Agradecemos ao Dr. Maiken Nedergaard (University of Rochester Medical Center) para o design da placa cabeça. O trabalho foi suportado por concessões do NIH para SD (R01DA026325 e P30AI078498 e subsídios da Fundação para o KK (DANA Cérebro fundação e programa Immunoimaging, American Heart Association 0635595T ea Associação ALS [# 1112)]).

1. Preparação do animal para imagiologia Nota: Nós usamos adultas camundongos C57BL. Diferentes linhagens transgênicas podem ser utilizados dependendo da questão de pesquisa. Cirurgias microvasculares e oximetria de pulso são facilitadas em camundongos com pele branca (por exemplo, estirpe FVB). <ol><li> Preparar o sítio cirúrgico na bancada. Todos os instrumentos cirúrgicos precisam de ser autoclavada ou desinfectado com etanol a 70%. </li><li> Inserir uma sonda rectal, e medir continuamente a temperatura corporal do animal ao longo do procedimento </li><li> Anestesiar o mouse utilizando inicialmente 5% isoflurano. Em 15-30 s, quando o animal não estiver em movimento, coloque-o sobre uma almofada de aquecimento (37 ° C), e aplicar uma máscara facial para o fornecimento contínuo de ar contendo 1,3-1,5% de isoflurano). Certifique-se que o animal não está respondendo a um estímulo da dor (por exemplo pitada cauda). </li><li> Use gel de lágrima artificial para cobrir os olhos do rato, para evitar a exposição ao ar seco. </li><li> Usando um barbeador elétrico, remova f cabelorom da cabeça e de ambas as coxas. Aplique removedor de pêlos (por exemplo, Nair) na coxa por 2 minutos, e, em seguida, limpe-a com cuidado para remover os pêlos restantes. Este coxa será usado para a oximetria. </li><li> Desinfectar o couro cabeludo usando um 10% de solução de povidona-iodo e etanol a 70%. </li></ol> 2. Preparação da janela aberta crânio craniana <ol><li> Começando 5 milímetros caudal do crânio, fazer uma incisão no couro cabeludo com uma tesoura, e avançar um centímetro. Mover pele para os lados para expor o crânio. </li><li> Para remover as membranas no topo do crânio aplicar solução de cloreto de 10% férrico para o topo do crânio. Limpe o excesso de solução, e raspe as membranas acabar com 45 ° de ângulo # 5 pinças. É importante para preparar o local com cuidado, de modo a assegurar que a placa de cabeça pode ser firmemente ligado ao crânio (passos # 4-6). </li><li> Usando um microscópio de dissecção, identificar a área de interesse. Note-se que as suturas cranianas deve ser evitado porque o crânio cuma quebra de forma imprevisível ao longo destas linhas. </li><li> Aplicar uma fina camada de cola rápida (por exemplo, locktite 454) em torno das bordas da janela da placa de cabeça (Figura 1). Posicionar a placa de cabeça de tal maneira que a área de interesse está exposta na janela. Aplique uma leve pressão sobre a placa de cabeça. Aplicar uma pequena quantidade de cimento dental para polimerizar a cola-se rapidamente. Mantenha por 10 segundos, enquanto a cola é polimerização. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de cola rápida para as bordas da janela para selar a placa de cabeça e do crânio. Aparafuse a placa de cabeça para o detentor de animais no âmbito da dissecção. </li><li> Usando o Microtorque broca II fixado em 6000 rpm e uma IRF broca 005, remover toda a cola extra do crânio e da placa de cabeça. Qualquer cola restante sobre a placa de cabeça deve ser removido, uma vez que, de outro modo interferir com a fixação da tampa de vidro. </li><li> Definir a broca a 1000 rpm, e iniciar a perfuração do crânio, fazendo um círculo dentro da janela de placa de cabeça, diâmetro ~ 5 mm. Use leves movimentos radicais como se você estivesse desenhando com um lápis muito macio. Pare de perfuração a cada 20-30 segundos para remover o pó de osso que usa ar comprimido. Nota: A forma da abertura na placa de cabeça permite o acesso adicional para a broca (por cirurgião esquerda e destro), o que torna mais fácil para criar uma janela circular craniana. Além disso, os dois furos em forma de ímpares proporcionar o espaço necessário