Esta pesquisa foi financiada pela Ciência Natural e do Conselho de Investigação do Canadá Engenharia, do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde e do CHU de Québec Centro de Pesquisa.

1. Fabricação e Montagem do biorreator estática <ol><li> Fabricação do Reservatório <ol><li> Preparar 50 ml de tubos de centrífuga como um reservatório de meio de cultura para o bioreactor. </li><li> Adicione duas portas através da perfuração de dois diâmetros de orifícios 5 milímetros, a 20 mm a partir do fundo e o topo do reservatório, respectivamente. Em seguida, insira dois acessórios luer em tubos de silicone comprimento 5 mm. Press-fit estes acessórios luer através dos orifícios, e selar todas as ligações com cola de silicone de grau médico. </li><li> Inserir um filtro para o orifício superior do reservatório (Figura 1A) de 0,22 um. </li><li> Inserir um septo luer na porta inferior do reservatório (Figura 1A). </li></ol></li><li> Mandril-cap Assembléia <ol><li> Perfurar um furo de 4,5 milímetros de diâmetro no centro da tampa do tubo de ventilação do reservatório, sem danificar a membrana de filtro que cobre os furos de arejamento. </li><li> Prepare uma barra de agitação (diâmetro = 4.5 mm, comprimento = 100 mm) Como um mandril para a construção. </li><li> Prepare duas rolhas cónicas silicone (comprimento = 10 mm, diâmetro furo médio = 4.5 mm). </li><li> Montar o mandril e a tampa (complexo de mandril-tampão) como descrito na Figura 1B. <ol><li> Press-fit do mandril para dentro do buraco. Inserir as duas rolhas sobre o mandril, de modo que a tampa é montada entre eles. Ajustar a posição do mandril de modo a que o seu comprimento útil é de 78 mm. </li><li> Aplicar um primário e, em seguida, cola de silicone de grau médico para as superfícies que irão estar em contacto antes de se juntar a tampa e as rolhas cónicas silicone juntos. Remova o excesso de cola na tampa. </li></ol></li><li> Deixe secar em temperatura ambiente por 1-3 dias. </li></ol></li><li> Fabricação de gaze-apertos <ol><li> Prepare três tubos de silicone (tubo 1: diâmetro interno = 6,4 mm, comprimento = 5 mm; Tubo 2: diâmetro = 6,4 mm, comprimento = 10 mm, e o tubo 3: diâmetro = 3,1 mm, comprimento = 12 mm). </li><li> Monte as gaze-apertos como descreverd na Figura 1C. <ol><li> Cut tubo 1 longitudinalmente, e abri-lo ao longo do tubo 2. Stick-los juntamente com a cola de silicone. </li><li> Corte gaze cirúrgica esterilizada 5 cm x 7 centímetros folha e, em seguida, enrole firmemente a gaze sobre o tubo 3 ao longo do lado mais longo da gaze. Insira o tubo 1 tubo 2 complexo sobre a gaze. </li><li> Adicionar cola de silicone para furar a gaze em conjunto, o tubo de um complexo de tubo 2 e o tubo 3. Cortar a gaze com um comprimento de 8 mm. </li></ol></li></ol></li><li> Assembléia e Esterilização <ol><li> Monte o complexo mandril-tampão e os gaze-apertos como descrito na Figura 2. <ol><li> Brasão do mandril com graxa de grau médico (Figura 2A). Coloque as pegas de gaze sobre o mandril (Figura 2B). Distanciar os apertos no valor fixo de 35 mm a partir de cada outro. </li><li> Preparar um molde tubular, removendo a parte inferior de uma seringa de 10 ml utilizando uma serra de mesa (último comprimento = 8 mm) ( <strong&gt; Figura 2B). </li></ol></li><li> Insira o molde sobre o conjunto de mandril-tampão de gaze apertos equipada (complexo de habitação de molde), que se encaixam no molde sobre a rolha de silicone (Figura 2C). </li><li> Autoclave do reservatório e do complexo de habitação de molde. Nota: Tenha cuidado para segurar a rolha de silicone com força ao inserir o molde para evitar o seu desprendimento. </li></ol></li></ol> 2. Engenharia de células musculares lisas Construções baseados em gel de colágeno e estático Maturação <ol><li> As construções de engenharia <ol><li> Expandir as células porcinas aórticas de músculo liso (pSMCs) em 175 cm2 frascos de cultura cheio com 20 ml de meio de cultura completo consistindo de Dulbecco Modified Eagle Médium suplementado com 10% (v / v) de soro de porcino (PS), 10% (v / v ) de soro fetal de bovino (FBS), 1% (v / v) de penicilina-estreptomicina (pen-strep). </li><li> No ≈90% de confluência, retire pSMCs (passagem 2-4), removendo o meio de cultura a partir dobalão de pSMCs, a adição de 5 ml de solução de tripsina (1x em solução salina tamponada com fosfato, PBS) e incubação durante 10 min (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade). </li><li> Ressuspender as pSMCs a uma concentração de 4 x 10 6 células / ml em meio de cultura completo. </li><li> Preparar a solução de colagénio, tal como descrito