Os autores gostariam de agradecer o Center for Molecular e Genômica de imagem na UC Davis e Imaging Departamento Biomédica da Genentech. Este trabalho foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Pesquisa em Parceria Bioengenharia Saúde número de concessão R01 EB00993.

Todo o manuseio e procedimentos de animais aqui descrito, e de acordo com a Pesquisa Animal: Relatórios experimentos in vivo (chegar) diretrizes, foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Associação de Avaliação de Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) Internacional credenciados Animal Care Institucional e Use Committee da Universidade da Califórnia, Davis. Cirurgia adequada não deve resultar em sinais de qualquer dor ou desconforto no animal, mas medidas adequadas devem ser tomadas se tais sinais são observados, incluindo a administração de analgésicos ou em alguns casos, a eutanásia. O lado direito dos animais foi escolhido arbitrariamente para o procedimento descrito unilateral. 1. Unilateral Carótida Comum (CCA) Ligation <ol><li> Prepare campo estéril com ferramentas e materiais cirúrgicos esterilizados posicionados convenientemente. Assegurar almofada de aquecimento é aquecida a 37 ° C com sonda de temperatura colocado de forma segura sobre a almofada. &amp; #160; Certifique-se de usar uma cortina estéril para cobrir o local da cirurgia. </li><li> Anestesiar animais (isoflurano, 1-3% em ar a 0,5-1 l / min), e colocar animais em decúbito dorsal com o rabo de costas. Verifique anesthetization por beliscar a ponta - isso deve provocar nenhuma reação se o animal está devidamente anestesiados. Aplicar pomada oftálmica para os olhos. </li><li> Aplicar creme de depilação a parte inferior do pescoço para a área superior do tórax usando 1-2 cotonetes. Espere 1-3 minutos e, em seguida, remover o cabelo e creme usando molhadas gaze ou cotonetes álcool. Área Swab incisão com Betadine de forma circular de dentro para fora, e, em seguida, transformar-se em luvas cirúrgicas estéreis. </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica, fazer uma incisão de cerca de um centímetro ao longo da linha média da parte inferior do pescoço. Separe cuidadosamente pele exterior da fáscia circundante usando uma tesoura cirúrgica. </li><li> Usando dois fórceps McPherson micro íris de sutura, separar a artéria carótida comum direita da fáscia, tomando cuidado para evitar danificar veias ou disturbing do nervo vago. </li><li> Usando a pinça na direita, exteriorizar o CCA direita em uma posição estável. Aplique algumas gotas de soro fisiológico para evitar a secagem. Passe um comprimento adequado (2-3 cm) de seda 6-0 sutura debaixo do CCA direita, e ligar usando um nó quadrado duplo. Opcionalmente, ligar novamente usando um segundo comprimento de sutura de seda 6-0. </li><li> Reposicionar CCA direita e limpe o excesso de fluido de abrir com uma esponja estéril derrubado do cotonete. Feche a incisão com sutura de seda 6-0. Aplicar topicamente lidocaína até 7 mg / kg. </li><li> Permitir ao animal recuperar da anestesia até ambulatorial (aproximadamente 30 min) e realizar o monitoramento pós-cirúrgico até animal está pronto para a imagem latente. </li></ol> 2. Preparação para a Criação de Imagens: Sistema e Hardware Checks <ol><li> Configurar o hardware e software para os sistemas de ressonância magnética e PET e verificar sua funcionalidade como se segue. Assegurar que todas as conexões físicas são seguras e configurações de software são devidamente selecionados. <ol><li&gt; Assegurar o sistema de PET é a temperatura de funcionamento prescrito de 5 ° C utilizando o sistema de arrefecimento de ar. </li><li> Sistema de montagem PET dentro do furo MRI, alinhando o campo de visão (FOV) centros que utilizam conhecidos offsets axiais PET e MRI. Montar a bobina de ressonância