Os autores gostariam de agradecer a Pedro A. Valdes Hernandez, Francois Tadel, e Lloyd Smith por seus valiosos conselhos e discussão frutífera. Agradecemos também a Rafael Torres para a leitura de prova.

Declaração de ética: Todos os experimentos são realizados seguindo as políticas estabelecidas pelo Cuidado e Uso de Animais Comitê Institucional (IACUC) da Universidade Internacional da Flórida (IACUC 13-004). 1. EEG Recordings <ol><li> Preparação do mini-tampão de EEG <ol><li> Mergulhe as pontas dos eléctrodos da mini-tampa EEG pelo menos 12 horas em água destilada, com cloreto de 0,2%. Lavar o mini-tampa EEG delicadamente em água destilada. Seque a tampa e os eletrodos no ar. </li><li> Mix EEG eletrogel com solução de NaCl 0,9% na proporção de volume de 2: 1. Adicione uma gota de azul de metileno, que vai ajudar a visualizar a pasta de eletrodo no interior dos eletrodos e na pele. Pegue a pasta misturada em uma seringa. Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa. Injectar o gel em cada um dos eléctrodos 32, enchendo-os sem a introdução de quaisquer bolhas de ar. Recomenda-se a injectar a partir do fundo, em vez de no topo. Isto proporciona uma melhor access a cada eléctrodo e reduz a possibilidade de o gel de alastramento. </li><li> Ligue EEG e sistema de gravação fisiológica, e abrir o software de gravação correspondente no computador em uso. </li></ol></li><li> Preparação de animal e anestesia NOTA: epilepsia crônica foi criado usando um protocolo para FCD 8 em ratos Wistar. A gravação EEG foram realizados em ratos Wistar adultos (8 semanas de idade, 300-400 g). <ol><li> Grave o peso do rato em uma folha de experiência. Use essas informações para calcular a dose sedativa (DEXDOMITOR 0,25 mg / kg). Induzir a anestesia em ratos com 5% de isoflurano e oxigênio a 100% (1 L / min a 14,7 psi). </li><li> Depois de cortar a cabeça do rato, reduzir isoflurano a 2% e mantê-lo durante toda a configuração do mini-tampão de EEG. Verifique reflexos de rato estão ausentes (toe-pitada). Coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento no aparelho estereotáxico fixando os canais de orelha usando barras de ouvido. Certifique-se de cone do nariz anestesia é segura. </li><li> Um Pply pomada oftálmica lubrificante para cada olho. </li><li> Raspar o cabelo extra na cabeça de rato e orelhas usando uma navalha. Evitar qualquer sangramento durante o barbear. NOTA: Qualquer cabelo deixado na pele irá produzir ruído nas gravações de EEG. Esfregue a pele do rato com 90% de álcool isopropílico para estimular os vasos sanguíneos e desengordurar a pele. </li><li> Coloque um swab solução salina no couro cabeludo e cobri-lo completamente para manter boa condutância da pele até que o mini-tampa EEG está pronto para ser colocado. </li><li> Conecte temperatura, respiração e três sondas de eletrocardiograma. Note-se que a temperatura é medida com uma sonda rectal. Monitorar continuamente a fisiologia do rato durante os procedimentos de gravação. Certifique-se de que a temperatura normal é de 37 ° C, faixa de respiração é 30 - 60 respirações por minuto e freqüência cardíaca é de cerca de 350-450 batimentos por minuto. </li></ol></li><li> Procedimentos de gravação <ol><li> Remova o swab solução salina no couro cabeludo do rato e coloque o preparado EEG mini-cAP na sua pele. Fixar o mini-tampa com faixas de borracha. Inserir uma faixa de borracha na parte da frente do couro cabeludo, geralmente na frente dos olhos, e uma banda na parte de trás do couro cabeludo entre as orelhas e do pescoço. Use um protetor de plástico sob o pescoço para facilitar a respiração normal. </li><li> Coloque uma camada de alta condutância eletrodo de pasta em ambos o chão e eletrodos de referência. Colocá-los na respectiva orelha. NOTA: O eletrodo de referência pode ser possivelmente colocados em outros locais. </li><li> Conecte o mini-tampa EEG para os amplificadores e observar uma visualização da bancada para a impedância do eletrodo. Verifique o desempenho de todos os eletrodos. Para uma gravação de alta qualidade, garantir que o valor da impedância está na gama de 5 - 30 k. Se existem quaisquer eléctrodos ruidosos, proporcionar um melhor contacto com o couro cabeludo, ou movendo-as para dentro do andaime para o couro cabeludo ou injectando mais suavemente em gel a partir do topo do eléctrodo. </li><li> Administrar DEXDOMITOR (0,25 mg / kg) intraperitoneally e imediatamente reduzir a taxa de isoflurano para 0%. Se a taxa de respiração não está dentro de 30-60 respirações por minuto gama, começar a aumentar a taxa de isoflurano suavemente. Não exceder o valor de 1% de isoflurano. Monitorar este passo com cuidado, pois a mistura de isoflurano e DEXDOMITOR poderia levar os animais a um estado crítico. NOTA: No modelo pré-clínico de epilepsia focal, isoflurano afeta IEDs, enquanto DEXDOMITOR não. Indivíduos com menos de isoflurano tem propriedade epileptogénica mais fraco, ou seja, relativamente menos IEDs podem ser detectados em comparação com outras condições 7,14. A dose DEXDOMITOR é eficaz durante cerca de 2 