para inserir um eléctrodo de Clark-eléctrodo ou vidro-no tecido cerebral sob a janela do crânio para medições adicionais polarográficas ou electrofisiológico. </li><li> À medida que a perfuração progride, uma toca é formado em torno do crânio intacto no centro. Tenha cuidado para não picar através do crânio diluído, mas para fazer isso toca da mesma espessura. Tenha cuidado extra em torno de grandes vasos de sangue, que não deve ser comprometida e, se possível, nem sequer tocou. </li><li> Use uma &quot;perna&quot; de pinças # 3 para levantar (&quot;flick off&quot;) do osso no centro da janela. Aplicar uma gota de artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) sobre a janela. </li><li> Wipe aCSF suavemente, utilizando um canto do papel de tecido mole (por exemplo, Kimwipe). Geralmente a dura-máter é danificado em um ou mais locais em torno da borda da janela. A partir de um destes locais, levante cuidadosamente e depois remover a dura-máter a partir da superfície do cérebro, utilizando pinças 45 ° ângulo # 5. Ao escolher o local em que começar a remover a dura-máter, evitar as áreas adjacentes às grandes vasos sanguíneos. Se ocorrer sangramento, aplicar uma gota de aCSF e esperar por 2-3 min para o sangramento menor para parar. </li><li> Preparar 0,07% de agarose de baixo ponto de fusão dissolvido em aCSF) Traga a agarose fundida à temperatura do corpo. Enxugar o excesso de aCSF a partir da superfície do cérebro. Despeje a agarose na janela, e cubra com uma lâmina de vidro. Pressione o vidro suavemente para fazer um contacto entre o vidro ea placa de cabeça, e esperar 10-20 seg até que a agarose é sólido. </li><li> Remover o excesso de agarose a tampa de vidro, usando uma pinça e papel de tecido mole. </li><li> Coloque uma pequenaquantidade de cola rápida em torno do vidro para colar o vidro para a placa de cabeça. Aplicar uma pequena quantidade de cimento dental para solidificar a cola (Figura 1). </li></ol> 3. A injeção intravenosa e monitorização da oxigenação arterial Nota: Foram utilizados rotineiramente na veia femoral para aplicação intravenosa de Texas Red, em vez de na veia da cauda. Isto é porque injecções na veia femoral fornecer injecções de bolus seguras e reprodutível do corante. <ol><li> Ligue o animal parcialmente sobre a expor o interior da coxa esquerda. Use fita adesiva para prender o animal nesta posição. </li><li> Aplicar esfrega anti-séptico e, em seguida etanol a 100% para a pele. </li><li> Faça uma incisão ao longo da coxa medial do joelho até a sínfise púbica. Separados tecidos moles por dissecção romba, usando uma pinça # 5. </li><li> Encher seringa de 1 ml com 130 uL de Texas Red (2,5 mg / ml). Coloque uma nova agulha (calibre 30), e dobre-o cuidadosamente a 30 °, mantendo o bisel para cima. Preencha o wi agulhath Texas Red solução. </li><li> Sob um microscópio de dissecção, inserir a agulha na veia femoral e injectar 100 uL de Texas Red. Remova a agulha e pressione levemente a veia com uma gaze para parar o sangramento. </li><li> Feche a pele usando sutura 4-0. </li><li> Para o monitoramento contínuo de sangue SpO 2 (para garantir a oxigenação adequada do sangue) coloque a sonda do oxímetro na coxa direita (de que o cabelo foi previamente removido). </li></ol> 4. Dois fótons de imagem Nota: Nós usamos uma Olympus Fluoview1000 multifotônica sistema de imagem (vertical) com um Spectra-Physics Maitai HP femtosegundo DeepSee Ti: Sa laser como uma fonte de excitação. Para imagem, usamos × 10 NA 0,45 (Zeiss C Apochromat-), ou × 25 NA 1,05 (Olympus XLPlan N) imersão em água objectivos. Tomamos imagens em 12-bit de profundidade em uma resolução de 512 × 512 pixels com um pixel tempo de permanência de 2 mS. O NADH e Texas-Vermelho-dextran são simultaneamente excitado a 740 nm, e fluorescence é separada da luz de excitação utilizando um espelho dicróico / perto-IR-bloqueio combinação de filtro (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, EUA), dividido em dois canais utilizando um espelho