The authors would like to acknowledge funding support from the University of South Florida, Department of Surgery (Mack Wu, MD, PhD).

NOTA: A aprovação para todos os procedimentos com animais apresentados a seguir foram obtidos a partir da Universidade do Comitê Animal Care do sul da Flórida (IACUC) e cumprir todas as exigências da Lei do Bem-Estar Animal e do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparação de folhas de silicone e instrumentos cirúrgicos <ol><li> Tiras pré-cortadas (10,5 cm x 3,0 cm), de não reforçado 0,01 espessura, folhas de silicone de grau médico e esterilizar utilizando uma autoclave. </li><li> Limpar e esterilizar instrumentos cirúrgicos adequados (tesouras, pinças e cortinas ou toalhas para criar um campo estéril durante a cirurgia). </li></ol> 2. Animais Experimentais <ol><li> Use adulto masculino ou ratas com peso na faixa de 250-350 g obtido a partir de um criador comercial. Se ratos idosos são utilizados, eles devem ser ≥350 g, a fim de garantir uma melhor sobrevivência pós-cirurgia. Antes do início de todas as experiências os animais aclimatizar durante, pelo menos7 dias em condições normais de um ciclo de luz-escuro de 12 horas com comida e água ad libitum. </li></ol> 3. A anestesia, analgesia pós-operatória e Preparação operativo <ol><li> Induzir a anestesia geral usando isoflurano a 3% -4% através de uma câmara de indução e manutenção (através da utilização de um cone de nariz) a 1% -2% com O2 durante a preparação da pele e cirurgia. Monitore a profundidade da anestesia pela observação do ritmo e profundidade da respiração, pitada interdigital ou palpebral reflexo de piscar. NOTA: neste momento, uma pomada veterinário pode ser colocado sobre os olhos para evitar a secura, enquanto o animal está sob anestesia. </li><li> Em uma remota localização da área cirúrgica esterilizada, coloque o rato em decúbito ventral e raspar o dorso com clippers a partir da base do pescoço para baixo cerca de 11 cm. Stencil com marcador permanente, o esboço para o 3,0 centímetros x 10,5 centímetros aba (ver Figura 1A). </li><li> Mova o rato para, um surgica designado limpol área equipada com uma almofada de aquecimento aprovado e campos cirúrgicos estéreis ou toalhas. Injetar 5 mg / kg por via subcutânea cetoprofeno antes das primeiras incisões cirúrgicas para tratamento da dor. Os fluidos adicionais (solução salina) pode ser determinado (máximo de 5 cc) por via subcutânea, conforme necessário. </li><li> Prepare a pele ainda mais limpando primeiro com 70% de álcool isopropílico e em segundo lugar com 0,2% de clorexidina, em seguida, aplicar campos estéreis para criar um campo estéril. 10% de povidona-iodo (Betadine) também pode ser usado. NOTA: Um antibiótico (ampicilina a 15 mg / kg) pode ser administrado por via subcutânea, mas, se forem utilizadas técnicas assépticas boas, não é necessário. </li></ol> 4. Criação de Feridas excisional e bipediculado Flap <ol><li> Usando um, descartável 6 milímetros ferramenta biópsia estéril, crie duas circulares feridas &quot;isquêmicos&quot; no centro da área do retalho designado (Figura 1B). A profundidade da ferida deve ser até (e não através) a fáscia do panículo Carnosus músculo (Figura 1B inserção). </li><li> Usando fórceps levantar a pele no meio do contorno da ferida criada pelo perfurador de biópsia e, em seguida, utilizar tesouras íris (com pontas curvas) para excisar a peça circular de tecidos (incluindo o músculo panniculus carnosus). O resultado será um de espessura total da ferida com a fáscia como a base da ferida. NOTA: O tecido excisado (tampões de feridas) pode ser congelado rapidamente em azoto liquido ou fixadas em 10% de formalina tamponada com O / N para processamento posterior, como controlo, a pele normal. </li><li> Criar uma aba bipediculado fazendo incisões com um bisturi estéril em cada lado das feridas isquémicas ao longo das linhas de pré-retiradas (Figura 1C) que são 10,5 centímetros de comprimento e 3,0 cm de distância. A profundidade das incisões deve ser baixo para os músculos paraspinous. Usando uma tesoura de íris, separar o fascia panniculus carnosus dos músculos paraspinous, tomando