anteriormente 10. <ol><li> Extrair e coletar feixes de colágeno de tendões rato-cauda em uma solução PBS. </li><li> Colocar as fibras de colagénio, posteriormente, em acetona (5 min), isopropanol a 70% (v / v) (5 min) e ácido acético (0,02 N, 48 h, 4 ° C) de soluções. </li><li> Mistura-se a solução viscosa e congelamento a -20 ° C durante 3 dias. </li><li> Liofilizar a solução congelada para obter esponjas de colagénio. </li><li> Solubiliza-se as esponjas de colagénio em solução de ácido acético (0,02 N) a uma concentração de 4 g / L e centrifuga-se a 29.581 g durante 45 min vigor. </li><li> Esterilizar a solução de colágeno através de processo de diálise contra s subsequentesolutions de ácido acético (0,02 N, 1 h), clorofórmio a 1% (v / v, 1 hora) e ácido acético (0,02 N, solução estéril mudado a cada 2 dias, durante 1 semana). </li><li> Recolher a solução esterilizada de colagénio (4 g / L) num capuz de cultura de células estéril. </li></ol></li><li> Prepare géis de colagénio celularizados como mostrado na Figura 3. <ol><li> Preparar 50 ml de solução tampão estéril através da mistura de 35 ml de DMEM (5x), 4 ml de tampão HEPES (1 N), 3 ml de NaOH (1 N) em 8 ml de água desionizada estéril. </li><li> Preparar células e mistura de gel de colagénio em um recipiente colocado em gelo por mistura de 50% (v / v) de solução estéril de colagénio (4 g / L de ácido acético 0,02 N) com 25% (v / v) de solução tampão e 25% (v / v) de a suspensão de pSMCs em meio de cultura completo. </li></ol></li><li> Medir o pH da mistura e assegurar que é entre 7,0 e 7,4. </li><li> Despeje delicadamente 9 ml de mistura de células-e-colágeno na / complexo acima indicado habitação molde (passo 1.4.3, Figura 3A-B </strong&gt;). </li><li> Deixe que gelificar à temperatura ambiente durante 1 h, sob o capuz de cultura de células (Figura 3B). </li></ol></li><li> Maturação in Static Bioreactor <ol><li> Retirar o molde (Figura 3C) e transferir cuidadosamente o construto para o reservatório, que contém 35 ml de meio de cultura (Figura 3D). </li><li> Incubar a construção (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade) em posição vertical para 1 ou 2 semanas de maturação estática. </li><li> Instalar uma webcam (selada, a fim de garantir o isolamento) no interior da incubadora em frente do construto. </li><li> Mudar o meio de cultura a cada 2 dias, aspirando o meio antigo a partir do porto Luer septo e re-enchimento do reservatório com uma quantidade equivalente de meio de cultura fresco. </li></ol></li><li> Medição da Espessura e metabólica Actividade de SMC-colagénio Constructos gel à base durante a cultura estática <ol><li> Coloque o interferômetro de varredura a laser para a cultu celularre capuz e lançá-lo a partir da vertical para a posição horizontal utilizando um nível de bolha. </li><li> Transferir o biorreactor dentro do capuz de cultura de células e remover a construção do reservatório. </li><li> Transferir o construto (ainda montado no mandril) para a via de o feixe de laser, e colocá-la estritamente ortogonal em relação ao eixo do feixe (como mostrado na Figura 4). </li><li> Ler o valor exibido no ecrã da digitalização interferómetro laser, que corresponde ao diâmetro externo do construto. </li><li> Calcula-se a espessura da parede da construção com base no seu diâmetro externo e interno (ou seja, o diâmetro do mandril). Nota: Repita os passos 2.3.1 a 2.3.5 a cada hora para a primeira 12 horas e depois a cada 24 horas. </li><li> Use 1 ml de meio de cultura de idade (amostrado ao mudar o meio de cultura, passo 2.2.4) para a medição das concentrações de lactato e de glucose com o analisador de gás do sangue. </li><li> Use 1 ml dameio de cultura fresco como um nível de linha de base para as medições de concentrações de glucose e lactato 14. Nota: Repita os passos 2.3.6 e 2.3.7 a cada 2 dias após o meio de cultura de mudança. </li></ol></li><li> Construir colheita para Mais mecânico e biológico Ccharacterizations <ol><li> Após 1 ou 2 semanas de período de maturação estática, transferir o biorreactor estática dentro do capuz de cultura de células. </li><li> Transferir suavemente a construção madura a partir do seu mandril (carta de vídeo 1) para uma placa de 100 mm de diâmetro de Petri contendo 40 ml de meio de cultura fresco (Figura 5 e Figura 7A). </li></ol></li></ol> 3. Caracterização mecânica das construções nas direcções longitudinal e direcções circunf erencial <ol><li> Instalar o conjunto experimental constituído pelo verificador micromecânica equipado com uma célula de 5 ou 10 N de carga e um banho contendo PBS a 37 ° C