amostra. </li><li> Use a chave de fenda previamente arrefecido a abrir uma das tampas e solte o parafuso correspondente que está mantendo a grade de TEM no lugar. </li><li> Use a pinça previamente refrigerado para escolher a grade de TEM e colocá-lo no porta-TEM. </li><li> Utilizar a hexring arrefecida para prender a grade no suporte MET MET. </li><li> Feche o obturador do titular TEM a transferência crio. O passo de transferência de amostras é essencial e pode ser dificultada por azoto gasoso reduzir a visibilidade da pequena amostra MET. </li><li> Desligue a estação de transferência de crio a partir do sistema de bombeamento e transportá-lo perto do MET, em conjunto com o controlador de aquecedor de titular TEM a transferência crio. </li><li> Ligue a bomba turbomolecular do TEM para bombear a linha de apoio para a câmara TEM. </li><li> Defina o estágio da amostra TEM a uma inclinação de -70 ° *. </li><li> Defina o tempo de bombeamento mais curto para a câmara de vácuo (30-60 seg), com apenas um ciclo de purga com gás nitrogênio seco. </li&gt; </ol></li><li> Certifique-se de que a tampa de protecção no suporte TEM a transferência crio é fechada. Retire o suporte do TEM a partir da estação de transferência de crio e inseri-lo no goniômetro inclinado (nitrogênio líquido vai derramar fora do Dewar titular TEM). O ciclo de bombeamento será iniciado. Uma vez que o ciclo é completado, definir o goniómetro para inclinar para trás a 0 ° C e, ao mesmo tempo, manter o suporte do TEM de modo que ele não roda com o goniómetro. Inseri-lo totalmente dentro do TEM. Durante este passo, o suporte de MET de transferência de crio deve ser ligado ao seu controlador de aquecedor para controlar a temperatura. O procedimento para inserir o suporte da amostra no TEM podem variar entre diferentes TEMs. Portanto, é recomendável entrar em contato com o fabricante TEM obter o procedimento adequado. </li><li> Encher a transferência crio titular TEM Dewar. Aguarde até que o vácuo na TEM para chegar a um nível aceitável. </li></ol>

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Autores têm nada a revelar.

Este protocolo é uma adaptação bastante simples a temperaturas criogênicas da preparação padrão da amostra FIB / TEM utilizada em ciências de materiais em temperatura ambiente. O método produz amostras TEM livres de deformação mecânica e marcas de faca (a grande desvantagem de microtomia), embora curtaining pode ocorrer se a superfície da amostra é heterogênea. Este pode ser reduzido por crio-deposição de uma camada de nivelamento (neste trabalho de Pt foi usado), curado até que seja lisa e sem traços 13. As amostras com componentes de dureza muito diferente pode ser preparado também sem o risco de que iria quebrar sob o esforço durante a preparação. As tensões internas podem ainda fazer com que a lâmina fina de dobrar ou enrolar, caso em que o tamanho da secção tem de ser reduzida. A desvantagem em comparação com outro método é a possibilidade de alterar a estrutura biológica devido a exposição ao feixe de iões e possível implantação de iões na amostra. Estas desvantagens também ocorrer à TA durante amostra preparção em ciência dos materiais 15. Eles podem ser reduzidos através do preenchimento do desbaste com um passo final de polimento ao menor tensão de aceleração de iões (500-1.000 V). Esta etapa de polimento muito suave irá remover a camada danificada da lamela. Devido à natureza do crio-deposição (passos 3.5, 3.10 e 3.13), grandes partes da amostra irá ser coberto, obstruindo assim a vista da superfície original. Isso pode torná-lo difícil de acompanhar o ROI, a menos que várias marcas são usadas como sugerido no passo 3.3. Durante as etapas 4.5 e 4.7 os riscos lamelas finas que entram em contacto com o ar. Isto tem que ser evitada, pois causaria a humidade no ar para formar cristais de gelo na superfície da amostra, possivelmente, para o ponto de obscurecer características importantes. Essas etapas devem ser realizadas tão depressa quanto possível, mas ao mesmo tempo um manuseamento incorrecto durante a transferência é susceptível de provocar a perda da amostra eleself. Recomenda-se que o usuário pratica esses passos usando grades TEM vazios antes for feita uma tentativa em uma amostra real. Na ciência dos materiais, o instrumento FIB tornou-se o principal método de preparação de amostras TEM dentro de uma década de sua comercialização. Uma vez que pode ser utilizado em praticamente qualquer amostra, que elimina a necessidade de adaptar a técnica de preparação para o tipo de amostra. Acreditamos firmemente que o mesmo poderia acontecer em temperaturas criogênicas, graças ao procedimento detalhado aqui. A sua aplicação a amostras maiores ainda está sujeita à capacidade de crio-preservação-los em um estado vitrificados, mas técnicas como mergulhar-congelamento ou de alta pressão de congelamento de 3,5 pode revelar-se as soluções ótimas para o problema.

