Agradecemos Katharina Haberland para edição de imagem. Financiamento: O autor sênior recebeu uma KKF Grant da Technische Universität München a criação de um novo laboratório de pesquisa.

NOTA: Antes da implementação do modelo apresentado, as leis de proteção animal correspondente deve ser consultado e permissão deve ser obtida junto das autoridades locais. Neste trabalho, todos os experimentos foram realizados em conformidade com os princípios orientadores para animais de pesquisa envolvendo e da legislação alemã sobre a protecção dos animais. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais local. 1. Preparação Animal e elevação cirúrgica da Flap <ol style="margin-left: 40px;"><li> Manter os animais em gaiolas individuais à temperatura ambiente de 22-24 ° C e a uma humidade relativa de 60-65%, com um ciclo de dia e noite de 12 horas. Permitir o livre acesso à água potável ratos e ração padrão de laboratório. Sempre manter condições estéreis durante a cirurgia sobrevivência. </li><li> Anestesiar o rato por via intraperitoneal (ip), a injecção de 0,1 ml de solução salina por 10 g de peso corporal, contendo 90 mg / kg de peso corporal de cloridrato de cetamina e 25 mg /kg de cloridrato de bw dihydroxylidinothiazine. A anestesia é necessário para a preparação dos animais, cirurgia e microscopia subsequente. Confirme anesthetization adequada, verificando a resposta a um estímulo doloroso. Durante o tempo de anestesia, aplique pomada veterinário sobre os olhos para evitar o ressecamento. </li><li> Após a indução da anestesia suficiente, depilar as costas com um barbeador elétrico. A partir de agora, aplicar a depilação creme para a área raspada para remover o cabelo restante. </li><li> Durante o tempo de permanência do creme de depilação de ~ 7-10 min, preparar instrumentos, incluindo fórceps de pele e micro fórceps, tesouras e micro tesouras, material de sutura e uma caneta. Desinfetar e preparar a câmara de titânio, aplicando os parafusos com a porca na base da câmara e pela fixação de espuma auto-adesiva (Fig. 1 AC) em torno da janela de contrapartida da câmara para garantir a estanquidade do sistema de câmara. </li><li> Remova todo o creme de depilação da parte traseira por lavagemlo com água morna. Em seguida, secar e desinfectar a pele com uma solução contendo álcool. </li><li> Posicione o mouse na posição prona e definir a linha média das costas. Segure a pele central e levante-o para criar uma dobra (Fig. 2A). Por trans-iluminação usando qualquer tipo de fonte de luz, decidir onde colocar provisoriamente a armação de titânio (Fig. 2B). Certifique-se de que os ramos distais da artéria torácica lateral (LTA) cranial e artéria ilíaca profunda circunflexo (DCIA) caudal curso através do centro da janela da câmara (Fig. 2B-D). Uma vez que o posicionamento da câmara é feito, ambas as camadas de perfurar a pele na parte inferior da prega de fixação posterior da armação de titânio. Agora retire a armação de titânio, coloque o mouse na posição prona e redefinir a linha média das costas, se necessário. </li><li> Esboço da aba perpendicular à lombada começando na linha média com uma relação entre largura e comprimento de 15 x 11 milímetro para resultar em uma aba lateral e perfundidos com base aleatoriamente. Em seguida, delinear uma área adicional de pele de 2 milímetros estendendo-se para o lado contralateral (Fig. 2C, D). Esta área é captado com os fórceps e depois suturado à armação de titânio, sem interferir com a área aba visível. </li><li> Após a última marcação, inciso do retalho. Ao fazê-lo, tanto o LTA transecção e DCIA e elevar a aba (Fig. 2E). Não há necessidade para a coagulação ou a ligadura dos vasos seccionados. </li><li> Coloque o parafuso da câmara através das perfurações da pele feitas anteriormente (Fig. 2F) e fixar a dobra cutânea tanto anteriormente quanto posteriormente dentro do quadro da câmara do retalho elevado para a parte traseira do quadro usando os buracos de armação da câmara e um 5-0 suturas interrompidas (Fig. 2G). </li><li> Suturar os membros verticais da aleta traseira para a pele circundante por meio de 5-0 interrompidas ( <strong&gt; fig. 2H, I). </li><li> Extirpar uma área de hemi-circular de pele de lateral para a pequena tira de pele de 2 mm, isto é, no outro lado da aba de observar vasculatura da aba. Isto permite vista directa através da janela de observação da câmara que tem uma superfície de 90 mm, 2. </li><li> Remover o tecido areolar frouxo gelatinoso do músculo estriado utilizando instrumentos de microcirurgia e lente de ampliação óptica ou microscópio a fim de melhorar a qualidade da imagem durante a microscopia. Tente não danificar os vasos dentro das camadas do tecido muscular. </li><li> Finalmente, vedar a câmara através da montagem do homólogo do quadro que tenha sido previamente dotado com tiras auto-aderente de espuma anteriormente, cranialmente e posteriormente, borrifar a aba com bisbenzimida tópica e solução salina (Fig. 2J). Depois disso, aplique a janela de observação com uma tampa de vidro usando um anel de pressão. Tente não prender quaisquer bolhas de ar sob o vidro (Fig. 2 K, L). A pele vai aderir ao vidro da tampa