para manter as amostras de umt condições pseudo-fisiológico (Figura 6). </li><li> Balanço da célula de carga eo extensômetro. Nota: O balanceamento é uma função integrada no testador micromecânica que consiste em repor o valor da extensão exibida eo valor da carga exibido quando nenhuma amostra é montado na máquina. Esta função permite definir a referência para ambas as medições. </li><li> Montagem das construções tubulares para o aparato mecânico: sentido longitudinal. Nota: Executar testes de fadiga longitudinais diretamente sobre a totalidade das construções tubulares. Use embutido-casas dispositivos de aperto para ligar as pegas de gaze das construções para a célula de carga e para a base do banho de PBS. <ol><li> Monte o tubular construir sobre os dispositivos de aperto (Figura 7b), seguindo o procedimento de colheita (seção 2.4). </li><li> Enrole os dispositivos de aperto e as pegas de gaze em conjunto com a fita de teflon para evitar qualquer deslizamento dos apertos de gaze durante o ensaio.Monte a amostra para o testador micromecânica (Figura 7C). </li></ol></li><li> Montagem das construções em forma de anel para o aparato mecânico: direcção circunferencial. Nota: Executar testes de fadiga circunferenciais em espécimes em forma de anel seccionados das construções tubulares. Use duas barras de aço inoxidável como alças para a fixação das amostras. <ol><li> Monte o tubular construir em um tubo de plástico como um suporte marcado com lacunas cinco milímetros (Figura 7B), na sequência da colheita (seção 2.4). </li><li> Cortar 10 milímetros anéis da construção tubular. </li><li> Medir o comprimento da amostra, utilizando um paquímetro para as análises posteriores. </li><li> Montar o modelo em forma de anel sobre as barras de aço inoxidável do testador de micromecânica (Figura 7C). Certifique-se de colocar a amostra no centro das barras. Nota: O tubo de plástico no passo 3.4.1, e um sistema de corte, conforme mostrado na Figura 7B </strong&gt; são utilizadas para evitar quaisquer danos para a construção durante o corte. </li></ol></li><li> Ensaio de fadiga em constructos na direcção longitudinal ou circunferencial. <ol><li> Estique a construção de seu comprimento de medida inicial. </li><li> Manter a construção nesta posição durante 10 minutos em ambiente de pseudo-fisiológica. </li><li> Aplicar 10% de deformação cíclica do comprimento de medida inicial (30 ciclos) para a construção de 5% da taxa de deformação / seg. </li><li> Repetir o passo 3.5.3 em passos incrementais de 10% de deformação cíclica até falha da amostra. Nota: O uso do meio de pseudo-fisiológicas requer tomando em consideração a flutuação e a inércia do sistema de preensão que afectam a medição da carga aplicada. </li><li> Grave o fundo da seguinte forma: <ol><li> Mova o quadro de carga para o comprimento de medida inicial. </li><li> Repetir o 3.5.3 e 3.5.4 passos sem qualquer amostra montada, e manter os dispositivos de preens ligados à célula de carga (apenas 1 ciclo é requivermelho). </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Luminal Endotelização de construções Nota: Após seguir o protocolo de colheita (secção 2.4), as construções de suportar o manuseamento para ser montado na parede do biorreactor-rotação adicional para o endotelização. <ol><li> Girando-parede biorreator projeto <ol><li> Perfurar um furo de 4,5 milímetros de diâmetro no centro da tampa do tubo de ventilação do reservatório, sem danificar a membrana de filtro que cobre os furos de arejamento. </li><li> Encaixe à pressão de um mandril (diâmetro = 4.5 mm, comprimento = 40 mm) no furo e fixar o mandril conforme descrito no passo 1.1.2. </li><li> Prepare o apoio de dois silicone em forma de C para o diâmetro externo construção = 14 mm; diâmetro interno = 8 mm). </li><li> Posicionar um motor em rotação em uma extremidade do biorreactor-parede e um rolamento rotativo sobre a outra extremidade (Figura 8B). </li></ol></li><li> Lumen Endotelização <ol><li> Expandir umbílicos humanoai veia células endoteliais (HUVECs) em 25 centímetros 2 frascos de cultura com 5 ml de meio de cultura M199 suplementado com 10% (v / v) de PS, 10% (v / v) de FBS, 1% (v / v) pen-strep na placa de Petri dentro de uma incubadora (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade) até 90% de confluência. </li><li> Prepare a 1,5 ml da solução de revestimento de proteína por construção necessário para a adesão celular óptima por diluição da mistura de concentrado de proteína de 10,5 ng / ml em meio de cultura de células endoteliais sem soro. </li><li> Medir o comprimento da construção