horas. Assim, para poupar o tempo para o seu efeito, a preparação foi levada a cabo sob isoflurano. </li><li> Realizar gravações de EEG. Depois da gravação, marcar as posições dos três círculos salientes da mini-tampão de EEG em cima da pele através da inserção de uma caneta de cor dentro deles antes da mini-tampão EEG é removido. Use-os como pontos de referência para MRI co-registo. Tire uma foto da cabeça do rato com os pontos de referência. Coloque o rato de volta para dentro da gaiola e monitorá-lo até a recuperação completa do efeito de DEXDOMITOR. NOTA: Neste experimento, cor vermelha (cor verde oponente) foi usado para distinguir as posições de eletrodo (verde). No entanto, é recomendado o uso de outras cores (roxo / verde) se pequenas manchas hemorrágicas são observados na pele. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52700/52700fig1.jpg" /> Figura 1. Uma imagem do mini-tampão de EEG colocado em um rato em particular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Cérebro fonte de imagem <ol><li> Classificação IED NOTA: A detecção de IED e classificação é realizada utilizando códigos de auto-desenvolvido em MATLAB com base noestudo anterior 15. Este software estará disponível mediante solicitação. <ol><li> Descarte canais ruidosos inspecionando visualmente os marcadores de EEG. Remover artefactos ECG utilizando um método automático para a subtracção de forma de onda periódica, que se baseia em um molde e uma análise de correlação. NOTA: Normalmente, o experimentador que registrou o EEG partes da folha experimental escrita para as informações do canal má observado com base nos valores de impedância. Software para remover artefatos de ECG também estará disponível mediante solicitação. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52700/52700fig2.jpg" /> Figura 2. Um exemplo do traçado EEG mostrando diferentes tipos de IEDs. A caixa vermelha indica um tipo de IEDs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Aplicar um filtro passa-banda com freqüências de corte de 3-150 Hz e um entalhefiltro para remover a freqüência da linha (60 Hz em geral e 50 Hz em alguns países) off-line componente. </li><li> Detectar dois tipos de IEDs (picos e Sharp-ondas). Picos e Sharp-ondas constituem grandes eventos elétricos de 20-70 ms e 70-200 ms de duração, respectivamente. Portanto, após a aplicação de um respectivo filtro passa-banda (frequências de corte de 15 - 50 Hz para picos e 5-15 Hz para Sharp-ondas), os IEDs são detectados com base na amplitude limiares 15. NOTA: Os limites são definidos automaticamente para 4σ como sugerido no estudo anterior para a atividade multiunit 15. Aqui, σ é um desvio padrão estimado do sinal filtrado-passa-banda, σ = {mediana | sinal filtrado | / 0,6745}. </li><li> Sub-classificar picos e ondas afiadas em diferentes clusters. As características distintivas de diferentes picos e Sharp-ondas são extraídos usando transformada wavelet 15. Eles são sub-classificados em vários clusters usando k-médias,eo ideal número de cluster k é determinado usando silhueta. </li><li> Calcular a média dos sinais de sub-classificadas na mesma cluster. Os sinais de EEG médios para cada sub-tipo IED irá ser utilizado para análise da origem de cérebro. </li></ol></li><li> Modelo de volume condutor NOTA: Para as seguintes seções, o software de fonte aberta, Brainstorm 12, será usado com o atlas de ressonância magnética para ratos Wistar 9. No entanto, a MRI do rato indivíduo também pode ser utilizado para gerar o modelo de volume condutor, se disponível. O atlas MRI 9 pode ser baixado em <a href="http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/db/rb/101028.html">http://www.idac.tohoku.ac.jp/bir/en/</a> . Este site fornece o atlas como formato NIfTI seção &quot;Wistar Rat MRI Atlas&quot; sob, e pode ser acessíveis após o registro. O software necessário para pré-processamento pode também ser encontrado neste site. <ol><li> MRI de entrada e de superfície do cérebro para o software 12. <img alt="Visual 1" src = &quot;/ files / ftp_upload / 52700 / 52700vis1.jpg&quot; /&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Gerar superfície da cabeça com a configuração padrão. <img alt="Visual 2" src="/files/ftp_upload/52700/52700vis2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Gerar couro cabeludo e superfícies crânio interiores / exteriores com base em MRI para o campo chumbo 12 computação. NOTA: A resolução dos vértices influencia a precisão da fonte de estimativa, mas grande número de vértices resultados em alta complexidade computacional. Número recomendado de vértices de cada camada é de 642 para precisão aceitável com complexidade computacional justo. A espessura do crânio pode ser verificado a partir da ressonância magnética, e no caso de o atlas de ressonância magnética, ele é de aproximadamente 1 mm. Depois de inserir valores acima no software, triângulo face-vértice correspondente malhas será criado para cada superfície. <img alt="Visual 3" src="/files/ftp_upload/52700/52700vis3.