magnética no interior do furo do sistema de PET e o centro da bobina com o sistema de PET e centros magnéticos de ressonância magnética. </li><li> Ligue eletrônica PET para energia e tensão de polarização (Nota: etapas irão variar por instrumento). Executar uma rápida (5 min) verificação, utilizando um cilindro de 68 Ge e verificar o sinogram resultante para garantir que todos os detectores estão operacionais. </li><li> Opcionalmente adquirir dados a serem utilizados para uma matriz de transformação de PET / MRI para fins de co-registo: Encha um fantasma tridimensional (por exemplo, três esferas cheias) com 200 uCi de 18 de solução aquosa F e adquirir por 15 min com PET. Adquirir dados anatômico MRI: na Janela de Controle de Digitalização, selecione o multi-slice (MPME) seqüência de eco multi (ver Tabela 1 </strong&gt;). Repita o procedimento para todos os três principais orientações: axial, sagital e coronal. </li></ol></li><li> Verifique as configurações de bomba de infusão e operação. Definir a bomba para 4,44 mL por minuto, o que em 45 min de infusão constante proporciona um volume total de 200 ul, o limite típico recomendado para a injecção iv em 20 g de um animal. </li><li> Controlar o funcionamento do aquecedor e confirmar que a saída de temperatura é suficiente para manter o animal aquecido (37 ° C). Verifique se a temperatura e monitorização respiratória está operacional em preparação para a colocação do animal na cama animal. </li><li> Verifique a operação de O 2 e N 2 medidores de fluxo (para 0,5 L / min: O 2 a 57,2 mg / min e N 2 a 0,575 g / min), ao ligar tanto com a fonte de ar comprimido desligado e O2 e N2 fontes diante. Para evitar o risco de danificar os medidores de vazão, não ligá-los sem pressão de entrada suficiente. </li><li> Certifique-se de que o isoflurano vaporizer é suficientemente cheio. Antes da imagiologia, iniciar o fluxo anestesia com isoflurano a 1-2% e 0,5 a 1 L / min. </li><li> Prepare a cama dos animais, garantindo que as anestesia, almofada respiratória, e sistemas de aquecimento são posicionados de forma segura e funcional. Para uma precisão adicional co-registo de PET / MRI, marcadores fiduciais (por exemplo, tubos capilares preenchidos com marcador radioactivo em uma concentração similar como injectado para imagiologia) pode ser ligado à cama de animais dentro do campo de visão. </li></ol> 3. fluxo de trabalho de imagem Após todas as verificações de equipamentos necessários são concluídos, prossiga para a imagem da seguinte forma: <ol><li> Anestesiar os animais com isoflurano e inserir cateter na veia da cauda (28 g de agulhas, tubagem PE-10 inferior a 5 cm), cheio com soro fisiológico heparinizado (0,5 mL de heparina, 1000 USP / ml, em 10 ml de solução salina). O aquecimento do animal e / ou cauda pode melhorar a precisão da inserção do cateter. Opcionalmente, colocar uma gota de adesivo de cianoacrilato sobre o local de inserçãopara prender o sistema de administração IV. </li><li> Transferir o animal para a cama de animais preparados. Certifique-se de que a cabeça do animal é seguro, com incisivos superiores com a garantia das barras e barras de ouvido dente no lugar, se está sendo usado. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos para evitar a secagem. Insira termômetro sonda retal. Certifique-se de que a temperatura e leituras de respiração são funcionais. </li><li> Desenhar a dose do radiofármaco (cerca de 600 uCi em 200 ul) a ser injectada em heparinizado tubagem PE-10 de comprimento adequado - de aproximadamente 3 m de tubo de PE-10 e um volume de 200 ul. Conecte uma extremidade esta tubulação para a seringa bomba de infusão, ea outra para a linha de cateter na veia da cauda, ​​tomando cuidado para não criar furos na tubulação. </li><li> Deslize a cama dos animais para dentro do furo do