utilizando uma craveira. </li><li> Calcular o volume da luz V e a área luminal A do construto como: V = D em 2 L / 4 e A = D em L, respectivamente, (em que D é o diâmetro interno correspondente ao diâmetro do mandril, e L é o comprimento da construção). </li><li> Posicionar o construto no centro do reservatório de acordo com o procedimento de colheita (secção 2.4).Usar o suporte de silicone em forma de C para fixar o construto em ambas as extremidades para o reservatório (Figura 8A). </li><li> Encha o reservatório com 35 ml de meio de cultura. </li><li> Encher 75% do volume da luz calculado da construção (V) com a solução de revestimento de proteína preparada no passo 4.2.2. Fechar ambas as extremidades do construto para evitar qualquer fuga de solução de revestimento de proteína (Figura 8A). </li><li> Monte o sistema de biorreator-parede rotativa dentro da capa de cultura de célula. </li><li> Inserir o biorreactor em um temperatura de 37 ° C incubadora e iniciar a rotação do bioreactor a 4,02 x 10 -5 força g durante 1 h para permitir que o revestimento do lúmen, como mostrado na Figura 8B. </li><li> Abrir a extremidade superior do constructo e aspirar a solução de revestimento de proteína a partir do lúmen. </li><li> Retire HUVEC (passagem 2-3) através da remoção do meio de cultura do frasco de células HUVEC e a adição de 3 ml da solução de tripsina (em PBS 1x). EUncubate durante 5 minutos (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade). </li><li> Ressuspender as células HUVEC a uma concentração de 4 x 10 6 células / ml em meio de cultura M199 suplementado. </li><li> No interior do capuz de cultura de células, células HUVEC sementes para o lúmen da construção com uma densidade de 1000 células / cm 2 15. Fechar as extremidades superiores do construto para evitar qualquer fuga de solução de HUVECs. </li><li> Incubar as construções (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade) alojado na parede do biorreactor-rotação (Figura 8B) e a cultura durante 2 dias a uma rotação constante de 4,02 x 10 -5 g força. </li><li> Recolher as construto após 2 dias de cultura em condições estéreis e prepará-la para posterior caracterização biológica como descrito na secção 2.4. </li></ol></li></ol>

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Nenhum financiamento foi recebido de organizações ou agências com potencial conflito de interesses.

Entre a comunidade de engenheiros de tecidos vasculares, enormes esforços têm sido feitos para reproduzir a camada de túnica média responsável pela estabilidade mecânica dos vasos sanguíneos 16. Desde o trabalho pioneiro de Weinberg e Bell 17, colagénio tem sido amplamente utilizado como um andaime para engenharia de tecido vascular devido a sua biocompatibilidade, propriedades não imunogénicas e disponibilidade. No entanto, a utilização de colagénio representa um grande desafio para os investigadores, como este material não é fácil de manusear, devido à falta de rigidez intrínseca mecânica. Manipulações durante a preparação do andaime pode danificar os andaimes, comprometendo-los para uso posterior. A técnica descrita neste trabalho permite: i) para a engenharia géis de colagénio em celularizados uma geometria de forma tubular, ii) para a engenharia de tecidos biológicos suficientemente forte para ser manuseado após um curto período de maturação estática (uma ou duas semanas), iii) como apropriedades mecânicas e viscoelásticas sess de tais tecidos biológicos em forma tubular em duas direcções. As células no gel desempenhar um papel-chave na remodelação da matriz de colagénio. Durante o período de maturação, SMCs contráteis levou à compactação dos géis produzindo uma construção com maior estabilidade mecânica que poderiam ser avaliados nas direções longitudinais e circunferenciais. Em seguida, células HUVEC semeadas no lado luminal das construções gerado um endotélio homogénea e viável, demonstrando assim a adequação dos géis de colagénio para aplicações de engenharia de tecidos vasculares. O biorreator apresentada neste trabalho foi projetado especificamente para fornecer um ambiente ideal para o crescimento celular durante a maturação estática. Além disso, os dispositivos desenvolvidos para a caracterização das propriedades mecânicas e viscoelásticas das construções foram concebidos com o objectivo de reduzir qualquer dano potencial inerente à manipulação detais materiais delicados. Assim, o biorreactor foi estático equipado de um filtro de 0,22 um e uma membrana de filtro na tampa (passo 1.1.2, Figura 1A e B) que permitiu a troca gasosa entre o meio de cultura no