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Verifique a orientação e localização de cada superfície em relação ao IRM utilizando a opção de visualização. Modificar em consequência, se todas as superfícies não são co-registrada 12. <img alt="Visual 4" height="351" src="/files/ftp_upload/52700/52700vis4.jpg" width="321" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Usando a imagem de cabeça de rato adquirida em 1.3.5. co-registar as posições dos três pontos de referência (R1, R2 e R3) na ressonância magnética. Use os pontos de grade dos pontos de referência como sendo feitas para generate as posições dos eletrodos como eletrodos são fixados no cadafalso (Figura 3B). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52700/52700fig3.jpg" /> Figura 3. imagem de cabeça (A) Rat usado para obter posições de eletrodos e (b) o diagrama de mini-tampa EEG com o sistema de coordenadas. Pontos vermelhos em (A) indicar os pontos de referência mencionadas no 1.3.5. que correspondem aos números vermelhos em (B). Além disso, as marcas em verde (A) representam as posições dos eléctrodos 32, e que correspondem aos números no azul (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Gerar N × matriz posição 3 eletrodo com base nos três pontos de referência. Aqui, N é o número de canais (N = 32) e a coluna representa o correspondente x, y, e z valores de coordenadas. NOTA: O mini-tampa EEG é um andaime rígida. Por conseguinte, uma vez que as três grelhas de referência (R1, R2, e R3) são obtidos, a posição dos eléctrodos são ajustados automaticamente. O usuário só precisará redefinir os valores-Z em uma maneira que o mini-tampa está devidamente projetado no couro cabeludo. As grades ponto N pode ser numerado sequencialmente, conforme ilustrado na Figura 3B números azuis. O andaime padrão para o mini-tampão de EEG está disponível comercialmente (Tabela de Materiais). O software para co-registro também está disponível para a comunidade. </li><li> Introduza o arquivo gerado canal. <img alt="Visual 5" src="/files/ftp_upload/52700/52700vis5.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis5highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Mostrar e confirmar a localização de todos os eléctrodos. Modificar quaisquer eléctrodos extraviado 12. O sistema final de coordenadas para o electroposições de deverá coincidir com o sistema de coordenadas utilizado para as superfícies acima mencionadas. NOTA: As superfícies criadas podem ser inspeccionadas visualmente no uma ressonância magnética, usando a opção de visualização, E então, uma superfície selecionado será exibido como linha amarela na MRI &quot;Registro de MRI Verifique MRI / Registro de superfície.&quot;. Além disso, os três pontos de referência e as posições dos eléctrodos 32 pode ser exibido no MRI, selecionando a opção da caixa de ferramentas, &quot;Sensores indicados MRI Viewer.&quot; Os locais podem ser inspeccionados visualmente por comparação das distribuições baseadas no olhos e ouvidos locais do rato ( A Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52700/52700fig4.jpg" /> Figura 4. atlas (A) de ressonância magnética com superfície co-registrada cérebro (linha amarela), (B) o modelo de volume condutor criado com os alinhados 32 eletrodos e três marcos (pontos vermelhos), e atlas (C) com MRI co-registo ref<html> grade erence R1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li></ol></li><li> Fonte Imagiologia Cerebral <ol><li> Calcule matriz campo chumbo 13. Introduzir os valores de condutividade que satisfazem a relação de pele, crânio e cérebro como 1: 1/80: 1. Obter o campo matriz de chumbo com base no modelo de volume condutor, e as posições dos eléctrodos criadas em 2.2. NOTA: A caixa de ferramentas 12 oferece a interface com o outro software para calcular BEM 10. Por conseguinte, apenas os valores de condutividade são necessários como entrada. <img alt="Visual 6" src="/files/ftp_upload/52700/52700vis6.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Os sinais de entrada médios de EEG para cada sub-tipo de IED armazenados em 2.1.4. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52700 / 52700vis7.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Obter solução sLORETA 13 a partir da matriz de chumbo campo computadorizada e os sinais EEG de entrada. Ao seleccionar o método de estimação opção fonte, a solução inversa pode ser obtido 12. <img alt="Visual 8" src="/files/ftp_upload/52700/52700vis8.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700vis8highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Traçar as fontes estimadas. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+template+for+spatial+normalization+of+MR+images+of+the+rat+brain.">A template for spatial normalization of MR images of the rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (2), 105-113 (2003).</li><li>Schwarz, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereotaxic+MRI+template+set+for+the+rat+brain+with+tissue+class+distribution+maps+and+co-registered+anatomical+atlas:+application+to+pharmacological+MRI.">A stereotaxic MRI template set for the rat brain with tissue class distribution maps and co-registered anatomical atlas: application to pharmacological MRI.