ímã, certificando-se de não perturbar o posicionamento da bobina de ressonância magnética e todas as linhas ou cabos, especialmente o tubo de anestesia. Assegure-se que o centro do cérebro está alinhado com os centros do MBobina RI, sistema de PET, e ímã MRI. </li><li> Executar a sintonização e correspondência da bobina de ressonância magnética, rodando os botões de ajuste sobre a bobina, minimizando impedância (vá especificações bobina) e de frequência (300 MHz para o 1 H a 7 Tesla) desemparelhamentos através da observação do monitor do pré-amplificador de alta potência. </li><li> (MRI) Depois de regulação e de correspondência, adquirir uma imagem de scout: selecionar uma seqüência TriPilot RARE e executar a seqüência da Janela Controle Scan. Verificar o posicionamento do animal, repetindo os passos 3.5 e 3.6, se necessário. Redefinição de calços para valor zero. </li><li> (MRI) Adquirir uma localizada, verificação de espectroscopia resolvida no ponto (PRESS) em um volume dentro do cérebro: Executar uma sequência PRESS (ver Tabela 1) em um volume retangular com dimensões 3,9 mm × 6 mm × 9 mm. Verificar a largura da linha de água usando o comando de macro CalcLineWidth. Se a largura total a meia-valor máximo (FWHM) é aceitável (por exemplo, 0,2 ppm), continue na etapa 3.10. Se não, vá para a etapa 3.9. </li><li> (MRI) Adquirir um mapa de campo: Executar uma seqüência FieldMap (ver Tabela 1). Use os dados resultantes para um multi-ângulo de projeção calço (MAPSHIM) executando o comando de macro MAPSHIM e selecionando linear e de segunda ordem (z 2) ajustes locais. Repita o passo 3.8. </li><li> (MRI) Posicione o plano de fatia para a verificação DWI (ver Tabela 1): usando o Editor de Geometria, assegurar que a aquisição FOV está posicionada para adquirir o volume desejado de interesse dentro do cérebro. Se o plano fatia resultante está alinhada como desejado, copiar este plano de fatia na janela de Controle de Digitalização para todas as digitalizações de DWI subseqüentes. Comece a aquisição. </li><li> (PET) Com a aquisição PET preparado e pronto para começar, começar a bomba de infusão. Depois do atraso pré-determinado, em que o soro fisiológico do cateter ter sido injectado, começar a aquisição de PET (ver Tabela 1), a fim de capturar a entrada de radiofármaco. Monitorar a taxa de contagem e procurar o aumento gradualem contagens indicativos de uma injecção com sucesso. </li><li> Após 10-15 min, iniciar o concorrente desafio hipóxico com a etapa 3.12. Para iniciar desafio hipóxico, desligue o fluxo de ar medicinal e imediatamente o poder em O 2 e N 2 medidores de vazão com as configurações pré-determinadas para entregar 8% de oxigênio e 92% de nitrogênio, e reduzir o isoflurano a 0,8%. Não ligue medidores de vazão, sem pressão de entrada. </li><li> (MRI) Ao mesmo tempo que o passo 3.12, começam aquisição DWI preparado no passo 3.10 (scan &quot;H1&quot;). </li><li> (MRI) Começar aquisição DWI (scan &quot;H2&quot;), preparado no passo 3.10, imediatamente após verificação H1 é concluída. Termine desafio hipóxico por desligar medidores de vazão, restaurando o fluxo de ar medicinal, e retornando concentração de isoflurano para um valor adequado com base na monitorização fisiológica. </li><li> (MRI) Adquirir um DWI pós-hipóxia varredura preparado na etapa 3.10. Desligue a bomba de infusão após esta verificação for concluída. </li><li> (MRI) Anat Acquireimagens efec- tuada na axial e sagital. Na janela de Controle de Digitalização - selecione a seqüência MPME (ver Tabela 1). Usando o Editor de Geometria, garantir que a aquisição do FOV cobre o cérebro. </li><li> Remover animal, voltar a gaiola quando ambulatório e monitorar os sinais de morbidade, a eutanásia, se necessário com a administração de CO 2, seguido de luxação cervical como um método secundário. </li></ol>