cuidado para manter a fáscia intacto como a &quot;base&quot; dos mm socos 6 (Figura 1D). </li><li> Tome uma folha de silicone pré-corte estéril e colocá-lo no meio da fáscia panniculus carnosus e os músculos paraspinous (Figura 1E), assegurando que a folha não está torto ou desistir. Usando preto, suturas não absorvíveis (tamanho 4.0) fechar as duas incisões, ancorando a folha de silicone para a pele, com pelo menos 8 interrompidos pontos de cada lado, ao longo do comprimento da aba (Figura 1F e 1G). </li><li> Utilizando uma ferramenta de punção de biópsia descartável estéril, criar duas feridas de controlo &quot;não-isquémicos&quot; internos (para baixo para a face anterior do músculo panículo carnoso) lateralmente a 1 cm dos ferimentos isquémicos em cada lado da aba (Figura 1G). </li><li> Coloque uma régua abaixo as feridas e tirar fotos digitais para fins de avaliação da ferida (ver Figura 3A). Nesta altura, o fluxo sanguíneo (perfusão) pode ser monitorizada por utilização de Doppler a laser ou outras manipulações (colocação tópica do fármaco) realizadas.</li><li> Aplique um adesivo líquido aprovado tanto cranial e caudal para as feridas e uma película transparente vestir para manter o ambiente húmido e limpo (estéril). Um curativo adicional pode ser colocado na extremidade caudal da aba para impedir que o animal de remover as suturas mais caudal. </li></ol> Procedimentos 5. pós-operatórias <ol><li> Colocar os animais em gaiolas (alojados individualmente) equipados com alimentadores rasas, de modo a impedir que o local cirúrgico de fricção contra o alimentador. Os animais não devem ser deixados sozinhos ou devolvido à companhia de outros animais, até que recupere a consciência suficiente para manter decúbito esternal e apresentam movimento proposital. Esteiras de aquecimento deve ser colocado sob a metade da gaiola para até 2 dias durante a recuperação. </li><li> Para controlar a dor no pós-operatório, administrar cetoprofeno (5 mg / kg) por via subcutânea aos animais pela manhã e 1x por dia seguinte para até 48 horas pós-cirurgia. Animais também devem ser monitorados diariamente porsinais prolongados de dor, perda de peso ou infecções de sítio cirúrgico. </li></ol> 6. Medidas feridas subsequentes e troca de curativos <ol><li> Medir feridas isquémicas e não isquémicos frequentemente sob anestesia geral usando isoflurano a 3% -4% através de uma câmara de indução e mantido (através de um cone de nariz) a 1% -2% com O 2 como no passo 3.1. </li><li> Remover o penso suavemente a não puxar o adesivo da pele. Neste momento fotos digitais adicionais sejam tomadas para medições ferida, tratamentos tópicos reaplicado, o Doppler laser (LDI) ou outras manipulações realizadas para atender às necessidades do investigador. </li><li> Aplique o adesivo e um curativo limpo e permitir que o animal possa recuperar como no passo 5.1. </li></ol> 7. Wound Recolha e eutanásia <ol><li> Isquêmica Colheita e feridas não-isquêmicas (em dias o investigador considerar apropriada), enquanto o animal está sob anestesia geral com isoflurano em 3% -4% através de uma indução câmara e mantido (através de um cone de nariz) a 1% -2% com O 2 como no passo 3.1. </li><li> Utilizando um bisturi, fazer uma excisão em forma quadrada em torno da ferida para incluir algum tecido saudável em redor da ferida. Coloque a excisão em 1,5 ml de um tubo com tampa de encaixe e encaixe de congelação em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) para análise molecular futuro ou incubar em 10% de formalina tamponada O / N à temperatura ambiente durante o processamento histológico. NOTA: As excisões ferida também pode ser cortado pela metade para fornecer mais amostras para análise. </li><li> Após a remoção do tecido da ferida, a eutanásia do animal usando o método aprovado de inalação de CO 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+wound+repair:+Are+they+cutting+it.">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li><li>Dorsett-Martin, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+models+of+skin+wound+healing:+a+review.">Rat models of skin wound healing: a review.