</a> Neuroimage. 32 (2), 538-550 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma nova metodologia para registro multicanal de forma não invasiva EEG em um modelo pré-clínico particular de epilepsia focal é descrita. As indicações para os procedimentos de registo e análise, com dicas experimentais específicos, são fornecidos. Não foram fatores-chave a considerar a obtenção de resultados bem-sucedidos. Em primeiro lugar, para as gravações de EEG, a obtenção de sinais de alta qualidade é essencial. Viscosidade adequada da pasta de EEG deve ser aplicada para cada eléctrodo durante a preparação de mini-tampão, e cabeça e o cabelo do ouvido do rato deverá ser completamente removido durante o barbear. Verificação de impedância é o passo mais importante para confirmar a qualidade de gravações de EEG. Em segundo lugar, para geração de imagens fonte cérebro, gerando adequado modelo de volume condutor é crucial. Cada superfície deve ser co-registrada. Além disso, as posições de eléctrodos gerado deve ter uma distância mínima de erro a partir das localizações dos eléctrodos reais no couro cabeludo do rato. Mesmo que esse manuscrito introduz fonteprocedimentos de análise utilizando Brainstorm 12, que pode ser realizado utilizando outros softwares abertos 16,17 e 18,19 produtos comerciais. Além disso, além sLORETA 13, outras soluções inversas, como vários modelos de dipolo e Beamformer pode ser aplicada 4. Uma limitação dessa abordagem é que a análise de comportamento não pode ser conduzida desde a gravação EEG é realizado sob sedação. No entanto, em comparação com os outros métodos para registo de EEG em ratos 5,6, esta abordagem é invasiva. Nossos resultados preliminares sugerem a importância para uma classificação precisa de marcadores de IED de gravações de EEG para determinar as zonas irritativos em um rato com epilepsia focal, bem como para avaliar a sua relação com os mecanismos subjacentes para a iniciação apreensão 11. Além disso, demonstrou-se que a localização da fonte de EEG específicas para tais IED mostrou uma boa correspondência com a respativação e desativação regiões BOLD caz 20. Nosso estudo vai estimular a utilização de modelos pré-clínicos para avaliar as estratégias cama-banco-cama desenvolvidos por engenheiros biomédicos. Por exemplo, a extração de IED hoje é realizada em hospitais manualmente, o que exigiu um esforço humano considerável. A metodologia proposta neste estudo faz isso automaticamente. Nós supomos que a utilização desta metodologia irá produzir resultados semelhantes quando aplicada a doentes com FCD. Estamos a preparar protocolos IRB para a avaliação deste e de outros aspectos da metodologia no conjunto de dados humana. Além disso, a utilização de modelos pré-clínicos nos ajudará a entender as capacidades e limitações do EEG localização de fontes na epilepsia 21. Estimativa precisa das fontes cerebrais subalterno epileptogenesis é crucial para as estratégias terapêuticas e planejamento cirúrgico. Além disso, ter uma plataforma padrão para registo de EEG em ratos serão úteis paraa avaliação da eficácia de várias drogas anti-epilépticas em ensaios pré-clínicos. Este é o primeiro estudo no qual ratos epilépticos são registradas de forma não invasiva sob sedação, o que abrirá novas portas para a avaliação dos biomarcadores de EEG para a epilepsia. No entanto, toda a metodologia apresentada neste estudo é extensível a outras condições experimentais e distúrbios cerebrais. O mini-EEG tampão pode também ser usado em tipos de outro roedor. No passado, um paradigma da estimulação pata em ratos Wistar foi usado para avaliar a qualidade e reprodutibilidade dos dados registados com o mini-tampão de EEG 2. Além disso, validações para a reconstrução fonte cérebro foram realizados a partir de alta resolução EEG crânio simultaneamente gravado com laminares potenciais de campo locais de ratos Wistar, sob o paradigma de estimulação suiça 22. Esta metodologia foi desenvolvida para ratos Wistar, devido à existência de um atlas de ressonância magnética para este rato, em particular strem. No entanto, ele pode ser aplicado a outros tipos de roedores com o seu formato padrão de atlas, incluindo ratinho, 23 ratos Sprague-Dawley, 24 e Paxinos e Watson ratos 25. Além disso, os procedimentos fundamentais da nossa metodologia proposta pode ser usado em qualquer de roedores modelos pré-clínicos para os quais o EEG é uma modalidade importante. No entanto, muitos aspectos desta metodologia são particularmente para a epilepsia, especialmente aqueles relacionados ao EEG pré-processamento (detecção e classificação IED). Além disso, os pesquisadores devem estar cientes de medicamentos adequados utilizados para sedação em diferentes casos. O uso de isoflurano e DEXDOMITOR em nosso estudo foi cuidadosamente considerado, devido ao impacto reduzido sobre IEDs. Quanto EEG, no caso de rato, relativamente pequena área da superfície do couro cabeludo poderia reduzir consideravelmente o número de canais.