por forças de adesão. </li></ol> 2. Intravital epifluorescência Microscopia <ol style="margin-left: 40px;"><li> Espere 24 horas após o preparo cirúrgico para a primeira análise microscópica de qualidade óptica ideal. Esta análise representa a linha de base de microscopia e é repetido nos dias 3, 5, 7 e 10 após a cirurgia. Cada tempo, anestesiar o rato, tal como descrito na etapa 1.2. Colocar o animal em posição de decúbito lateral sobre um portador de acrílico feito sob medida. Dessa forma, as camadas do tecido muscular do retalho aderindo ao vidro da tampa estão enfrentando up-alas. </li><li> Injetar 0,05 ml de 5% dextrano verde fluorescente (peso molecular 150.000) e 0,05 ml de 1% de corante altamente fluorescente família Rhodamine em uma veia da cauda ou do plexo venoso retro-bulbar. O dextrano verde fluorescente mancha as componentes não celulares do sangue, se aplicado por via intravenosa (iv). O fluorescente rodamina manchas leucócitos e plaquetas, que pode ser distinguished de outros componentes celulares e não celulares. Finalmente, bisbenzimida manchas componentes nucleares que emitem fluorescência mais ou menos de acordo com o estado de condensação. </li><li> Subsequentemente, colocar o rato sob o microscópio. Certifique-se o microscópio inclui um sistema de LED - combinações de feixe de LED para 470 e 425 nm, 365 nm e 490, e 540 e 580 nm, bem como os conjuntos de filtros correspondentes (62 HE PBF / GFP / HcRed, faixa de 1: 350-390 nm comprimento de onda de excitação, dividir 395 nm / 402-448 nm; faixa 2: 460-488 nm, 495 nm dividida / 500-557 nm; faixa 3: 567-602 nm, 610 nm dividida / 615 nm para 20 Rhodamine infinito, alcance. : 540-552 nm, 560 nm dividida, emissão 575-640 nm). </li><li> Grave as fotos e filmes-retratos usando uma câmera de vídeo de carga acoplada dispositivo e salvá-los em um disco rígido de computador para análise posterior off-line. </li><li> Use diferentes objectivos (2.5X, NA (abertura numérica) = 0,06 para vistas panorâmicas da câmara; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) para as gravações das regiões de interesse. </li><li> Virtualmente, pode dividir a superfície da aba que é visível através da janela da câmara em três áreas da mesma altura, ou seja, uma extremidade proximal, uma central e uma zona distal mais afastada do fluxo vascular (Fig. 3F). Para aquisição de imagem, proceda da seguinte maneira em cada momento de observação: <ol><li> Digitalize a imagem do tecido por imagem dentro da janela da câmara de proximal para distal com o objetivo de 5X. </li><li> Em cada área do retalho, selecione arteríolas de segunda ou terceira ordem e seus acompanhantes vênulas com padrões de ramificação facilmente identificáveis. Usando o objectivo 5X, 10X, 20X ou, fazer impressões dos feixes arteriolovenular, a fim de re-localizar facilmente os pacotes ao longo de todo o período de observação. </li><li> Com o objetivo de 20X e 50X o objetivo, mais registro 5-6 campos capilares e &quot;apoptótica&quot;campos por área do retalho, respectivamente. Todas as imagens gravadas com a 10X e 20X objetivos usar a luz azul (dextrano fluorescente) ea luz verde (rodamina) filtro, enquanto que as imagens gravadas com o 5X e 50X uso objetivo luz azul (dextran fluorescentes) e luz branca (Bisbenzamida) filtro, respectivamente . </li></ol></li></ol> 3. Análise dos dados registrados NOTA: Com a utilização de um sistema de análise de imagem assistida por computador quantificar todos os parâmetros gravados fora de linha 29 como se segue. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Medição da área de não-perfundido, respectivamente tecido necrótico (mm 2). <ol><li> Use a imagem completa câmara digitalizados janela gravado com o objetivo de 5X (de 2.6.1) eo dextrano fluorescente para medir o tecido não-perfundidos respectivamente necrosado. Use a função &quot;AreaBo&quot; para medir a área não-perfundidos escuro: Beira da área não-perfusão e calcular a área em mm 2 por meio da área de algoritmos de medição do software. </li></ol></li><li> A medição do diâmetro microvascular em arteríolas, capilares e vénulas (um). <ol><li> Carga de vídeo ou fotos dos AV-feixes gravadas ou os campos capilares para o software. Para melhores resultados, use as fotos ou vídeos com a maior ampliação onde as fronteiras definitivas do navio são claramente visíveis. </li><li> Use a função &quot;DiamPe&quot; do software para certificar-se as medições são realizadas perpendicular à parede do vaso. Para fazê-lo marcar dois pontos sobre a parede do vaso e com o terceiro marca clique o diâmetro perpendicular do navio. O software irá executar a medição im. </li><li> Repita as medições sobre as mesmas para todas as gravações de vasos no mesmo local. Medir múltiplos capilares para acumular diâmetro médio. </li></ol></li><li> Análise de células do sangue (RBC) velocidade vermelho nas arteríolas, capilares umand vénulas (mm / seg). <ol><li> Para arteriolar células do sangue (RBC) velocidade vermelho (mm / s) medições de usar a função &quot;VeloLSD&quot; do software e escolher os mesmos vasos na janela dextrano fluorescente para que os diâmetros foram medidos. </li><li> Analise-o com