</a> Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 12 (6), 591-599 (2003).</li><li>Davidson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+wound+repair.">Animal models for wound repair.</a> Arch Dermatol Res. 290 (S1-11), (1998).</li><li>Finn, G., Magnus, S. A., Tonny, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+use+in+wound+healing+research:+A+survey+focusing+on+in+vitro+and+in+vivo+adult+soft+tissue).">Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue).</a> Wound Repair and Regeneration. 8, (2000).</li><li>Gould, L. J., Leong, M., Sonstein, J., Wilson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+validation+of+an+ischemic+wound+model.">Optimization and validation of an ischemic wound model.</a> Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 13 (6), 576-582 (2004).</li><li>Loots, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cellular+infiltrate+and+extracellular+matrix+of+chronic+diabetic+and+venous+ulcers+versus+acute+wounds.">Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds.</a> The Journal of investigative dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).</li><li>Schwartz, D. A., Lindblad, W. J., Rees, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+collagen+metabolism+and+delayed+healing+in+a+novel+model+of+ischemic+wounds.">Altered collagen metabolism and delayed healing in a novel model of ischemic wounds.</a> Wound Repair Regen. 3 (2), 204-212 (1995).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+mechanistic+validation+of+delayed+healing+rat+wounds+as+a+model+for+human+chronic+wounds.">Molecular and mechanistic validation of delayed healing rat wounds as a model for human chronic wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 7, (1999).</li><li>Zhang, Q., Chang, Q., Cox, R. A., Gong, X., Gould, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+attenuates+apoptosis+and+decreases+inflammation+in+an+ischemic+wound+model.">Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation in an ischemic wound model.</a> The Journal of investigative dermatology. 128 (8), 2102-2112 (2008).</li><li>Zhang, Q., Gould, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperbaric+oxygen+reduces+matrix+metalloproteinases+in+ischemic+wounds+through+a+redox-dependent+mechanism.">Hyperbaric oxygen reduces matrix metalloproteinases in ischemic wounds through a redox-dependent mechanism.</a> The Journal of investigative dermatology. 134 (1), 237-246 (2013).</li><li>Moor, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+age+on+ischemic+wound+healing+in+rats:+altered+antioxidant+activity+and+delayed+wound+closure.">Consequences of age on ischemic wound healing in rats: altered antioxidant activity and delayed wound closure.</a> Age (Dordrecht, Netherlands). 36 (2), 733-748 (2014).</li><li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+preclinical+model+of+chronic+ischemic+wound).">Characterization of a preclinical model of chronic ischemic wound).</a> Physiological genomics. 37 (3), 211-224 (2009).</li><li>Biswas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+inducible+microRNA+210+attenuates+keratinocyte+proliferation+and+impairs+closure+in+a+murine+model+of+ischemic+wounds.">Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6976-6981 (2010).</li><li>Winocour, S., Vorstenbosch, J., Trzeciak, A., Lessard, L., Philip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD109,+a+novel+TGF-beta+antagonist,+decreases+fibrotic+responses+in+a+hypoxic+wound+model.">CD109, a novel TGF-beta antagonist, decreases fibrotic responses in a hypoxic wound model.</a> Exp Dermatol. 23 (7), 475-479 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> A cicatrização de feridas em ratos tem sido muitas vezes objecto de debate, devido à sua capacidade de curar feridas infectadas e alta taxa de variabilidade interanimal 5. Um dos objetivos originais do modelo durante o seu desenvolvimento foi para diminuir essa variação. Modificações na largura do retalho, reduzindo o número de feridas com posicionamento específico (centrada na aba com localização crânio-caudal consistente) e introdução de uma folha de silicone tem conseguido esse objetivo...