dicróico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, EUA), e passa-banda filtrada (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Laser de energia medido após o objectivo era 10-20 mW para imagens em camada I e 20-50 mW para a imagem latente na camada II. <ol><li> Transferir o rato cirurgicamente preparado para a fase de microscópio. Tome uma visão inicial do site janela craniana com uma iluminação de campo claro com ampliação de 4x para usar como um mapa de referência para o registro com maior ampliação de dois fótons angiografias. </li><li> Amplie a área de interesse utilizando magnificação de × 10. Seleccionar uma área de interesse, em camadas corticais I ou II (até 150 um abaixo da superfície pial). Se ampliação maior for desejado, utilizar × 25 objectivo </li><li> Iniciar gravar a série temporal (Figurasre 2). Sugerimos utilizando uma média de 3-5 quadros para aumentar a qualidade da imagem. </li><li> Induzir hipoxemia adicionando N2 50% para o ar que o animal está respirando. Isto trará o nível de O2 a 10%. Verifique hipoxemia através do monitoramento de dados do oxímetro. </li><li> Continuar a gravar a série tempo através de hipoxemia (por exemplo, durante 30 segundos) e, após o nível de O2 normal é restaurado. </li><li> Recolher dados para o cálculo da distribuição de oxigénio através da detecção, medição e quantificação da área de cilindros de tecido hipóxia e oxigenado em torno dos vasos sanguíneos. </li></ol> 5. Informática <ol><li> Determinar o cilindro de tecido Krogh raio R. Isto pode ser feito manualmente (Figura 3) através da medição da distância entre o centro do vaso sanguíneo e do limite em que a fluorescência de NADH elevada for detectada. </li><li> Alternativamente, use o computacional investigador independente determinação semi-automatizada do raio R tecido cilindro eo blo Centralod r vaso que foi descrito anteriormente 1 em forma complementar e resumidos na secção discussão deste protocolo. </li><li> Determinar a área de hipóxia usando open-access software de análise de imagem, por exemplo, ImageJ. Para fazer isso, usar o sinal de NADH, definir um limite que delineia a área de alta intensidade NADH e, em seguida medir a área com fluorescência elevada tecido NADH. </li></ol> 6. Os resultados representativos A Figura 2 mostra um vídeo de NADH / angiografia imagens durante a hipoxemia transitória (para a versão em PDF desta Figura, selecionadas imagens estáticas foram usados). A concentração de oxigénio inspirado foi diminuída de 21% a 10% durante um período de 3 min. Este nível de hipoxemia induzida experimentalmente é suficiente para induzir hipóxia grave no córtex cerebral. Hipóxia conduziu a um aumento na fluorescência de NADH, inicialmente nas superfícies que são mais afastada do fornecimento de sangue arterial. Observe o tecido NADH afiadafronteiras, que representam limites de tecido observáveis ​​de difusão de oxigênio da microcirculação cortical. A imagem da Figura 3 mostra a geometria dos limites de oxigénio de difusão circundantes vasos cerebrais. É possível deduzir Krogh diâmetros dos cilindros a partir destes limites, tal como descrito anteriormente 1. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> Figura 1. (A) do rato com a janela craniana preparado para geração de imagens. (B) Dimensões da placa de cabeça. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> Figura 2. Endógena NADH fluorescência verde visualizado com dois fotões de imagem através da janela craniano, aproximadamente 50 um abaixo da superfície pial. Os vasos sanguíneos são visualizados com Texas Red dextrano. Oxigénio no ar inalado foi reduzida para 10% durante 3 min, e então restaurado para 21%. Barra de escala: 50 ìm. &lt;img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg /&quot; /&gt; Figura 3. Geometria do NADH limites de fluorescência. Contorno amarelo mostra limite de hipóxia funcional; círculos azuis mostram projetadas oxigenados (Krogh) cilindros. As linhas azuis mostram raios cilindro; números mostram raios em micrômetros.