interior do reservatório e da incubadora, mantendo um ambiente de cultura estéril. O septo luer na parte inferior foi usada como uma porta de amostragem de meio de cultura e durante a cultura estática mudando. Alguns passos críticos têm de ser considerados durante a fabricação construção e caracterizações. Todas as manipulações realizadas no (passo 2.1.1 e nos passos subsequentes) que podem alterar a esterilidade do sistema foram realizados numa hote estéril biológica. Células e gel de colágeno preparação mistura foi tratada com gelo, a fim de retardar o processo de gelificação (passos 2.1.4 a 2.1.7). No passo 2.1.7, quaisquer bolhas de ar aprisionadas na mistura antes da gelificação são zonas de concentração de tensões potenciais que podem comprometer a slucratividade das construções. Portanto, a remoção de tais bolhas de ar requer um pouco agitando a montagem ou usando médicos de vácuo durante 3 minutos para Desgasificação em condições estéreis. Por último, as garras foram concebidos especificamente para manter o eixo do mandril central no molde tubular durante a gelificação e para permitir a manipulação delicada dos construtos durante a colheita (remoção do mandril, secção 2.4), para endotelização, e para facilitar a montagem sobre o sistema mecânico (testes longitudinais). O presente protocolo propõe uma abordagem original e fácil de processo alternativo de reforço de géis de colágeno construções com base no potencial inerente contrátil natural de PMEs. As técnicas comuns de matrizes de colagénio reforço envolvem o uso de agentes de reticulação físicas e químicas que podem ter efeitos nocivos sobre as interacções de células-matriz 18-20. A técnica de fabricação apresentado emeste trabalho permite dirigir este processo de remodelação células orientado para produzir uma construção de engenharia de tecidos, com propriedades mecânicas em causa sem qualquer tratamento físico ou químico. Caracterização de propriedades mecânicas e viscoelásticas de géis de colágeno hidratado é um grande desafio. Nesta perspectiva, o presente protocolo descreve um método simples e eficiente original para avaliar as propriedades mecânicas dos tecidos moles tubulares. Esta caracterização pode ser realizada não só na direcção periférica, mas também na direcção longitudinal, directamente em toda a estrutura tubular. Durante a caracterização mecânica, temperatura, ambiente aquoso, pH e força iónica são alguns dos factores ambientais que são conhecidos por afectar drasticamente o comportamento mecânico dos tecidos biológicos 21. Assim, o presente trabalho sugere um set-up e protocolo original para a caracterização mecânica dos tecidos biológicos em um ambiente altamentepseudo-reprodutível ambiente fisiológico (solução salina a 37 ° C e pH 7,4). Para o melhor de nosso conhecimento, este tipo de caracterização nunca foi relatado em outros lugares. Em conclusão, a técnica proposta neste trabalho demonstra o elevado potencial de mistura directa de células com colagénio para aplicações de engenharia de tecidos vasculares. Este método, juntamente com o processo de caracterização mecânica e endotelização constituem protocolos polivalentes elevados. Assim, através de ligeiras modificações das set-ups e protocolos, mantendo o mesmo raciocínio, os principais requisitos para a engenharia de equivalentes de tecidos vasculares podem ser abordados, como o processamento rápido e sem complicações, incluindo Endotelização, ea possibilidade de ser transposto para uma ampla gama de suave tecidos com vários comprimentos e diâmetros. Além disso, diferentes tipos de células aderentes, proteínas da MEC e geometrias moldados podem ser investigados quanto a um número de applicati segmentadosons, tais como tendões de engenharia, enxertos de pele, manchas cardíacas, nervos, entre outros. Embora as propriedades mecânicas das construções são encorajadores, eles são ainda mais baixos do que os de tecidos nativos. Neste contexto, acreditamos fortemente que um período de maturação estática muito curto é um passo crucial para a estimulação dinâmica em um biorreator, conduzindo assim a uma maior integridade estrutural e estabilidade mecânica. No entanto, a possibilidade de produzir rapidamente celularizados construções à base de colágeno engenharia de tecidos adequados para mecânica e análises histológica faz com que o biorreator estática aqui descrita uma ferramenta útil e promissor para fornecer informações sobre a interação entre células e ECM durante o crescimento e remodelação, ou mesmo para ser utilizada como um modelo para as terapias e sistemas de entrega de drogas.