o sistema de análise de imagem assistida por computador, utilizando o método do deslocamento de linha, que está na base da medição do deslocamento (mm) de um padrão individual intravascular nível de cinza ao longo do tempo (seg). </li></ol></li><li> Quantificação do fluxo volumétrico em vasos (pl / seg). <ol><li> Calcular o fluxo volumétrico do sangue (pl / seg) em arteríolas, vénulas e capilares a partir da área de corte transversal do navio e da velocidade de RBC (π * r 2) de acordo com a equação de Gross e Aroesty, isto é, Q = V * r * 2 π , assumindo uma forma cilíndrica vaso 30. </li></ol></li><li> A medição da densidade capilar funcional de capilares RBC-perfundidos (perfusão nutritivo: cm / cm <sup&gt; 2). <ol><li> Coloque um campo capilar fluorescente gravado com ampliação de 20x objetivo para o software. Use a função &quot;DensLA&quot; para medir a densidade capilar funcional de microvasos RBC-perfundidos. </li><li> Trace os capilares perfundidos com o cursor e marcar os vasos perfundidos. Não marcar não-perfundidos capilares arteríolas ou vênulas. O software irá medir a densidade capilar funcional dos capilares perfundidos em cm / cm 2. Repita os passos para os outros campos capilares gravados. </li></ol></li><li> A medição da tortuosidade dos microvasos (remodelamento microvascular), os primeiros sinais de angiogênese, como raiz e broto-formação e microvasos recém-formados. <ol><li> Carregar vídeos gravados ou quadros de campos capilares fluorescentes no software. Identificar vasos gyrose e usar a função &quot;TorqIx&quot; do software. Trace o fluxo do vaso definitivo com o curso e terminam com um clique direito. O software irádesenhar uma linha reta para a forma direta e vai colocá-lo em relação com o caminho traçado. NOTA: Esteja atento aos sinais da angiogênese, como brotos, brotos e capilares recém-formados, que normalmente emanam perpendicularmente dos capilares pré-existentes. Medir a densidade destes vasos recém-formados, tal como descrito na etapa 3.5. </li></ol></li><li> Identificação das características de morte celular por apoptose, tais como a condensação nuclear, fragmentação e / ou marginalização (células / mm 2). <ol><li> Coloque vídeos Bisbenzamida-gravados (objetiva 50X) para o software. Use a função &quot;DenseNA&quot;. Marque células em apoptose de acordo com as características mencionadas, tais como a condensação nuclear, fragmentação e marginalização com um clique esquerdo. </li><li> Depois de marcar todas as células característicos de todo o vídeo, clique em &quot;N / A&quot; no software, que contará automaticamente todas as células marcadas e dividi-lo em toda a área. O resultado será apoptóticacélulas / mm 2. </li></ol></li><li> Análise de aderência de leucócitos ao endotélio vascular representando a inflamação. Adesão intermitente de leucócitos (leucócitos rolando; adesão &lt;30 sec: número de rolos mm superfície endotelial / 2) e firme adesão de leucócitos (leucócitos degola; adesão&gt; 30 seg: número de etiquetas / mm 2 de superfície endotelial). <ol><li> Analisar a resposta inflamatória através da contagem do número de leucócitos Rodamina que aderiram ao revestimento endotelial das vénulas pós-capilares por um período de tempo de ≥30 seg (&quot;adesivos&quot;) e os leucócitos que aderem de forma intermitente marcado (&lt;30 seg, &quot;rolos&quot;) . Venular a adesão de leucócitos é expresso em células por mm2 da superfície endotelial. </li></ol></li><li> A medição dos níveis de cinza intravasculares e intersticiais, como parâmetro de vazamento microvascular (macromolecular extravasamento E = E1 / E2). <ol><li> Avaliar macromolecular leakage como um parâmetro de permeabilidade microvascular após uma injecção intravenosa de um dextrano fluorescente. Densitometricamente determinar vários níveis de cinzento do tecido directamente adjacente à parede do vaso capilar (E1), bem como no plasma isento de células marginal do recipiente (E2). Em seguida, calcular o extravasamento macromolecular (E) é a relação de E1 / E2 31. </li></ol></li></ol> 4. Cuidados Pós-Operatórios <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retorne o animal em uma gaiola separada para evitar a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Monitorar os animais diariamente para o sangramento, local e sinais sistêmicos de infecção ea posição da câmara. </li><li> Avaliar o estado geral do animal, observando a atividade motora, o peso corporal, os sinais de dor, tolerância ao vestir e auto-mutilação. </li><li> Manter a ratinhos um por gaiola para evitar mutuai manipulação da câmara. A qualquer sinal de dor, aplicar buprenorfina numa dose de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea, em intervalos de 8 h. </li></ol> 5. Eutanásia e explantes da Câmara Skinfold <ol style="margin-left: 40px;"><li> No dia 10, sacrificar os animais utilizando uma dose letal de uma droga anestésica (150 mg / kg de pentobarbital). </li><li> Retire a câmara e provar o tecido aba para ensaios de proteína de imunohistoquímica e molecular. Tecidos de amostra para histologia convencional (formol) e ensaios de proteína quantificáveis ​​(nitrogênio líquido ou gelo seco). </li></ol>