<ol>
	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Informações de alta resolução espacial sobre a difusão do oxigênio é importante para entender como o fluxo de sangue no cérebro é regulado para fornecer oxigênio para as células cerebrais, e para atender à demanda metabólica. Tradicionais medições de oxigênio polarografia utilizando eletrodos de Clark estilo de vidro são altamente invasivos e têm baixa resolução espacial 2-3 e tempo de resposta significativa (segunda faixa). Até agora, o método não invasivo apenas para medir a pO 2 no tecido cerebral é têmpera fosforescência, onde a taxa de decomposição da sonda animado é proporcional à concentração de oxigénio 4. Este método proporciona concentrações de oxigênio precisos, mas requer um corante de propriedade e um sofisticado sistema de imagens tecnicamente fosforescência vida. Aqui, nós demonstrar uma abordagem direta e simples que podem ser realizados em um sistema de imagem padrão de dois fótons com dois canais flurescence. Nossa abordagem tira proveito de um sinal de tecido intrínseco 5 and só requer visualização contrastante da microcirculação cortical. Devido ao aumento não-linear, essencialmente binária de NADH fluorescência a funcionalmente limitando concentrações de oxigénio 1, o aumento da fluorescência intrínseca NADH é observada apenas em áreas com significativo, hipoxia metabolicamente limitante. Uma implicação importante é que os limites de tecido de difusão de oxigênio a partir de microvasos corticais são diretamente observáveis ​​por mudanças de intensidade de fluorescência de forma cilíndrica NADH endógeno. Referimo-nos a estas estruturas como as garrafas de Krogh, porque o conceito de estruturas de forma cilíndrica que definem o volume oxigenado de tecido circundante de um vaso sanguíneo foi introduzido por agosto Krogh e foi recentemente observada experimentalmente usando dois fotões NADH imagem 1. Imagens cilindros Krogh podem ser coletadas em 3D, tendo uma pilha z-de quadros de imagem. Eles são especialmente proeminente na vizinhança das arteríolas penetrantes e eles são wit congruenteh capilar esgotados cilindros 1,4 tecidos periarteriolares. Para proporcionar uma determinação objectivo do raio R Krogh tecido do cilindro (ver Secção 5.2) foram medidos os seus valores de intensidade de pixel radiais dentro de um segmento bem definida entre o centro do cilindro e do limite exterior usando a função de Matlab &quot;improfile&quot;. O limite exterior do segmento deve ser escolhido para estender com uma margem de segurança para além do limite visível. Para melhorar o nível de sinal-para-ruído que averageed sobre todas as linhas radiais necessários para cobrir o segmento de cilindro visível em passos de 1 °. O resultante perfil de intensidade média radial dentro do segmento exibiram um aumento acentuado que correspondia ao R visível do tecido de limite. O que se encaixam uma função sigmoidal (por exemplo, a função de Boltzmann) para o perfil de intensidade média radial e utilizou o seu ponto de inflexão (também conhecido como x 0) como uma definição de R. O correspondente dois-pHoton microangiography (Texas-vermelho) revelou a secção transversal de um vaso sanguíneo central solitário no centro do cilindro. O diâmetro do vaso sanguíneo central pode ser aplicada directamente para determinar r. Dois fótons NADH imagem fornece a mesma resolução espacial que a imagem de alta resolução simultânea do microangiography cortical. Uma característica importante para a aplicação quantitativa deste método é que p 50 do aumento de fluorescência de NADH foi medido como sendo de 3,4 ± 0,6 mm Hg 1 e que a intensidade de fluorescência de NADH como uma função do tecido microrregional pO 2 pode ser descrito matematicamente com uma função sigmoidal. . Nós mostramos que esta técnica permite um para identificar áreas do cérebro que são mais vulneráveis ​​a hipoxia (diminuindo o teor de oxigénio no ar a 10%). Mostramos também que a difusão do oxigênio segue um padrão perivascular geométrica simples. Um critpasso ical para este método é a qualidade da preparação janela craniana. A cirurgia deve produzir danos mínimos de modo a não perturbar o fluxo sanguíneo para a área exposta. Uma preocupação é que, em uma preparação cirurgicamente comprometida, o córtex sob a janela pode ser hipóxico para começar, impedindo qualquer experiências significativas. Uma janela bem preparado craniana deve ter intactas vasos sangüíneos maiores e menores, com fluxo de sangue vivo em todos os tipos de navios e sem sangramento significativo ao longo das bordas. Sob condições de normóxia (PaO2 mmHg 80-100, Sp O2 97-99%), o parênquima cerebral deve apresentar uniforme, homogênea, sem fluorescência NADH conspícuos, retalhos de tecidos brilhantes com fluorescência NADH elevada. A restrição física fundamental de nossa abordagem é limitada profundidade de penetração. O azul-verde de fluorescência de NADH no cérebro é rapidamente atenuada pela absorção de hemoglobina e de espalhamento do tecido a estes comprimentos de onda. Mesmo com abertura numérica elevada de água (por exemplo, 1,05)objetivas de imersão de dois fótons NADH imagem está actualmente limitada a cortical camadas I e II. Esta limitação é cientificamente relevante porque o metabolismo da energia no, ou em proximidade à matéria branca provavelmente diferem de matéria cinzenta. No entanto, a investigação de profundas estruturas corticais