It has been shown that interictal epileptiform discharges (IEDs) observed from EEG constitute useful markers of epileptogenesis in patients with focal epilepsy3. The regions inside the brain from which these IEDs originate, named irritative zones, can in practice be localized based on EEG recordings4. Preclinical models are essential to find correlates between these irritative zones and the actual regions underlying seizure initiation. However, recording EEG from small animals is challenging because of the small surface area of the head compared to the human scalp. Although invasive methods for chronic recording in rats can be used5, 6, techniques are not available at this moment to acquire traditional EEG recordings on rodents under acute conditions without the need of anesthesia.
To solve this problem, we apply a patented EEG mini-cap2, which allows us to record 32-channel EEG data from rodents noninvasively. In this study, we also provide evidence about the need of an analgesic to preserve IED frequency. Therefore, although fixation of EEG mini-cap was performed under isoflurane, EEG recordings were obtained with rats only under sedation (dexdomitor)7. The method proposed in this study can be used in any preclinical rat model of focal epilepsy. To illustrate the capabilities of this methodology, we apply it to understand the correlates between irritative and seizure-onset zones in focal cortical dysplasia (FCD). To that end, we use a &#8220;double-hit&#8221; model of FCD8 in Wistar rats.
To perform brain source analysis, it is required to: a) accurately extract IEDs from EEG raw data and b) obtain a volume conductor model for the individual animal head. To generate a practical volume conductor model, we use an in vivo rat MRI atlas, comprising average images of intensity/shape and obtained via non-linear registration of T2 images of 31 Wistar rats9. The forward model for the generated volume conductor was computed by boundary element method (BEM)10. As in the case of humans, two typical patterns of IEDs (sharp-waves and spikes) were detected and sub-classified into different clusters through an intelligent feature extraction, feature selection, and classification process11. These sub-classified signals are used to estimate the brain source localizations associated with different types of irritative zones. We present the source analysis steps using a well-known public software called Brainstorm12. The EEG source localizations for each IED sub-type and the seizure onset time frames were performed using standardized low-resolution brain electromagnetic tomography (sLORETA)13, which is available in Brainstorm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Data Qcquisition Computer</td>
			<td>Hewlett-Packard</td>
			<td>Z210 Workstation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexdomitor</td>
			<td>Orion Pharma</td>
			<td>6295000</td>
			<td>Dexmedetomidine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG Analysis Software</td>
			<td>The Mathworks Inc.</td>
			<td>MATLAB R2011b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Brainstorm</td>
			<td>Sylvain et al. 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OpenMEEG</td>
			<td>Bramfort et al. 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG Data Streamer</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RS4 Data Streamer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG Electrode Paste</td>
			<td>Biotach</td>
			<td>YGB 103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG Preamplifier</td>
			<td>BioSemi</td>
			<td>Active Two</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brain Products</td>
			<td>BrainAmp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>PZ3 Low Impedance Amplifier</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG Processor</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ2 BioAmp Processor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG Recording Software</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>OpenEx - OpenDeveloper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EEG SCSI Connector</td>
			<td>BioSemi</td>
			<td>Active Two SCSI Connector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Brain Products</td>
			<td>D-sub Connector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>Zif-Clif Digital Headstage</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Resolution EEG Mini-cap</td>
			<td>Cortech Solutions</td>
			<td>DA-AR-ELRCS32</td>
			<td>US patent Application No. 13/641,834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>VedcoPiramal Healthcare</td>
			<td>NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Aqua Solutions</td>
			<td>3112213</td>
			<td>90% v/v solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Rugby</td>
			<td>NDC 0536-6550-91</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>2B8203</td>
			<td>Vaterinary 0.9% Sodium Chroride Injection USP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiology Recording Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>LabChart 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiology Recording System</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>PowerLab 8/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>200555</td>
			<td>12cc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