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F., Harder, Y., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-acetylcysteine+attenuates+leukocytic+inflammation+and+microvascular+perfusion+failure+in+critically+ischemic+random+pattern+flaps.">N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps.</a> Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).</li><li>Rezaeian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ghrelin+protects+musculocutaneous+tissue+from+ischemic+necrosis+by+improving+microvascular+perfusion.">Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).</li><li>Rezaeian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+preconditioning+with+Erythropoietin+reduces+ischemia-induced+skin+necrosis.">Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis.</a> Microcirculation. , (2013).</li><li>Harder, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+preconditioning+reduces+ischemic+tissue+necrosis+by+heat+shock+protein+(HSP)-32-mediated+improvement+of+the+microcirculation+rather+than+induction+of+ischemic+tolerance.">Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance.</a> Ann Surg. 242, 869-878 (2005).</li><li>Tobalem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+shockwave-induced+capillary+recruitment+improves+survival+of+musculocutaneous+flaps.">Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps.</a> J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).</li><li>Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+for+studying+the+revascularization+of+skin+grafts+in+vivo:+the+role+of+angiogenesis.">A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis.</a> Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).</li><li>Schweizer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+hemodynamics+during+vascular+regeneration+in+critically+ischemic+murine+skin+studied+by+intravital+microscopy+techniques.">Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques.</a> Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).</li><li>Klyscz, T., J&#252;nger, M., Jung, F., Zeintl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+image&#8212;a+new+kind+of+computer-assisted+video+image+analysis+system+for+dynamic+capillary+microscopy.">Cap image&#8212;a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy.</a> Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).</li><li>Gross, J. F., Aroesty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+models+of+capillary+flow:+a+critical+review.">Mathematical models of capillary flow: a critical review.</a> Biorheology. 9, 225-264 (1972).</li><li>Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+ischemiareperfusion+injury+in+striated+muscle:+significance+of+&#8216;reflow+paradox.">Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of &#8216;reflow paradox.</a> Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).</li></ol>