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JM e SW são funcionários da Genentech.

MRI anatômica simultânea, e dinâmica DWI-RM e [18F] FDG PET dados foram adquiridos com sucesso a partir de animais experimentais durante desafio hipóxico seguinte ligação artéria carótida comum. Isto representa uma poderosa paradigma experimental para imagiologia multimodal da fisiopatologia rápida evolução associada com insultos isquémicos no cérebro e pode ser prontamente alargado para estudar outros radiomarcadores de PET (por exemplo, marcadores de neuroinflamaï¿½o) e sequências de resson...

Em todo o mundo, acidente vascular cerebral é a segunda principal causa de morte e a principal causa de incapacidade 1. A cascata de eventos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem durante e agudamente após um evento derrame ocorre rapidamente e com implicações para a viabilidade do tecido e, finalmente, 2 resultado. Hipoxia-isquemia cerebral (HI), o que leva a EHI (HIE), estima-se que afecta até 0,3% e 4% do total prazo e nascimentos prematuros 3,4, respectivamente. A taxa de mortalidade em lactentes com EHI é de aproximadamente 15% a 20%. Em 25% dos sobreviventes de HIE, complicações permanentes surgem como um resultado da lesão, incluindo o atraso mental, os défices motores, paralisia cerebral, epilepsia e 3,4. Intervenções terapêuticas passadas não têm provado digna de adoção como padrão de atendimento, e consenso ainda tem de ser alcançado que os métodos mais avançados, com base em hipotermia, são efetivamente reduzir a morbidade 3,5. Outras questões Of contenção incluem método de administração de hipotermia e paciente selecção 6. Assim, as estratégias de neuroproteção e neurorestoration ainda são uma área fértil para a investigação 7. Modelos de rato de HI cerebral têm estado disponíveis desde os anos 1960, e, subsequentemente, foram adaptados aos ratos 8,9. Devido à natureza do modelo e a localização da ligação, existe uma variabilidade inerente no resultado devido à diferença em fluxo colateral entre 10 animais. Como resultado, estes modelos tendem a ser mais variável em relação aos modelos similares, tais como a oclusão da artéria cerebral média (MCAo). Medição de tempo real de alterações fisiológicas tem sido demonstrada com fluxometria de Doppler por laser, bem como ressonância magnética ponderadas-difusão 11. A variabilidade intra-arterial em animais observou fluxo cerebral durante e imediatamente após hipoxia, bem como em resultados agudos, tais como o volume de enfarte e neurológicadéfice, sugerem que a aquisição simultânea e correlação de dados multimodais seria benéfico. Os recentes avanços na tomografia simultânea emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (RM) têm permitido novas possibilidades em imagens pré-clínicas 12-14. As vantagens potenciais de tais sistemas híbridos, combinados para aplicações pré-clínicos têm sido descritos na literatura 15,16. Embora muitas perguntas pré-clínicos podem ser abordadas pela imagem de uma seqüência animal individual ou por imagem grupos de animais separadas, determinadas situações - por exemplo, quando cada instância de um evento como acidente vascular cerebral se manifesta de forma única, com rápida evolução fisiopatologia - torná-lo desejável e até necessário para usar a medição simultânea. Neuroimagens funcional proporciona um exemplo, onde simultânea 2-desoxi-2- (18 F) fluoro-ᴅ-glucose ([18F] FDG) PET e Blood-nível de oxigênio dependente (BOLD) MRI foi recentemente demonstrado na estimulação whisker rato estuda 14. Aqui, nós demonstramos simultânea de imagem PET / MRI durante o início de um acidente vascular cerebral hipóxico-isquêmica em que a fisiologia do cérebro não está em estado de equilíbrio, mas em vez disso é rapidamente e de forma irreversível a mudança durante desafio hipóxico. Mudanças na difusão da água, medida pela ressonância magnética e quantificados pelo coeficiente de difusão aparente (ADC) derivada de imagem ponderada em difusão (DWI), foi bem caracterizada de acidente vascular cerebral em dados clínicos e pré 17,18. Em modelos animais, tais como MCAo, a difusão de água no tecido cerebral afectado cai rapidamente devido à bioenergética cascata que conduz ao edema citotóxico 18. Estas alterações agudas na ADC também são observados em modelos de roedores de isquemia-hipoxia cerebral 11,19. [18F] FDG PET de imagem foi usada em pacientes com AVC para avaliar mudanças na gl locaismetabolismo ucose 20, e um pequeno número de estudos in vivo em animais também têm utilizado [18F] FDG 21, incluindo no modelo de isquemia-hipoxia cerebral 22. Em geral, estes estudos mostram diminuição da utilização da glucose nas regiões isquémicas, embora um estudo utilizando um modelo com reperfusão encontrada nenhuma correlação dessas alterações metabólicas com enfarte do desenvolvimento posterior 23. Isto está em contraste com as alterações de difusão que têm sido associados com o núcleo 21 irreversivelmente danificadas. Assim, é importante ser capaz de obter a informação complementar derivada de [18F] FDG e DWI de uma forma simultânea ao longo da evolução de acidente vascular cerebral, como este é susceptível de produzir uma informação significativa sobre a progressão da lesão e o impacto de intervenções terapêuticas. O método aqui descrito é prontamente susceptível de utilizar com uma variedade de marcadores de PET e sequências de ressonância magnética. Por exemplo, [15O] H2O PETimagem junto com DWI e imagens ponderadas em perfusão (PWI) de ressonância magnética pode ser usado para explorar ainda mais o desenvolvimento da penumbra isquêmica e validar técnicas atuais dentro do campo de imagem acidente vascular cerebral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x McPherson suturing forceps, 8.5 cm</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>4473</td>
			<td>It is useful to reduce the opening width with a band on the forceps used to hold the carotid artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 silicone coated braided silk suture with 3/8 C-1 needle</td>
			<td>Covidien Sofsilk</td>
			<td>S-1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic blanket system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507220F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>(Generic)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter for O2</td>
			<td>Alicat Scientific</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flometer for N2</td>
			<td>Alicat Scientific</td>
			<td>MC-5SLPM-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 meter</td>
			<td>MSA</td>
			<td>Altair Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.05 Tesla MRI System</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>20 cm inner bore diameter with gradient set. Paravision 5.1 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Tx/Rx 1H Coil, 35mm ID</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET system</td>
			<td>(In-house)</td>
			<td></td>
			<td>4x24 LSO-PSAPD detectors, 
			10x10 LSO array per detector, 
			1.2mm crystal pitch and 14mm depth. 14 x 14 mm PSAPD. FOV: 60x35mm. 350-650 keV energy window. 16 ns timing window.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation Dumont forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal monitoring &#38; gating equipment</td>
			<td>Small Animal Instruments Inc.</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Only respiration monitoring used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal bed with temperature regulation</td>
			<td>(In-house)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous pet/mri imaging during mouse cerebral hypoxia-ischemia