brain source imaging in preclinical rat models of focal epilepsy using high-resolution eeg recordings

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with focal epilepsy. This methodology relies on the assumption that seizures originate from the same regions of the brain from which interictal epileptiform discharges (IEDs) emerge. Preclinical models are very useful to find correlates between IED locations and the actual regions underlying seizure initiation in focal epilepsy. Rats have been commonly used in preclinical studies of epilepsy1; hence, there exist a large variety of models for focal epilepsy in this particular species. However, it is challenging to record multichannel EEG and to perform brain source imaging in such a small animal. To overcome this issue, we combine a patented-technology to obtain 32-channel EEG recordings from rodents2 and an MRI probabilistic atlas for brain anatomical structures in Wistar rats to perform brain source imaging. In this video, we introduce the procedures to acquire multichannel EEG from Wistar rats with focal cortical dysplasia, and describe the steps both to define the volume conductor model from the MRI atlas and to uniquely determine the IEDs. Finally, we validate the whole methodology by obtaining brain source images of IEDs and compare them with those obtained at different time frames during the seizure onset.

Uma vez que todos os procedimentos sejam devidamente preenchido, fontes estimadas podem ser visualizados na superfície do cérebro do modelo pré-clínico. A Figura 5 mostra as fontes estimados a partir de um determinado sub-tipo de picos (superior) e Sharp-ondas (inferior) de IEDs. Além disso, a Figura 6 mostra como as mudanças de distribuição fonte em intervalos de tempo sequenciais durante um estabelecimento apreensão. Estes resultados suportam a capacidade de as metodologias propostas para gravar de alta resolução EEG em ratos com epilepsia focal e para conduzir a análise de origem utilizando o EEG registrado. <img alt="Visual 6" src="/files/ftp_upload/52700/52700fig5.jpg" /> Figura 5. estimado locais de origem cérebro de IEDs com relação a diferentes grupos em pontos (topo) e Sharp-ondas (em baixo). (A) de séries temporais, (B) topografia EEG, e (c) atual corticais azedoces. A avaliação é realizada a um tempo específico, marcado com uma linha vertical vermelho em (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Visual 6" src="/files/ftp_upload/52700/52700fig6.jpg" /> Figura 6. fontes cerebrais estimados durante a apreensão. Os instantes de tempo são marcados como linhas verticais vermelhas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52700/52700fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings

This video introduces the preparation, recording, and source analysis procedures of high-resolution EEG on sedated rats with a particular preclinical model of focal epilepsy under noninvasive conditions.

Cérebro Fonte Imaging no rato pré-clínica Todos os modelos de Focal Epilepsia usando de alta resolução EEG Recordings

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with ...

brain-source-imaging-preclinical-rat-models-focal-epilepsy-using-high

Research

JoVE Journal

Medicine

15.2K visualizações.  Florida International University. This video introduces the preparation, recording, and source analysis procedures of high-resolution EEG on sedated rats with a particular preclinical model of focal epilepsy under noninvasive conditions.

Vídeo: Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Guiada por MRI rompimento da barreira hemato-encefálica utilizando Ultrassom Focalizado transcraniana em um modelo de rato

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Medicina

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Ressonância magnética e PET no rato modelos de Infarto do Miocárdio

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Assessing Cortical Cerebral Microinfarcts on High Resolution MR Images

Cerebral microinfarcts are frequent findings in the post-mortem human brain, and are related to cognitive decline and dementia. Due to their small sizes it is challenging to study them on clinical MRI scans. It was recently demonstrated that cortical microinfarcts can be depicted with MRI scanners using high magnetic field strengths (7T). Based on this experience, a proportion of these lesions is also visible on lower resolution 3T MRI. These findings were corroborated with ex vivo imaging of post-mortem human brain tissue, accompanied by histopathological verification of possible cortical microinfarcts.
Here an ex vivo imaging protocol is presented, for the purpose of validating MR observed cerebral microvascular pathology with histological evaluation. Furthermore, guidelines are provided for the assessment of cortical microinfarcts on both in vivo 7T and 3T MR images. These guidelines provide researchers with a tool to rate cortical microinfarcts on in vivo images of larger patient samples, to further unravel their clinical relevance in cognitive decline and dementia, and establish these lesions as a novel biomarker of cerebral small vessel disease.

A high resolution ex vivo 7T MR imaging protocol is presented, to perform MR-guided histopathological validation of microvascular pathology in post-mortem human brain tissue. Furthermore, guidelines are provided for the assessment of cortical microinfarcts on in vivo 7T as well as 3T MR images.

Avaliando cortical cerebral microinfartos em alta resolução MR Imagens

Cerebral microinfarcts are frequent findings in the post-mortem human brain, and are related to cognitive decline and dementia. Due to their small sizes ...

A Multimodal Imaging- and Stimulation-based Method of Evaluating Connectivity-related Brain Excitability in Patients with Epilepsy