Neste protocolo de um cryo-FIB/SEM é usado para produzir as amostras de MET a partir de uma região específica da amostra, previamente identificada com elevada precisão por análise MEV. A microscopia eletrônica (varredura e transmissão) a análise de amostras biológicas é uma técnica de rotina usados ​​para pesquisa e diagnóstico. SEM é fácil de empregar e interpretar bastante rápido e, mas a informação só é obtida a partir da superfície da amostra e com uma resolução na faixa de 1,5 nm. TEM tem uma resolução maior, mas é mais difícil de implementar, a análise de imagem é menos simples e que a informação é obtida a granel, as amostras devem ser diluídas a elétron transparência (menos de cerca de 500 nm de espessura). Um problema adicional é que os requisitos de vácuo desses instrumentos raramente são toleradas por amostras que contêm água. Na maioria dos casos, as amostras biológicas devem ser quer quimicamente fixo (substituindo a água com, por exemplo, polímeros) ou seca. Em ambos os casos, mudanças significativas nomorfologia e estrutura das amostras são susceptíveis de ocorrer. Preparação Cryo TEM de espécimes hidratados induz alterações químicas mínimas e produz amostras o mais próximo possível do seu estado nativo, especialmente se vitrificação de gelo é obtido 1-6. O FIB é amplamente usado para preparar amostras para TEM suas numerosas vantagens 7. Para citar alguns: o uso de íons de alta energia a incidência quase normal minimiza o efeito das taxas de moagem diferenciais relacionadas com as matérias-; a região extraído a partir da amostra a granel pode ser escolhida com uma precisão sub-mícron; uma quantidade muito pequena de material é extraído. Alguns desenvolvimentos técnicos recentes tornaram possível usando o FIB também para preparação de amostras TEM em temperaturas criogênicas 2,8-10. Há várias vantagens em relação ao método tradicional de preparação de crio-micrótomo 11,12 utilizado principalmente para amostras de matéria macia, tais como a ausência de deformação mecânica da lamela cortado,a ausência de marcas de faca ea possibilidade de preparar amostras compostas com interfaces de disco / macios ou componentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Strata DB 235&#160;</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">FIB/SEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omniprobe 100&#160;</td>
			<td colspan="2">Oxford Instruments&#160;</td>
			<td>nanomanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alto 2500</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo preparation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cryo-holder model 626</td>
			<td style="width:71px;">Gatan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>cryo transfer TEM holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tecnai F30</td>
			<td style="width:71px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TEM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryo-electron microscopy specimen preparation by means of a focused ion beam

Aqui é apresentado um protocolo utilizado para preparar amostras de crio-MET de esporos de Aspergillus niger, mas que pode ser facilmente adaptado a qualquer número de micro-organismos ou soluções. Nós fazemos uso de uma estação de transferência de crio personalizado construído e uma crio-SEM preparação câmara modificado 2. Os esporos são tomadas a partir de uma cultura, mergulham-congelado numa lama de azoto líquido e observadas no crio-SEM para seleccionar uma região de interesse. Uma lamela fina é então extraída usando o FIB, ligado a uma rede de MET e subsequentemente eliminadas até electrões transparência. A grade é transferido para um suporte de crio-MET e para uma ETM para estudos de alta resolução. Graças à introdução de uma ponta nanomanipulator resfriado e uma estação de transferência de crio, este protocolo é uma adaptação simples de temperatura criogênica da preparação FIB usado rotineiramente de amostras TEM. Como tal, tem as vantagens de se exigir uma pequena quantidade de modificações para instrumentos, instalações e procedimentos existentes; ele is fácil de implementar; que tem uma ampla gama de aplicações, em princípio, a mesma que para a preparação da amostra de crio-MET. Uma limitação é que requer tratamento eficiente dos espécimes em passos críticos para evitar ou minimizar as contaminações.