Mudanças dinâmicas na difusão de água dos tecidos e metabolismo da glicose ocorrem durante e após hipóxia em isquemia-hipoxia cerebral refletindo uma perturbação bioenergética em células afetadas. Difusão ponderada ressonância magnética (MRI) identifica regiões que estão danificados, potencialmente irreversível, por hipóxia-isquemia. Alterações na utilização da glucose no tecido afectado podem ser detectados por tomografia de emissão de positrões (PET) de 2-desoxi-2- (18 F) fluoro-ᴅ-glucose ([18F] FDG) absorção. Devido à natureza variável e rápida de lesões neste modelo animal, a aquisição de ambos os modos de dados devem ser realizadas simultaneamente, a fim de correlacionar dados significativamente PET e MRI. Além disso, a variabilidade inter-animal na lesão hipóxico-isquêmica devido a diferenças vasculares limita a capacidade de analisar dados multi-modais e observar as mudanças para uma abordagem de grupo sábio se os dados não são adquiridos em simultâneo em sujeitos individuais. O método pressentido aqui permite adquirir tanto DIFUSÃO e [18F] FDG dados no mesmo animal, antes, durante e após a provocação hipóxica, de modo a interrogar alterações fisiológicas imediatas.

A Figura 1 mostra o resultado de uma ligação adequada da artéria carótida comum, antes de fechar a ferida com a sutura de seda 6-0. Neste método, os dados obtidos a partir de imagiologia é altamente dependente do arranjo temporal da experiência, que por sua vez determina e é também ditada pela limitações experimentais, incluindo sistemas de aquisição de imagem e a configuração do equipamento. Estas e outras considerações são ainda mais exploradas na seção...

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Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

O método aqui apresentado utiliza a tomografia por emissão de pósitrons simultânea e ressonância magnética. No modelo de hipoxia-isquemia cerebral, alterações dinâmicas no metabolismo de glicose e de difusão ocorrem durante e após a lesão. O dano em evolução e irreproduzível neste modelo exige aquisição simultânea, se dados de imagens multi-modais significativas devem ser adquiridos.

Simultânea de imagem PET / MRI Durante Rato isquemia-hipoxia cerebral

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

simultaneous-petmri-imaging-during-mouse-cerebral-hypoxia-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K visualizações.  University of California, Davis.  O método aqui apresentado utiliza a tomografia por emissão de pósitrons simultânea e ressonância magnética. No modelo de hipoxia-isquemia cerebral, alterações dinâmicas no metabolismo de glicose e de difusão ocorrem durante e após a lesão. O dano em evolução e irreproduzível neste modelo exige aquisição simultânea, se dados de imagens multi-modais significativas devem ser adquiridos. 

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Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo do rato de Oclusão da Artéria Cerebral Média

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Medicina

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Não-invasivo de medição óptica do metabolismo cerebral e Hemodinâmica em Lactentes

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando uma janela craniana para Visualizar a artéria cerebral média Durante endotelina 1 Induzida por oclusão da artéria cerebral média

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Um Modelo de acidente vascular cerebral trombótico Baseado em Transient isquemia-hipoxia cerebral

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Indução e Micro-CT Imaging de malformações cavernosas cerebrais no modelo de Mouse

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Oclusão de artéria Cerebral média, permitindo a reperfusão através de reparação de artéria carótida comum em ratos

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...