Desenvolvimento de medicamentos eficazes e outras terapêuticas de cura de feridas requerem adequada em modelos in vivo, apesar dos problemas conhecidos em traduzir achados em modelos animais para terapias humanas 1. O que se segue é uma descrição de um protocolo detalhado para a utilização de um modelo de rato da cicatrização de feridas isquémico para investigar os mecanismos que ainda mais a compreensão da cicatrização de feridas patológico. As espécies de rato, muitas vezes empregadas devido à sua ampla disponibilidade, tamanho e natureza dócil é usado para estudos de cicatrização de feridas, pois é grande o suficiente para fornecer uma área de pele adequada para ferir incisional e excisional, imagem e coleta de tecido 2. No entanto, deve ser tido em consideração que o cuidado da pele de um rato e um ser humano são anatomicamente diferente, com ratos a ser referido como animais de pele soltas. Esta característica distinta permite a contração da ferida, ao invés de epithelialization de contribuir significativamente para o encerramento da pele do rato wounds 2. Além disso, a presença de um músculo panículo carnoso subcutânea em ratos, contribui para a cura por ambos contracção e formação de colagénio 3,4. Estas distinções anatómicas muito importantes que foram considerados no desenvolvimento do modelo de ferida cutânea do rato isquémica e modificações específicas foram implementadas para diminuir contracção da ferida e reduzir a influência do panículo carnoso muscular 5. Em úlceras de pé diabético, úlceras venosas e úlceras de pressão, a cura é atrasada e essas feridas são consideradas crônicas. As feridas são caracterizadas pela inflamação excessiva, o que impede a ferida de progredir para as próximas fases do reparo de feridas 6. Um dos principais factores no desenvolvimento de uma ferida crónica é localizada isquemia tecidual (fluxo sanguíneo reduzido) 5 contribui para a incapacidade para limpar a inflamação. No momento em que este modelo foi sendo desenvolvida e validada (em 2003-4), Não havia modelos animais padronizados que poderiam fornecer tecido suficiente para testar a indução de angiogênese no leito da ferida, um processo importante durante a cicatrização normal e a motivação para o desenvolvimento deste modelo 5. Dito isto, o modelo aqui apresentado é uma modificação do modelo de ferimento isquémico originalmente descrito por Schwartz et ai. 7 e posteriormente utilizado na forma modificada por Chen et al. 8 No modelo de ferida isquêmica modificado, as alterações foram feitas para contornar as características anatômicas mencionadas acima do rato que levam à cura pela contração ao invés de epithelialization: (1) duas feridas por excisão de espessura total são criadas dentro de uma aba e da pele dorsal bipediculado músculo panículo carnoso é removido do leito da ferida por meio de dissecção logo acima da fáscia muscular. (2) A aba em si tem dimensões mais estreitas, garantindo que o fornecimento de sangue é aleatório e as feridas localizadas no ponto central de tele aba são isquêmicos. (3) A folha de silicone é inserida abaixo da aba, impedindo readherence e reperfusão do retalho de tecido subjacente. Contração da ferida é limitada (não eliminados), ancorando ou suturar o retalho para a folha de silicone 5. O modelo foi recentemente utilizada em estudos que vão desde efeitos oxigênio hiperbárico sobre ferida isquêmica cura 9,10 para a cicatrização de feridas isquêmica em jovem contra ratos com idade entre 11 e provou ser um modelo confiável de isquemia tecidual prolongada. As dimensões da aba bipediculado também foram adaptados para diferentes estirpes de ratos, incluindo Sprague Dawley (11 cm de comprimento por 2 cm de largura) e ratos F344 (10.5 cm por 3,0-3,5 cm de largura) e outras espécies, incluindo ratos e porcos 12 13,14. Este vídeo utiliza o F344 estirpe, ratos na manifestação do modelo de pele ferida isquêmica. Aprovação para todos os procedimentos com animais apresentados a seguir foi obtered da Universidade do Comitê Animal Care do sul da Flórida (IACUC) e cumprir todas as exigências da Lei do Bem-Estar Animal e do Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sil-Tec medical grade sheeting</td>
			<td style="width:103px;">Technical Products Inc.</td>
			<td style="width:119px;">500-3</td>
			<td>nonreinforced, 0.01 inches in thickness</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Mini Iris scissors, 8cm, curved, SS</td>
			<td style="width:103px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">#503671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethilon Nylon Sutures</td>
			<td style="width:103px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">1964G</td>
			<td>black, size 4.0, PC-3 16mm needles (3/8 circle)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Laser Doppler Imager</td>
			<td style="width:103px;">Moor Instruments</td>
			<td style="width:119px;">moorLDI2-IR</td>
			<td>Standard blood flow imager: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:103px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;">free download</td>
			<td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mastisol</td>
			<td style="width:103px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">Cat # 7289210</td>
			<td>Fisher Scientific NC9774929</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Tegaderm</td>
			<td style="width:103px;">Medical Specialties&#160;</td>
			<td style="width:119px;">3M1624W</td>
			<td>Fisher Scientific NC9922128</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of the rat ischemic skin wound model