Neste trabalho fez uso de: a dupla viga FIB / SEM equipado com um nanomanipulator e uma câmara de crio-preparação; TEM um com um suporte de transferência de crio; uma estação de transferência de crio protótipo. O anticontaminator (AC) lâminas da câmara de crio-preparação e a ponta do nanomanipulator (NM) foram modificados por Gatan. Com relação a uma câmara de crio-preparação padrão, as lâminas AC são maiores para proporcionar uma maior dissipador de calor para a ponta NM. Além disso, o AC está equipada com grampos para ligar as tranças Cu para a troca de calor com a ponta NM. Os pneumáticos do FIB / SEM foram modificados para permitir que o NM ser e permanecer inserido, mesmo quando a câmara da amostra foi ventilado. Deve notar-se que os parâmetros utilizados neste trabalho são os mais adequados para o equipamento acima listadas; os parâmetros podem ser ajustados para necessário ao trabalhar com outros tipos de equipamentos. Para trabalhar com este protocolo, as precauções normais para a manipulação de criogenia, sistemas de nitrogênio e vácuo líquido deveser seguidas. O método foi testado em diferentes tipos de amostras, com bons resultados, que varia a partir de soluções ou de matrizes poliméricas contendo nanopartículas, ao organismo unicelular para nemátodes. Exemplos dos vários passos do processo estão ilustrados nas Figuras 1-12 em A. esporos niger corados com tetróxido de ósmio e permanganato de potássio. Os esporos são primeiro fotografada por SEM (Figura 1) para identificar o local de extracção. Neste caso, uma secção transversal de qualquer esporo era suficiente, mas é possível posicionar o ROI para extracção com precisão sub-micrométrico de, por exemplo, uma fatia de uma célula específica, a uma distância específica a partir da membrana celular. Uma vez que a característica de interesse foi identificada, a primeira etapa da deposição de crio-Pt é implementada (Figura 2), para proteger a amostra de danos a partir da moagem de feixe de iões. A amostra é inclinada a 52 ° para prosseguir com os primeiros passos Sf de moagem (figura 3): a pulverização de duas trincheiras em ambos os lados da lamela. A amostra é então inclinada para trás e ainda triturada para deixar apenas duas pequenas pontes de ligação que para a maior parte (Figura 4). O nanomanipulator arrefecido é trazido em contacto com a lamela (Figura 5) e outro de crio-deposição de Pt soldas juntos (Figura 6). As pequenas pontes de ligação são, em seguida, moído de distância e o NM move a lamela perto da área de fixação da grelha TEM (Figura 7), onde é soldado com um crio-deposição final Pt (Figura 8). O NM é então separado da lamela (Figura 9), a qual é diluída para baixo a transparência de electrões com o feixe de iões (Figura 10 e 11). A lamela é finalmente transferido para a ETM (Figura 12) onde imagens de alta resolução, espectroscopia, a tomografia e outras técnicas can ser empregues. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig1.jpg" /> Figura 1. Imagem Cryo-SEM de esporos de A. niger, antes de deposição de Pt. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig2.jpg" /> Figura 2. A mesma área na Figura 1, após a deposição de Pt, mas antes da cura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig3.jpg" /> Imagem Figura 3. Cryo-SEM da mesma área na figura 2, inclinado 52 °, após a deposição de Pt e de cura, com a moagem trincheira curso(Veja o passo 3.7). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig4.jpg" /> Figura 4. A lamela, pronto para elevador-out. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig5.jpg" /> Figura 5. A ponta nanomanipulator frio faz contato com a lâmina. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig6.jpg" /> Figura 6. Um segundo Pt crio-deposição é usado para soldar conjuntamente o nanomanipulator e a lamela. <img alt = &quot;Figura 7&quot; fo: Content-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51463/51463fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7. Nanomanipulator O frio é utilizado para transferir a lamela para a área de fixação da grelha TEM. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig8.jpg" /> Cryo-deposição Figura 8. For usado mais uma vez, para fixar a lâmina à grelha TEM. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig9.jpg" /> Figura 9. A lamela é cortado livre do nanomanipulator e agora está pronto para armazenamento ou diluindo a elétron transparência. <p class="jove_content" fo:keep-together.dentro-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig10.jpg" /> Figura 10. Um passo intermediário de adelgaçamento, com poucos esporos visíveis em secção transversal. <img alt="Figura 11" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig11.jpg" /> Figura 11 imagem Cryo-SEM da amostra após o desbaste final.; a maior parte dos outros esporos tinha que ser moído para longe porque a lamela começaram a enrolar. <img alt="Figura 12" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51463/51463fig12.jpg" /> Figura 12. Uma imagem crio-TEM composto da lamela. Parte do stub Al foi incluídona lamela (seta preta).