A fim de diminuir complicações isquêmicas e, assim, melhorar o resultado clínico, é necessário um conhecimento mais detalhado dos processos fisiopatológicos em tecido aba criticamente perfundido. O desenvolvimento de novos modelos animais que imitam isquemia aguda persistente, por conseguinte, é obrigatória. Consequentemente, fomos capazes de desenvolver um modelo facilmente reprodutível e fiável que permita a avaliação morfológica em tempo real, dinâmica e funcional repetitiva de vários parâmetros do m...

Cobertura de material de tendão, osso e implante exposto em cirurgia reconstrutiva depende da utilização de abas. Uma aba é um bloco de tecido que é transferido no seu pedículo vascular que garante influxo arterial e retorno venoso. Apesar da perícia e da ampla disponibilidade de uma variedade de abas sejam transferidos, complicações induzidas por isquemia que variam de desagregação da ferida para a perda de tecido total ainda são encontrados. Considerando o tratamento conservador e cicatrização por segunda intenção pode ser esperada após necrose do tecido menor, necrose significativa geralmente requer revisão cirúrgica, incluindo desbridamento, condicionamento de feridas e reconstrução secundária. Isso aumenta a morbidade, prolonga a internação e, conseqüentemente, leva ao aumento dos custos de cuidados de saúde. As abas com um padrão indefinido de vasculatura ou áreas perfundidos aleatoriamente na zona distal mais afastada do influxo arterial são particularmente propensas a danos isquémico. Acco<html> rdingly, numerosos estudos experimentais e clínicos têm avaliado o desenvolvimento de necrose em ambos, retalhos de padrão axial (fornecimento de sangue definido) e retalhos de padrão aleatório (fornecimento de sangue indefinido) 3/1. As principais conclusões são comumente baseado na avaliação macroscópica do tamanho da área de necrose. A fim de avaliar as causas e os mecanismos da necrose tissular em mais pormenor, vários estudos concentraram-se na análise da microcirculação. Diferentes técnicas têm sido usadas para medir a perfusão tecidual, incluindo a análise da tensão de oxigênio nos tecidos utilizando eletrodos polarográficas 05/04, bem como a medição do fluxo de sangue utilizando dopplerfluxometria a laser 6-7, corante difusão 8, e microesferas 10/09. Estas técnicas, no entanto, só permitem a medição de parâmetros indiretos de perfusão tecidual e não permitir qualquer análise morfológica dos processos microhemodynamic dentro de uma área individual de interesse de um retalho. t &quot;&gt; Sandison é conhecida por ser a primeira que tenha usado uma câmara transparente prolongada para estudos in vivo, o que ele realizados em coelhos 11 Em 1943 -. cerca de 20 anos mais tarde - Algire foi o primeiro a se adaptar uma câmara, de modo transparente para ser aplicável em camundongos, a fim de estudar o comportamento de micro-implantes de células tumorais 12. Devido ao fato de que os ratos são os chamados animais de pele solta e depois de alguns aperfeiçoamentos técnicos ao longo dos anos seguintes, Lehr e colegas de trabalho foram capazes de adaptar tais uma câmara de dobras cutâneas dorsal desenvolver uma câmara de titânio menor e mais leve. Esta câmara permitiu a avaliação em microscopia de fluorescência intravital, uma técnica que permite a visualização direta e repetitiva de uma série de características morfológicas e da microcirculação e suas mudanças ao longo do tempo, em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas, tais como a lesão de isquemia-reperfusão 13. Na investigação de perfusion de pele, músculo e osso abas em condições normais e patológicas duas tendências ocorreu: Em primeiro lugar, os modelos aba &quot;aguda&quot; que não usam a câmara prega dorsal, como a aba lateral pediculado no camundongo 14, o retalho ilha da pele com base lateralmente no hamster 15 e do retalho pediculado composto em ratos 16. Em segundo lugar, o modelo flap &quot;crônica&quot;, onde a combinação de um retalho com dobras cutâneas dorsal licenças de câmara microcirculação repetitivo análises ao longo de vários dias, com a microscopia de fluorescência intravital. É constituída por uma aba musculocutaneous perfundido aleatoriamente, que está integrado na câmara de dobra cutânea do rato 17. Sua relação largura-comprimento foi escolhido que uma situação de isquemia aguda persistente consistentemente resulta em ~ 50% necrose tecidual aba 10 a 14 dias após a elevação do retalho. Esta medida reprodutível de necrose do tecido permite uma avaliação mais aprofundada de ambos, de proteção (ou seja, o desenvolvimento de less necrose) e factores prejudiciais (isto é, o desenvolvimento de mais de necrose) no fisiopatologia aba. Durante os últimos anos, várias publicações experimentais que demonstrem o efeito do pré-diferente, os procedimentos pós-condicionado, incluindo a administração de substâncias de tecido de proteção 18-24 e aplicação local de estressores fisiológicos, tais como calor e ondas de choque 25 26 peri e, têm surgido. As análises quantitativas de necrose, morfologia microvascular e parâmetros da microcirculação pode ainda ser correlacionada com as análises de imuno-histoquímica e testes de proteína. Proteínas e moléculas diferentes, incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), sintases de óxido nítrico (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) e proteínas de choque térmico (HSP-32: heme oxigenase-1 (HO-1) e HSP- 70) tem mostrado desempenhar um papel na protecção dos tecidos. Com base neste modelo aba câmara, duas modificações têm sido desenvolvidos na order para analisar a neovascularização ea microcirculação da pele durante o enxerto cura 27 e desenvolvimentos angiogênicos em um retalho pediculado com padrão axial perfusão 28. Nós apresentamos um modelo reprodutível e confiável, que inclui uma aba musculocutaneous isquemicamente desafiado na câmara de rato de dobras cutâneas. Este modelo permite a visualização e quantificação da microcirculação e hemodinâmica por microscopia de epi-fluorescência intravital.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1611">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"><a name="RANGE!A1:D55">Name of Reagent/ Equipment</a></td>
			<td style="width:244px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:931px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g</td>
			<td style="width:244px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">depilation cream</td>
			<td style="width:244px;">Veet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any depilation cream</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">titanium chamber</td>
			<td style="width:244px;">Irola</td>
			<td align="right" style="width:119px;">160001</td>
			<td>Halteblech M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">slotted cheese head screw</td>
			<td style="width:244px;">Screws and More</td>
			<td align="right">842210</td>
			<td>DIN84 M2x10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">hexagon full nut</td>
			<td style="width:244px;">Screws and More</td>
			<td align="right">93422</td>
			<td>DIN934 M2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">snap ring</td>
			<td style="width:244px;">Schaefer-Peters</td>
			<td align="right">472212</td>
			<td>DIN472 J12x1,0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">cover glass</td>
			<td style="width:244px;">Volab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>custom-made cover glass 11,8mm in diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">fixing foam</td>
			<td style="width:244px;">tesamoll</td>
			<td>05559-100</td>
			<td>tesamoll Standard I-Profile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:244px;">Parke Davis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Ketavet&#174;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">dihydroxylidinothiazine hydrochloride</td>
			<td style="width:244px;">Bayer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Rompun&#174;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Buprenorphin</td>
			<td style="width:244px;">Essex Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Temgesic&#174;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Saline 0,9%</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">desinfection alcohol</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Vicryl 5-0</td>
			<td style="width:244px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">V 490 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Ethilon 5-0</td>
			<td style="width:244px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">EH 7823 H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">surgical skin marker with flexible ruler</td>
			<td style="width:244px;">Purple surgical</td>
			<td>PS3151</td>
			<td>any surgical skin marker and flexible ruler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">pointed scissors</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Micro-Scissors</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">normal scissors</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">2 clamps</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">fine anatomic forceps</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">micro-forceps</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">hex nuter driver</td>
			<td style="width:244px;">wiha</td>
			<td>1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">screwdriver</td>
			<td style="width:244px;">wiha</td>
			<td style="width:119px;">685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">snap ring plier</td>
			<td style="width:244px;">Knipex</td>
			<td style="width:119px;">4411J1</td>
			<td>12-25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">wire cutter</td>
			<td style="width:244px;">Knipex</td>
			<td style="width:119px;">70 02 160</td>
			<td>Wire cutter is used to cut screws short; 160mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">trans-illumination light</td>
			<td style="width:244px;">IKEA</td>
			<td>501.632.02</td>
			<td>LED light Jansj&#246;; any light&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">magnification glasses</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">intravital microscope</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>490035-0001-000</td>
			<td>Scope.A1.Axiotech</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">LED system</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>423052-9501-000</td>
			<td>Colibri.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">LED module 365nm</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>423052-9011-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">LED module 470nm</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>423052-9052-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">LED module 540-580nm</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>423052-9121-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>489062-9901-000</td>
			<td>range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Filter set 20 Rhodamine</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>485020-0000-000</td>
			<td>540-552nm, split 560, emission 575-640nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">2,5x objective NA=0,06</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>421020-9900-000</td>
			<td>A-Plan 2,5x/0.06</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">5x objective NA=0,16</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>420330-9901-000</td>
			<td>EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">10x objetive NA=0,30</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>420340-9901-000</td>
			<td>EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">20x objective NA=0.50</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>420350-9900-000</td>
			<td>EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">50x objective NA=0,55</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td>422472-9960-000</td>
			<td>LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">ZEN imaging software</td>
			<td style="width:244px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ZenPro 2012</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">CapImage</td>
			<td style="width:244px;">Dr. Zeintl</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Fluorescein isothiocyanate-dextran</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">45946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">bisBenzimide H 33342 trihydrochloride</td>
			<td style="width:244px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B2261</td>
			<td>harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Rhodamine 6G chloride</td>
			<td style="width:244px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">R634</td>
			<td>harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:319px;"></td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;">Pentobarbital</td>
			<td style="width:244px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Narcoren&#174;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ischemic tissue injury in the dorsal skinfold chamber of the mouse: a skin flap model to investigate acute persistent ischemia