Engenharia de tecido vascular prevê diferentes estratégias que visam a fabricação de vasos de engenharia, incluindo enxertos sintéticos baseados em andaimes, vasos sanguíneos engenharia de tecidos à base de folha de celular (TEBVs) e matriz extracelular (MEC) TEBVs componentes baseados. Entre essas abordagens, polímeros sintéticos apresentam boas propriedades mecânicas, mas compartilham uma desvantagem comum, pois falta uma bioatividade. O método baseia-camada de células permite a produção de substitutos vasculares artificiais, com altas propriedades mecânicas, mas o tempo necessário para produzir tais enxertos é de aproximadamente 28 semanas 2. Biopolímeros naturais da ECM, tais como colagénio, elastina, fibrina 3 ou uma combinação dos mesmos, continuam a ser os materiais padrão de ouro para andaimes para engenharia de tecidos. Isto é principalmente pela razão de que estes materiais possuem geralmente uma boa biocompatibilidade ao ser capaz de induzir respostas celulares funcionais 4-5. Entre estes biopolímeros, colagénio do tipo I é uma das proteínas de suporte de carga mais abundante e predominante da ECM em muitos tecidos, como a pele, vasos sanguíneos e dos tendões. Um trabalho extensivo tem sido realizados sobre as propriedades mecânicas do colágeno 6-8, mas tem havido poucos estudos sobre remodelamento celular de géis de colágeno durante a maturação estática. Remodelamento celular refere-se às modificações estruturais da matriz de colágeno induzida por células que poderiam afetar a estabilidade da rede de fibrilas de colágeno 9. Como um andaime natural, relativamente grandes quantidades de colagénio do tipo I pode ser isolado, esterilizado e armazenado a partir de diferentes fontes, tais como os tendões da cauda de ratos-10. Compreender interacções celulares com colagénio e os comportamentos relacionados mecânicas globais dos andaimes de colagénio celularizados (construções) é um passo essencial para a construção de tecidos. TEBVs à base de colagénio pode ser processado através da mistura de células directamente com colagéniodurante a preparação do gel e moldado em formas mais específicas tais como tubular e plana 11. Células vasculares no interior dos géis proliferar e tipo I colágeno remodelação 12. Assim, este método evita a necessidade de macroporosidade específico que representa um dos problemas significativos no desenvolvimento de andaimes para aplicações de engenharia de tecidos. No entanto, as principais desvantagens de géis de colagénio são as suas propriedades mecânicas baixas em comparação com materiais sintéticos 13. Neste estudo, um tecido viável, com uma distribuição homogénea de células foi manipulada por mistura directa de colagénio com células em um processo de um só passo. &quot;estáticas&quot; bioreactores foram usadas para o 1 ou 2 semanas de maturação estática dos géis de colagénio celularizados (sem restrições mecânicas dinâmicas externas aplicadas). Durante a cultura, a remodelação da matriz de colagénio ocorreu, proporcionando assim o reforço estrutural para as construções. Além disso, estas construções foram rEady para ser transferido para um biorreactor de parede rotativa e um endotélio homogénea foi alcançado. Além disso, neste trabalho um protocolo específico testes mecânicos também é proposto o fornecimento de uma nova abordagem adequada na caracterização das propriedades mecânicas dos tecidos moles tubulares. Em resumo, este trabalho apresenta um método para a fabricação e a maturação dos tecidos vasculares que são suficientemente fortes para serem tratadas, não só para caracterizações biológicas e mecânicas, mas também para outras condicionado mecânica num biorreactor dinâmico, o que é considerado essencial uma rápida in vitro passo na regeneração de tecidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes</td>
			<td>CELLTREAT Scientific Products</td>
			<td>229-475</td>
			<td>Centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male luer with lock ring x 1/8&#34; hose barb. PP. 25/pk</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-45503-04</td>
			<td>Luer fittings for &#34;gas-exchange port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female luer x 1/8&#34; hose barb adapter. PP. 25/pk</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-45500-04</td>
			<td>Luer fittings for the &#34;medium sampling port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft.</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-17</td>
			<td>Tube 1 and 2 for the gauze grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft.</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>RK-96410-16</td>
			<td>Tube 3 for the gauze grippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silastic Medical adhesive silicone, type A</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>-</td>
			<td>Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvent 4 Vessel venting filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6713-0425</td>
			<td>Filter for &#34;gas exchange port&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rod. PP. stirring. 8&#8217;&#8217;</td>
			<td>Scienceware</td>
			<td>377660008</td>
			<td>Mandrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopper silicone rubber 00 PK12</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59590-084</td>
			<td>Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krytox PFPE/PTFE Greases</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>GPL 202</td>
			<td>Medical grade grease for covering the mandrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xiameter RTV-4130-J base and curing agent</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>-</td>