A propensão para feridas crônicas em humanos aumenta com a idade, condições de doenças como diabetes e função cardiovascular prejudicada e pressão unrelieved devido à imobilidade. Os modelos animais têm sido desenvolvidos que a tentativa para imitar estas condições para o propósito de promover a compreensão da complexidade de feridas crónicas. O modelo aqui descrito é um modelo de rato de isquemia aba de pele que permite uma redução prolongada do fluxo sanguíneo resultando em feridas que se tornam isquémica e se assemelham a um fenótipo ferida crónica (vascularização reduzida, aumento de inflamação e de encerramento de feridas retardada). Ele consiste de um retalho dorsal bipediculado com 2 feridas isquêmicas colocados centralmente e 2 feridas não-isquêmicas lateral à aba como controles. Uma nova adição a este modelo isquémico aba de pele é a colocação de uma folha de silicone sob a aba que funciona como uma barreira e uma tala para prevenir e reduzir a contração revascularização como as feridas cicatrizam. Apesar dodebate de usar ratos para estudos de cicatrização de feridas devido a suas diferenças anatômicas e fisiológicas bastante distintas em comparação com os seres humanos (ou seja, a presença de um músculo panniculus carnosus, curto tempo de vida, aumento do número de folículos pilosos, e sua capacidade de curar as feridas infectadas) as modificações empregadas neste modelo o tornam uma alternativa valiosa para modelos retalhos cutâneos isquêmicos anteriormente desenvolvidos.