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Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM.

Cryo-Microscopia Eletrônica de Preparação de Amostras por meio de um Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.4K visualizações.  Uppsala University.  Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM. 

Vídeo: Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biologia

Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups. This technique uses HistoGel (Thermo Scientific) with conventional laboratory equipment.
The use of cell block sections is a valuable ancillary tool for evaluation of non-gynecologic cytology. They enable the cytopathologist to study additional morphologic specimen detail including the architecture of the lesion. Most importantly, they allow for the evaluation of ancillary studies such as immunocytochemistry, in-situ hybridization tests (FISH/CISH) and in-situ polymerase chain reaction (PCR). Traditional cell block preparation techniques have mostly been applied to non-gynecologic cytology specimens, typically for body fluid effusions and fine needle aspiration biopsies.
Liquid based cervicovaginal specimens are relatively less cellular than their non-gynecologic counterparts with many individual scattered cells. Because of this, adequate cellularity within the cell block sections is difficult to achieve. In addition, the histotechnologist sectioning the block cannot visualize the level at which the cells are at the highest concentration. Therefore, it is difficult to monitor the appropriate level at which sections can be selected to be transferred to the glass slides for testing. As a result, the area of the cell block with the cells of interest may be missed, either by cutting past or not cutting deep enough. Current protocol for Shidham's method addresses these issues. Although this protocol is standardized and reported for gynecologic liquid based cytology specimens, it can also be applied to non-gynecologic specimens such as effusion fluids, FNA, brushings, cyst contents etc for improved quality of diagnostic material in cell block sections.

Shidham's method for preparation of cell blocks with AV-marker from cytology specimens containing individually scattered cells and small cell groups.

Preparação Cell Block da amostra citologia com predomínio de células individualmente Scattered

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

Exame<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval células terminais traqueais por microscopia de luz

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparação de amostras biológicas por congelamento de alta pressão, realce de contraste assistida por microondas e resina mínima incorporação para a imagem latente de Volume

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Targeted Studies Using Serial Block Face and Focused Ion Beam Scan Electron Microscopy

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. For many years electron microscopy (EM) has remained an inherently two-dimensional technique. With the advent of serial scanning electron microscope imaging techniques (volume EM), using either an integrated microtome or focused ion beam to slice then view embedded tissues, the third dimension becomes easily accessible. Serial block face scanning electron microscopy (SBF-SEM) uses an ultramicrotome enclosed in the SEM chamber. It has the capability to handle large specimens (1,000 &#181;m x 1,000 &#181;m) and image large fields of view at small X,Y pixel size, but is limited in the Z dimension by the diamond knife. Focused ion beam SEM (FIB-SEM) is not limited in 3D resolution, (isotropic voxels of &#8804;5 nm are achievable), but the field of view is much more limited. This protocol demonstrates a workflow for combining the two techniques to allow for finding individual regions of interest (ROIs) in a large field and then imaging the subsequent targeted volume at high isotropic voxel resolution. Preparing fixed cells or tissues is more demanding for volume EM techniques due to the extra contrasting needed for efficient signal generation in SEM imaging. Such protocols are time consuming and labor intensive. This protocol also incorporates microwave assisted tissue processing facilitating the penetration of reagents, which reduces the time needed for the processing protocol from days to hours.

Here, we present a protocol for efficiently combining serial block face and focused ion beam scanning electron microscopy to target an area of interest. This allows for efficient searching, in three dimensions, and locating rare events in a large field of view.

Estudos alvejados usando a cara de bloco de série e a microscopia focalizada da varredura do feixe de íon

This protocol allows for the efficient and effective imaging of cell or tissue samples in three dimensions at the resolution level of electron microscopy. ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.