Apesar de profunda experiência e técnicas cirúrgicas avançadas, complicações induzidas por isquemia que variam de quebra ferida à extensa necrose dos tecidos ainda estão ocorrendo, particularmente na cirurgia de retalho reconstrutiva. Vários modelos experimentais de aba ter sido desenvolvido para analisar mecanismos e causas subjacentes e para investigar as estratégias de tratamento para prevenir complicações isquémicas. O fator limitante de a maioria dos modelos é a possibilidade de falta direta e repetidamente visualizar a arquitetura microvascular e hemodinâmica. O objetivo do protocolo é apresentar um modelo de rato bem estabelecida filiar esses elementos que faltam antes mencionados. Mais difícil et ai. Desenvolveram um modelo de uma aba musculocutaneous com um padrão aleatório de perfusão que sofre de isquemia e os resultados persistente aguda em ~ 50% de necrose depois de 10 dias se mantido não tratado. Com o auxílio de microscopia de epi-fluorescência intravital, este modelo de câmara permite a visualização repetitiva demorfologia e hemodinâmica em diferentes regiões de interesse ao longo do tempo. Processos associados, tais como apoptose, inflamação, o vazamento microvascular e angiogênese pode ser investigado e correlacionados com ensaios de proteína imuno-histoquímica e molecular. Até o momento, o modelo provou viabilidade e reprodutibilidade em vários estudos experimentais publicados que investigam o efeito do pré, peri e pós-condicionamento de tecido isquemicamente desafiado.