O protocolo de rato modelo cura isquêmico ferida deve demorar cerca de 20 min por animal se realizada de forma eficiente. Antes da aplicação de um penso, o modelo deve aparecer como representado na Figura 1G. Será importante verificar que a aba e as feridas bipediculado aí são isquémicos. Tensão de oxigénio subcutânea (PSCO 2) ao nível das feridas foi medido durante a validação deste modelo 5, colocando um eléctrodo polarográfico no tecido subcutâneo entre os dois f...

Watch this Scientific Journal Video about Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model at JoVE.com

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

O rato, devido ao seu tamanho, disponibilidade e de comportamento e dócil, tem sido utilizada como um modelo de pesquisa durante muitos anos. O objetivo deste protocolo é para utilizar o rato como modelo isquêmico cura de feridas cutâneas de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia das feridas crônicas.

Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

demonstration-of-the-rat-ischemic-skin-wound-model

Research

JoVE Journal

Medicine

21.1K visualizações.  University of South Florida.  O rato, devido ao seu tamanho, disponibilidade e de comportamento e dócil, tem sido utilizada como um modelo de pesquisa durante muitos anos. O objetivo deste protocolo é para utilizar o rato como modelo isquêmico cura de feridas cutâneas de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia das feridas crônicas. 

Vídeo: Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Medicina

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work well in non-ischemic wounds may not work in human diabetic wounds because vasculopathy is one major factor that hinders healing of these wounds. We published an article in 2007 describing a rabbit ear ischemic wound model created by a minimally invasive surgical technique. Since then, we have further simplified the procedure for easier operation. On one ear, three small skin incisions were made on the vascular pedicles, 1-2 cm from the ear base. The central artery was ligated and cut along with the nerve. The whole cranial bundle was cut and ligated, leaving only the caudal branch intact. A circumferential subcutaneous tunnel was made through the incisions, to cut subcutaneous tissues, muscles, nerves, and small vessels. The other ear was used as a non-ischemic control. Four wounds were made on the ventral side of each ear. This technique produces 4 ischemic wounds and 4 non-ischemic wounds in one animal for paired comparisons. After surgery, the ischemic ear was cool and cyanotic, and showed reduced movement and a lack of pulse in the ear artery. Skin temperature of the ischemic ear was 1-10 &deg;C lower than that on the normal ear and this difference was maintained for more than one month. Ear tissue high-energy phosphate contents were lower in the ischemic ear than the control ear. Wound healing times were longer in the ischemic ear than in the non-ischemic ear when the same treatment was used. The technique has now been used on more than 80 rabbits in which 23 were diabetic (diabetes time ranging from 2 weeks to 2 years). No single rabbit has developed any surgical complications such as bleeding, infection, or rupture in the skin incisions. The model has many advantages, such as little skin disruption, longer ischemic time, and higher success rate, when compared to many other models. It can be safely used in animals with reduced resistance, and can also be modified to meet different testing requirements.

We have developed a minimally invasive technique to create a rabbit ischemic ear wound model by dividing the central artery and nerve and the cranial neurovascular bundle. A subcutaneous tunnel then cuts all subcutaneous tissues. This procedure causes minimal skin disruption and can be safely used in diabetic animals.

Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in 20091, 2. Several models of cerebral ischemia have been developed to mimic the human condition of stroke. It has been suggested that up to 80% of all strokes result from ischemic damage in the middle cerebral artery (MCA) area3. In the early 1990s, endothelin-1 (ET-1) 4 was used to induce ischemia by applying it directly adjacent to the surface of the MCA after craniotomy. Later, this model was modified 5 by using a stereotaxic injection of ET-1 adjacent to the MCA to produce focal cerebral ischemia. The main advantages of this model include the ability to perform the procedure quickly, the ability to control artery constriction by altering the dose of ET-1 delivered, no need to manipulate the extracranial vessels supplying blood to the brain as well as gradual reperfusion rates that more closely mimics the reperfusion in humans5-7. On the other hand, the ET-1 model has disadvantages that include the need for a craniotomy, as well as higher variability in stroke volume8. This variability can be reduced with the use of laser Doppler flowmetry (LDF) to verify cerebral ischemia during ET-1 infusion. Factors that affect stroke variability include precision of infusion and the batch of the ET-1 used6. Another important consideration is that although reperfusion is a common occurrence in human stroke, the duration of occlusion for ET-1 induced MCAO may not closely mimic that of human stroke where many patients have partial reperfusion over a period of hours to days following occlusion9, 10. This protocol will describe in detail the ET-1 induced MCAO model for ischemic stroke in rats. It will also draw attention to special considerations and potential drawbacks throughout the procedure.

Several animal models of cerebral ischemia have been developed to simulate the human condition of stroke. This protocol describes the endothelin-1 (ET-1) induced middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke in rats. In addition, important considerations, advantages, and shortcomings of this model are discussed.

Endotelina-1 Induzida Médio modelo de oclusão da artéria cerebral para AVC isquêmico com Laser Orientação Fluxometria Doppler em ratos

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Modelo Murino de Cicatrização

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are still occurring, particularly in reconstructive flap surgery. Multiple experimental flap models have been developed to analyze underlying causes and mechanisms and to investigate treatment strategies to prevent ischemic complications. The limiting factor of most models is the lacking possibility to directly and repetitively visualize microvascular architecture and hemodynamics. The goal of the protocol was to present a well-established mouse model affiliating these before mentioned lacking elements. Harder et al. have developed a model of a musculocutaneous flap with a random perfusion pattern that undergoes acute persistent ischemia and results in ~50% necrosis after 10 days if kept untreated. With the aid of intravital epi-fluorescence microscopy, this chamber model allows repetitive visualization of morphology and hemodynamics in different regions of interest over time. Associated processes such as apoptosis, inflammation, microvascular leakage and angiogenesis can be investigated and correlated to immunohistochemical and molecular protein assays. To date, the model has proven feasibility and reproducibility in several published experimental studies investigating the effect of pre-, peri- and postconditioning of ischemically challenged tissue.