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations over time in the blood-oxygenation level dependent signal. rs-fcMRI has been applied extensively to identify abnormalities in brain connectivity in different neurologic and psychiatric diseases. However, the relationship among rs-fcMRI connectivity abnormalities, brain electrophysiology and disease state is unknown, in part because the causal significance of alterations in functional connectivity in disease pathophysiology has not been established. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a technique that uses electromagnetic induction to noninvasively produce focal changes in cortical activity. When combined with electroencephalography (EEG), TMS can be used to assess the brain's response to external perturbations. Here we provide a protocol for combining rs-fcMRI, TMS and EEG to assess the physiologic significance of alterations in functional connectivity in patients with neuropsychiatric disease. We provide representative results from a previously published study in which rs-fcMRI was used to identify regions with abnormal connectivity in patients with epilepsy due to a malformation of cortical development, periventricular nodular heterotopia (PNH). Stimulation in patients with epilepsy resulted in abnormal TMS-evoked EEG activity relative to stimulation of the same sites in matched healthy control patients, with an abnormal increase in the late component of the TMS-evoked potential, consistent with cortical hyperexcitability. This abnormality was specific to regions with abnormal resting-state functional connectivity. Electrical source analysis in a subject with previously recorded seizures demonstrated that the origin of the abnormal TMS-evoked activity co-localized with the seizure-onset zone, suggesting the presence of an epileptogenic circuit. These results demonstrate how rs-fcMRI, TMS and EEG can be utilized together to identify and understand the physiological significance of abnormal brain connectivity in human diseases.

Resting-state functional-connectivity MRI has identified abnormalities in patients with a wide range of neuropsychiatric disorders, including epilepsy due to malformations of cortical development. Transcranial Magnetic Stimulation in combination with EEG can demonstrate that patients with epilepsy have cortical hyperexcitability in regions with abnormal connectivity.

A Multimodal Imaging- e baseada Estimulação método de avaliação de conectividade relacionadas com o cérebro Excitabilidade em doentes com epilepsia

Resting-state functional connectivity MRI (rs-fcMRI) is a technique that identifies connectivity between different brain regions based on correlations ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control seizures. However, a significant minority of patients continues to exhibit post-operative seizures, even in those cases in which the suspected source of seizures has been correctly localized and resected. The protocol presented here combines a clinical procedure routinely employed during the pre-operative evaluation of temporal lobe epilepsy (TLE) patients with a novel technique for network analysis. The method allows for the evaluation of the temporal evolution of mesial network parameters. The bilateral insertion of foramen ovale electrodes (FOE) into the ambient cistern simultaneously records electrocortical activity at several mesial areas in the temporal lobe. Furthermore, network methodology applied to the recorded time series tracks the temporal evolution of the mesial networks both interictally and during the seizures. In this way, the presented protocol offers a unique way to visualize and quantify measures that considers the relationships between several mesial areas instead of a single area.

This protocol describes a procedure to track the evolution of mesial network measures in temporal lobe epilepsy (TLE) patients. It is based on the combination of intracranial recordings with a novel numerical technique for data analysis. Specifically, we present a protocol for network analyses of foramen ovale recordings.

Análise de Redes de forame oval Eletrodo Recordings na epilepsia do lobo temporal Os pacientes resistentes a drogas

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

The Pilocarpine Model of Temporal Lobe Epilepsy and EEG Monitoring Using Radiotelemetry System in Mice

Temporal lobe epilepsy (TLE) is a common neurological disorder in adulthood. For translational studies of chronic epilepsy, pilocarpine-induced status epilepticus (SE) is frequently selected to recapitulate spontaneous recurrent seizures (SRS). Here we present a protocol of SE induction by intraperitoneal (i.p.) injection of pilocarpine and monitoring of chronic recurring seizures in live animals using a wireless telemetry video and electroencephalogram (EEG) system. We demonstrated notable behavioral changes that need attention after pilocarpine injection and their correlation with hippocampal neuronal loss at 7 days and 6 weeks post-pilocarpine. We also describe the experimental procedures of electrode implantation for video and EEG recording, and analysis of the frequency and duration of chronic recurrent seizures. Finally, we discuss the possible reasons why the expected results are not achieved in each case. This provides a basic overview of modeling chronic epilepsy in mice and guidelines for troubleshooting. We believe this protocol can serve as a baseline for suitable models of chronic epilepsy and epileptogenesis.

This manuscript describes a method of inducing status epilepticus by systemic pilocarpine injection and of monitoring spontaneous recurrent seizures in live animals using a wireless telemetry video and electroencephalogram system. This protocol can be utilized for studying the pathophysiologic mechanisms of chronic epilepsy, epileptogenesis, and acute seizures.

O modelo de pilocarpina de epilepsia do lobo Temporal e EEG monitoramento usando sistema de radiotelemetria em ratos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is a common neurological disorder in adulthood. For translational studies of chronic epilepsy, pilocarpine-induced status ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...