Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o ciclo celular e a dinâmica da população de células-tronco da linha de germes em C.elegans. As principais vantagens dessa técnica são que ela não requer transgenes, é compatível com a coloração imunofluorescente, podendo ser modificada para estudar células em muitas condições diferentes. Fiquei muito entusiasmado quando vi este método sendo usado no laboratório de Scheda.
Embora este método possa fornecer uma visão do ciclo celular de C.elegans, ele também pode ser aplicado a questões mais amplas sobre envelhecimento, nutrição ou genótipos alterados. Geralmente, laboratórios novos neste método podem lutar com a idiodisprepação inicial ou a coloração de hematoxilina C.elegans. Comece usando técnica estéril para adicionar 200 microliters de 10 mililitros EdU em 100 mililitros de tampão M9 e os suplementos apropriados para quatro mililitros de cultura MG 1693 E.coli recém-cultivada durante a noite.
Fazer idiodiscious requer um delicado equilíbrio entre a suplementação de EdU e a timina. Como a quantidade de timmidina deve ser suficiente para que o E coli cresça bem, enquanto a quantidade de EdU deve ser suficiente para o escudo robusto contra o nivelamento. Depois de não mais do que 24 horas a 37 graus Celsius e 200 RPM, use técnica estéril para dividir a cultura entre dois a quatro tubos cônicos estéreis de 50 mililitros para centrifugação.
Resuspenja a solução pellatina quatro mililitros de tampão M9 fresco e use a mesma pipeta para aplicar cerca de 8 gotas de solução EdU rotulada E Coli MG1693 para o centro de temperatura ambiente individual 60 mililitros M9 A guard petri dishes. Para alimentar as bactérias rotuladas pela EdU aos nematoides, use PBS fresco para lavar os C.Elegans de uma antena média de crescimento nematoide em um tubo de 1,5 mililitro e permitir que os animais se assentam brevemente pela gravidade. Lave os animais uma a duas vezes com um mililitro de PBS e use uma pipeta pasteur de vidro para transferir os nematoides para o centro do gramado da EdU em uma pequena gota de PBS.
Espere alguns minutos para que o líquido seja absorvido e incubar a cultura por pelo menos 30 minutos a 20 graus Celsius de acordo com o protocolo experimental. No final da incubação, use dois mililitros de PBS para lavar os vermes da placa de cultura EdU em um prato de dissecação de vidro. Após a dissecção e fixação das gônadas de nematoides como descrito anteriormente, enxágue um pequeno tubo de vidro borossilicato de um mililitro e uma pipeta pasteur de vidro longo com PBS suplementada com 0,1%tween 20 e use a pipeta para transferir as gônadas fixas para o tubo em uma pequena quantidade de interpolação PBS.
Colete as gônadas por centrifugação e use uma pipeta de pastagem de vidro longa e desenhada para remover o máximo de supernênite possível sem perturbar a pelota de cárdia. Para detecção da EdU, adicione 100 microLiters de coquetel EdU clique nas gônadas e cubra o tubo com filme de laboratório para uma incubação de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as gôngas uma vez com 100 microLiters de tampão de lavagem de reação, e quatro vezes com um mililitro de interpolação PBS.
Após a última lavagem, adicione 25 microLiters de meio de montagem anti-fade suplementado com DAPI à amostra. Enquanto o meio está se acomodando sobre as gôngas, coloque uma grande almofada de 2,5% de agarose em um slide de microscópio de vidro padrão. Em seguida, achate com um segundo slide.
Em seguida, use uma pipeta pasteur de vidro longo e mantenha todos os líquidos e gôndas na ponta estreita da pipeta para minimizar a perda de amostra ao transferir as gôndas para a almofada. Usando um cílio colado em um palito, distribua as gônadas sobre a almofada de agarose e remova quaisquer partículas de poeira. Em seguida, abaixe lentamente uma tampa de vidro retangular sobre as gôngas, tomando cuidado para evitar bolhas de ar e removendo qualquer solução em excesso com um tecido de laboratório.
Contar células em três dimensões requer alguma prática confiável. O uso do plug-in do contador de células de Fiji e um script como marca as células para remover quaisquer duplicatas ajuda a tornar as contagens reprodutíveis. Depois de permitir que o deslizamento de cobertura se instale durante a noite, use o contador de células plug-in e Fiji para contar manualmente cada núcleo, rotulando cada núcleo individual de acordo com a presença ou ausência de fosfohistone três EdU ou rotulagem celular de zona pré-geral.
O sinal EdU co-localiza com o sinal DAPI. Em alguns núcleos, o sinal EdU cobre todos os cromossomos, enquanto em outros núcleos, o sinal EdU localiza-se de um a dois punkta brilhante, provavelmente no cromossomo X, que se replica no final da fase S. O sinal edu de uma rotulagem bem sucedida de 30 minutos se localiza para aproximadamente metade dos núcleos na zona pré-geral.
Embora a técnica funcione consistentemente em animais adultos jovens do tipo selvagem, uma fração significativa de hermafroditas de 5 dias de idade não consegue rotular em um pulso EdU de 30 minutos. A duração do G2 pode ser estimada analisando o percentual de núcleos na fase M que são EdU positivos ao longo do curso temporal, permitindo o cálculo da mediana e duração máxima do G2. A duração do G2 e do G1 pode ser estimada a partir do percentual de todos os núcleos da zona pré-geral que são positivos da EdU, permitindo o cálculo da duração máxima das fases combinadas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o mesmo lote de pratos EdU para minimizar a variabilidade inter-experimental.
Após este procedimento, outros métodos como a coloração com anticorpos adicionais podem ser realizados ou responder a perguntas adicionais sobre o ciclo celular, destino celular ou caminhos de sinalização. Não se esqueça que trabalhar com análogos de nucleídeos e parafermeldahyde pode ser perigoso, e que precauções, como o uso de luvas nitrol, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