Necrose O principal desfecho deste modelo - a necrose do tecido seguinte elevação do retalho (ou seja, a indução de isquemia aguda persistente) - é repetidamente medido e ilustrado macroscopicamente como mostrado na Figura 3 ao longo de um período de 10 dias. Demarcação final de área de necrose geralmente ocorre entre os dias 5 e 7 após a cirurgia e é caracterizada por uma franja vermelho, isto é, zona de vasodilatação e remod...

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Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

ischemic-tissue-injury-dorsal-skinfold-chamber-mouse-skin-flap-model

Research

JoVE Journal

Medicine

16.6K visualizações.  Technische Universität München.  A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares. 

Vídeo: Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite tissue. Ischemia reperfusion injury (IRI) is a known cause of partial free flap failure and has no effective treatment. Establishing a laboratory model of this injury can prove costly both financially as larger mammals are conventionally used and in the expertise required by the technical difficulty of these procedures typically requires employing an experienced microsurgeon. This publication and video demonstrate the effective use of a model of IRI in rats which does not require microsurgical expertise. This procedure is an in situ model of a transverse abdominis myocutaneous (TRAM) flap where atraumatic clamps are utilized to reproduce the ischemia-reperfusion injury associated with this surgery. A laser Doppler Imaging (LDI) scanner is employed to assess flap perfusion and the image processing software, Image J to assess percentage area skin survival as a primary outcome measure of injury.

In situ Transverse Rectus Abdominis Myocutaneous Flap: A Rat Model of Myocutaneous Ischemia Reperfusion Injury

Free tissue transfer is widely employed in reconstructive surgery to restore form and function following oncological resection and trauma. Preconditioning this tissue prior to surgery may improve outcome. This article describes an in situ transverse rectus abdominis myocutaneous flap (TRAM) in rats as a means for testing preconditioning strategies.