tais como camadas IV-VI ou estruturas subcorticais tais como tratos de substância branca ou o corpo estriado exigiria a utilização de microlentes especializadas, tal como descritos no córtex do rato in vivo 6. NADH baseado medição dos limites de difusão de oxigénio pode ser especialmente útil quando combinado com outras medições, tais como as análises de hiperemia funcional, e detecção de taxas de fluxo capilar 7. Por exemplo, esta técnica pode ser adaptado para visualizar hipoxia em acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) modelos. A geometria simples de difusão de oxigénio permite prever o gradiente de oxigénio em leitos microvasculares em circunstâncias em que a densidade capilar é devincado 8 (por exemplo, AD 9) e para examinar se as regiões cerebrais de tecido com densidade capilar reduzida estão em risco aumentado de dano devido à hipóxia microstrokes. A capacidade de imagem microregionally também permite que um para examinar a geometria e tamanho de microstrokes de tecido e de determinar o volume de tecido no qual ocorre a hipóxia, bem como a relação entre a hipóxia tecidual e subsequente morte neuronal ou remodelação capilar 10. Finalmente, uma vez que aumentos de fluorescência NADH endógeno são a conseqüência direta da disfunção mitocondrial aguda, esse método cria a oportunidade de usar imagens de NADH como repórter específico para o metabolismo de energia neural 11 e um proxy para a disfunção mitocondrial. Em conclusão, dois fotões de imagem de fluorescência de NADH endógena é uma ferramenta simples, pouco exigente que pode ser usado para compreender a entrega de oxigénio eo consumo no cérebro sob tanto normaise nos estados patológicos.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Almofadas de aquecimento </td><td> Além de calor Bodi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pomada oftálmica (lágrimas artificiais) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidona-iodo solução a 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solução de cloreto férrico a 10% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cimento </td><td> Stoelting Empresa </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> 454 cianoacrilato </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II handpiece kit </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Broca IRF 007 bits de </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps # 5 </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps # 5/45 </td><td> Belas Ferramentas Ciência </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 lamela de vidro </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo fotomultiplicador </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Sapphire laser de Mai-Tai </td><td> Spectra Physics- </td><td> &amp;nbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

A capacidade do cérebro para funcionar a níveis elevados de demanda metabólica depende de suprimento contínuo de oxigênio através do fluxo sanguíneo e difusão de oxigênio nos tecidos. Aqui nós apresentamos um protocolo experimental visualizados e metodológico para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional e inferir gradientes de oxigênio perivasculares do córtex mouse. Baseia-se a relação não linear entre dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) intensidade de fluorescência endógena e da pressão parcial de oxigénio no tecido, onde o tecido observadas NADH fluorescência aumenta abruptamente a níveis de tecidos de oxigénio abaixo de 10 mmHg 1. Nós usamos dois fótons excitação a 740 nm que permite a excitação concomitante de fluorescência intrínseca tecido NADH e plasma sanguíneo em contraste com Texas Red-dextran. As vantagens deste método sobre as abordagens actuais incluem o seguinte: leva vantagem de um sinal de tecido intrínseca e pode ser realizada usando o padrão de dois fotões in vivo imenvelhecimento equipamento, que permite a monitorização contínua em todo o campo de visão com uma resolução de profundidade de aproximadamente 50 um. Nós demonstramos que as áreas cerebrais de tecido mais afastadas dos vasos sanguíneos cerebrais correspondem a áreas de mananciais vulneráveis ​​que são os primeiros a tornar-se funcionalmente hipóxica após um declínio na oferta de oxigênio vascular. Este método permite a oxigenação imagem microrregional cortical e, portanto, útil para examinar o papel da alimentação inadequada ou restrito de oxigênio nos tecidos em doenças neurovasculares e derrames.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Aqui nós descrevemos um método para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional no córtex do rato<em&gt; In vivo</em&gt;. Baseia-se na imagem de dois fotões concomitante de dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) e da microcirculação cortical. Este método é útil para a análise de alta resolução de fornecimento de oxigénio do tecido.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K visualizações.  University of Rochester Medical Center. Aqui nós descrevemos um método para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional no córtex do rato In vivo. Baseia-se na imagem de dois fotões concomitante de dinucleótido adenina nicotinamida (NADH) e da microcirculação cortical. Este método é útil para a análise de alta resolução de fornecimento de oxigénio do tecido.

Vídeo: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.