			<td>C-shaped silicone support for endothelialization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Gibco (Life Technology)</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure acetone (99%)</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>AP0102</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC610080040</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific,&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FL070494</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform solution (99%)&#160;</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>CR 0179</td>
			<td>Chemical for collagen extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>163716</td>
			<td>Chemical for construct preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Laboratoire Mat Inc.</td>
			<td>SR-0169</td>
			<td>Chemical for construct preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LaserMike 136</td>
			<td>LaserMike</td>
			<td>Series 183B</td>
			<td>Scanning laser interferometer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroPulse MicroTester</td>
			<td>Instron Corporation</td>
			<td>-</td>
			<td>Micromechanical Tester</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Media M199/EBSS, 500 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>SH30253.01</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum HI - 500mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>SH 30396.03</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum (PS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9783</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Component of cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red</td>
			<td>Sarstedt Inc.</td>
			<td>83.1812.002</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>9583</td>
			<td>pH measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial&#160;</td>
			<td>BD Biosciences - Discovery Labware</td>
			<td>356230</td>
			<td>Concentrate protein mixture for endothelialization process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LifeCam VX-3000</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>-</td>
			<td>Thickness measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical analyzer, DxC600</td>
			<td>Beckman Coulter Unicell Synchron</td>
			<td>-</td>
			<td>Glucose and lactate concentrations measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen fibers</td>
			<td>Rat tails</td>
			<td>-</td>
			<td>Collagen was extracted in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine smooth muscle cells (pSMCs)</td>
			<td>Porcine aortas</td>
			<td>-</td>
			<td>pSMCs were isolated in the laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td>
			<td>Human umbilical veins</td>
			<td>-</td>
			<td>HUVECs were isolated in the laboratory</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 3d cellularized collagen gels for vascular tissue regeneration

Os materiais sintéticos são conhecidos para iniciar complicações clínicas tais como inflamação, estenose, e infecções quando implantado como substitutos vasculares. O colagénio tem sido extensivamente utilizado para uma vasta gama de aplicações biomédicas e é considerado uma alternativa válida para os materiais sintéticos, devido à sua biocompatibilidade inerentes (isto é, baixa antigenicidade, inflamação e respostas citotóxicas). No entanto, as propriedades mecânicas limitadas ea mão baixa-capacidade de géis de colágeno relacionados têm dificultado o seu uso como materiais de andaime para engenharia de tecido vascular. Portanto, a lógica por trás deste trabalho foi a primeira a projetar géis de colágeno celularizados em uma geometria em forma de tubular e segundo para aprimorar células musculares lisas reorganização conduzida de matriz de colagénio para obter tecidos duros o suficiente para ser manuseado. A estratégia aqui descrita baseia-se na montagem directa de colagénio e células do músculo liso (construção) num cyli 3Dgeometria ndrical com a utilização de uma técnica de moldagem. Este processo requer um período de maturação, durante o qual as construções são cultivadas num biorreactor em condições estáticas (sem restrições mecânicas dinâmicas externa aplicada) para 1 ou 2 semanas. O &quot;biorreator estático&quot; fornece um ambiente estéril monitorados e controlados (pH, temperatura, troca gasosa, o fornecimento de nutrientes e remoção de resíduos) para as construções. Durante o período de cultura, as medições de espessura foram realizados para avaliar a remodelação da matriz de colagénio-células impulsionadas, e consumo de glucose e as taxas de produção de lactato foram medidos para monitorizar a actividade metabólica das células. Finalmente, as propriedades mecânicas e viscoelásticas foram avaliadas para as construções tubulares resultantes. Para este fim, os protocolos específicos e um know-how concentrado (manipulação, segurar, que trabalha em ambiente hidratado, e assim por diante) foram desenvolvidas para caracterizar os tecidos de engenharia.

Este trabalho descreve a fabricação de construções à base de colágeno tubulares modificadas contendo células vasculares. Já depois de 1 hora de início de gelificação, mistura de células-colagénio e foi montada directamente em uma geometria tubular 3D, com o diâmetro externo igual ao diâmetro do molde correspondente (cerca de 14 mm). Ao longo de toda a maturação estática, medições revelaram a rápida redução do diâmetro externo das estruturas celularizados tubulares, como mostrado na Tabela 1. O diâmetro dos géis de colagénio celularizados encolhido de cerca de 60% ​​do seu valor inicial após 1 dia de cultura estática, e de quase 85% no prazo de 7 dias (Supplemental Vídeo 2). SMC dentro das construções são responsáveis ​​pela observada encolhimento e o reforço mecânico relacionados, como este fenómeno não ocorre em andaimes de colagénio não celularizados. Note-se que nenhum gradiente de qualquer tipo (térmica, bioquímica, mecânica, ou outros) foi aplicada. As células-driven compactação resultou em um material com maior densidade de colágeno, que pode ser tratada e subjugado às solicitações mecânicas (Vídeos Suplementar 3 e 4). Para relacionar a remodelação células orientado