In situ transversal reto abdominal miocutâneo: um modelo de rato de miocutâneo Isquemia Traumatismo por Reperfusão

Free tissue transfer is the gold standard of reconstructive surgery to repair complex defects not amenable to local options or those requiring composite ...

Medicina

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Demonstration of the Rat Ischemic Skin Wound Model

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and unrelieved pressure due to immobility. Animal models have been developed that attempt to mimic these conditions for the purpose of furthering our understanding of the complexity of chronic wounds. The model described herein is a rat ischemic skin flap model that permits a prolonged reduction of blood flow resulting in wounds that become ischemic and resemble a chronic wound phenotype (reduced vascularization, increased inflammation and delayed wound closure). It consists of a bipedicled dorsal flap with 2 ischemic wounds placed centrally and 2 non-ischemic wounds lateral to the flap as controls. A novel addition to this ischemic skin flap model is the placement of a silicone sheet beneath the flap that functions as a barrier and a splint to prevent revascularization and reduce contraction as the wounds heal. Despite the debate of using rats for wound healing studies due to their quite distinct anatomic and physiologic differences compared to humans (i.e., the presence of a panniculus carnosus muscle, short life-span, increased number of hair follicles, and their ability to heal infected wounds) the modifications employed in this model make it a valuable alternative to previously developed ischemic skin flap models.

The rat, due to its size, availability, and rather docile behavior, has been utilized as a research model for many years. The goal of this protocol is to utilize the rat as an ischemic skin wound healing model to provide valuable insight into the pathophysiology of chronic wounds.

Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

The propensity for chronic wounds in humans increases with ageing, disease conditions such as diabetes and impaired cardiovascular function, and ...

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and negatively impact patient quality of life and long term survival. Advances in the understanding of the biological pathways associated with normal tissue toxicities have allowed for the development of interventional drugs, however, current response studies are limited by a lack of quantitative metrics for assessing the severity of skin reactions. Here we present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe the instrumentation design of the DOS system as well as the inversion algorithm for extracting the optical parameters. Finally, to demonstrate clinical utility, we present representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema and compare the results with a commonly employed visual scoring. The described DOS method offers an objective, high through-put evaluation of skin toxicity via functional response that is translatable to the clinical setting.

We present a diffuse optical spectroscopic (DOS) approach that provides quantitative optical biomarkers of skin response to radiation. We describe DOS instrumentation design, optical parameters extraction algorithms and the animal handling procedures required to yield representative data from a pre-clinical mouse model of radiation induced erythema.

Difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da Aguda de Radiação Ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

A Model of Free Tissue Transfer: The Rat Epigastric Free Flap

Free tissue transfer has been increasingly used in clinical practice since the 1970s, allowing reconstruction of complex and otherwise untreatable defects resulting from tumor extirpation, trauma, infections, malformations or burns. Free flaps are particularly useful for reconstructing highly complex anatomical regions, like those of the head and neck, the hand, the foot and the perineum. Moreover, basic and translational research in the area of free tissue transfer is of great clinical potential. Notwithstanding, surgical trainees and researchers are frequently deterred from using microsurgical models of tissue transfer, due to lack of information regarding the technical aspects involved in the operative procedures. The aim of this paper is to present the steps required to transfer a fasciocutaneous epigastric free flap to the neck in the rat.
This flap is based on the superficial epigastric artery and vein, which originates from and drain into the femoral artery and vein, respectively. On average the caliber of the superficial epigastric vein is 0.6 to 0.8 mm, contrasting with the 0.3 to 0.5 mm of the superficial epigastric artery. Histologically, the flap is a composite block of tissues, containing skin (epidermis and dermis), a layer of fat tissue (panniculus adiposus), a layer of striated muscle (panniculus carnosus), and a layer of loose areolar tissue.
Succinctly, the epigastric flap is raised on its pedicle vessels that are then anastomosed to the external jugular vein and to the carotid artery on the ventral surface of the rat's neck. According to our experience, this model guarantees the complete survival of approximately 70 to 80% of epigastric flaps transferred to the neck region. The flap can be evaluated whenever needed by visual inspection. Hence, the authors believe this is a good experimental model for microsurgical research and training.

This paper describes the steps required to raise a fasciocutaneous epigastric free flap and transfer it to the neck in the rat.

Um Modelo de Transferência Tissue Free: The Rat epigástrica gratuito Flap

Free tissue transfer has been increasingly used in clinical practice since the 1970s, allowing reconstruction of complex and otherwise untreatable defects ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...