The window of the murine dorsal skinfold chamber presented visualizes a zone of acute persistent ischemia of a musculocutaneous flap. Intravital epi-fluorescence microscopy permits for direct and repetitive assessment of the microvasculature and quantification of hemodynamics. Morphologic and hemodynamic results can further be correlated with histological and molecular analyses.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Um modelo de pele Rato Fetal de reparação de feridas Scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Rat Model of Photochemically-Induced Posterior Ischemic Optic Neuropathy

Posterior Ischemic optic neuropathy (PION) is a sight-devastating disease in clinical practice. However, its pathogenesis and natural history have&#160;remained poorly understood. Recently, we developed a reliable, reproducible animal model of PION and tested the treatment effect of some neurotrophic factors in this model1. The purpose of this video is to demonstrate our photochemically induced model of posterior ischemic optic neuropathy, and to evaluate its effects with retrograde labeling of retinal ganglion cells. Following surgical exposure of the posterior optic nerve, a photosensitizing dye, erythrosin B, is intravenously injected and a laser beam is focused onto the optic nerve surface. Photochemical interaction of erythrosin B and the laser during irradiation damages the vascular endothelium, prompting microvascular occlusion mediated by platelet thrombosis and edematous compression. The resulting ischemic injury yields a gradual but pronounced retinal ganglion cell dieback, owing to a loss of axonal input - a remote, injury-induced and clinically relevant outcome. Thus, this model provides a novel platform to study the pathophysiologic course of PION,&#160;and can be further optimized for testing therapeutic approaches for optic neuropathies as well as other CNS ischemic diseases.

The goal of this protocol is to photochemically induce ischemic injury to the posterior optic nerve in rat. This model is critical to studies of the pathophysiology of posterior ischemic optic neuropathy, and therapeutic approaches for this and other optic neuropathies, as well as of other CNS ischemic diseases.

Modelo de Rato Induzida fotoquimicamente posterior neuropatia óptica isquémica

Posterior Ischemic optic neuropathy (PION) is a sight-devastating disease in clinical practice. However, its pathogenesis and natural history ...

A Piglet Model of Neonatal Hypoxic-Ischemic Encephalopathy

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the world&#8217;s 2.9 million neonatal deaths. Animal models of HIE have contributed to the understanding of the pathophysiology in HIE, and have highlighted the dynamic process that occur in brain injury due to perinatal asphyxia. Thus, animal studies have suggested a time-window for post-insult treatment strategies. Hypothermia has been tested as a treatment for HIE in pdiglet models and subsequently proven effective in clinical trials. Variations of the model have been applied in the study of adjunctive neuroprotective methods and piglet studies of xenon and melatonin have led to clinical phase I and II trials1,2. The piglet HIE model is further used for neonatal resuscitation- and hemodynamic studies as well as in investigations of cerebral hypoxia on a cellular level. However, it is a technically challenging model and variations in the protocol may result in either too mild or too severe brain injury. In this article, we demonstrate the technical procedures necessary for establishing a stable piglet model of neonatal HIE. First, the newborn piglet (&#60; 24 hr old, median weight 1500 g) is anesthetized, intubated, and monitored in a setup comparable to that found in a neonatal intensive care unit. Global hypoxia-ischemia is induced by lowering the inspiratory oxygen fraction to achieve global hypoxia, ischemia through hypotension and a flat trace amplitude integrated EEG (aEEG) indicative of cerebral hypoxia. Survival is promoted by adjusting oxygenation according to the aEEG response and blood pressure. Brain injury is quantified by histopathology and magnetic resonance imaging after 72 hr.

Hypoxic-ischemic encephalopathy following perinatal asphyxia can be studied using animal models. We demonstrate the procedures necessary for establishing a piglet model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Um Modelo de Leitão Neonatal encefalopatia hipóxico-isquêmica

Birth asphyxia, which causes hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), accounts for 0.66 million deaths worldwide each year, about a quarter of the ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

O modelo de roedor de nonarterítica óptica isquêmica anterior Neuropatia (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...