para as propriedades mecânicas e viscoelásticas gerais, ensaios de fadiga foram realizados nas construções (Vídeos complementares 5 e 6). Estes testes consistiram no ciclismo os constructos (30 vezes) em diferentes estirpes constantes (10%, 20%, e 30% do comprimento do calibre inicial) e para gravar o stress como a resposta das construções para a solicitação mecânica ao longo do tempo. Os resultados representativos para uma construção são mostrados na Figura 9. A construção suportou tensões mais elevadas na direcção longitudinal (75 kPa) do que na direcção periférica (16 kPa) quando sujeito à mesma gama de tensão (30% de deformação). Enquanto isso, em cada ciclo, o valor pico de tensão alcançou o tatensão máxima rgeted diminuiu ao longo do tempo. Este comportamento é típico das elevadas propriedades viscoelásticas, exibida por estas construções à base de colagénio. A actividade biológica das construções de celularizados foi avaliada durante a maturação estática. Assim, a actividade metabólica das SMCs foi avaliada através da medição do consumo de glucose e produção de lactato durante a cultura estática. O meio de cultura foi amostrado a cada 2 dias e glicose e concentrações de lactato foram medidos usando um analisador de gases no sangue. O aumento constante de consumo de glucose e produção de lactato combinados para a diminuição importante das construções, atestam a actividade SMCs ao longo de toda a cultura estática (Figura 10). O aumento da estabilidade mecânica devida à remodelação conduzido de células permitiu a manipulação das construções e o processo endotelização subsequente. Coloração tricromo de Masson realizada nas construções endothelializedmostrou um endotélio altamente homogénea. SMC exibiram uma morfologia fusiforme e apareceu como homogeneamente disperso através da parede, enquanto HUVECs apareceu bem distribuídos no lado luminal (Figura 11). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1:. Os componentes do bioreactor O bioreactor estática estático consistiu de um tubo de 50 ml de centrífuga modificado (A) e uma tampa equipada mandril (B). O tubo serviu como reservatório de meio, e foi equipado com uma porta para um filtro de 0,22 um, para a troca de gás, e um septo, por meio de amostragem e a mutação. Um mandril presente na tampa ventilada permitiu a fabricação de construções em forma tubular. As pegas de gaze (C) foram concebidos e fabricados para suportar a gelificação das construções sobre o mandril. Além disso, estesapertos permitiu que os construtos de ser tratado após a maturação estática e para ser fixo ao aparelho mecânico. O diâmetro externo do mandril era de 4,7 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: Montagem do biorreactor estática fases de montagem do bioreactor antes da esterilização.. As pegas de gaze foram montadas no mandril (A) a uma distância fixa. Um molde foi inserido (B) e firmemente fixo à rolha de silicone (C). O diâmetro externo do mandril era de 4,7 mm. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3:. Fabricação das construções em condições estéreis as células e colagénio mistura foi vertida para o molde de alojamento complexo-<html> (A), e deixar de gel durante 1 hora à temperatura ambiente (B). Em seguida, o molde foi removido (C), o bioreactor foi montado estática (D) e transferidos para dentro de um reservatório para a maturação estática da construção na incubadora (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade). O diâmetro externo do mandril era de 4,7 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. Medição da espessura / diâmetro externo das construções Um interferómetro de varrimento a laser usado para efectuar a medição dos diâmetros externos das construções. A construção foi colocado no percurso do feixe de laser e gerado uma sombra. A largura da sombra, o que corresponde ao diâmetro exterior da construção, foi então medida e apresentada no ecrã. e_content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5:. Aparência morfológica da construção colhidas (A), logo após a gelificação e (B) depois de células-conduzida remodelação estática durante a maturação durante 2 semanas. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6: Montagem experimental para caracterizações mecânicas Consistia do testador de micromecânica equipado com uma célula de 5 ou 10 N de carga e um banho contendo PBS a 37 ° C para manter as amostras em condições pseudo-fisiológica.. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig7highres.jpg" width="700" /> Figura 7: A preparação da amostra f<html> ou caracterizações. mecânicas de colheita de amostra (A) e preparação de (B) para os testes de fadiga realizados nas direcções longitudinal e as direcções circunf erencial (C). O diâmetro externo do mandril era de 4,7 mm. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig8highres.jpg" width="600" /> Figura 8: biorreactor-parede rotativa (A) As construções tubulares foram montadas no centro do reservatório com a ajuda do suporte de silicone em forma de c.. Ambas as extremidades da construção foram fechadas para evitar qualquer fuga de solução de HUVECs. (B) As construções foram cultivadas em incubadora (T = 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade) em rotação a 4,02 x 10 -5 g força durante 2 dias. 2 / 52812fig9highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 9:.. Caracterizações mecânicas Os resultados dos testes de fadiga realizados em construções em longitudinal (A) e (B) circunferenciais direções depois remodelação orientada por celular <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/52812fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52812/52812fig10highres.jpg" width="600" /> Figura 10:. A actividade metabólica das SMCs dentro dos géis de colagénio As medições da taxa de consumo de glucose e taxa de produção de lactato foram realizadas com o analisador de gás do sangue a cada 2 dias, após a mudança de meio de cultura. Meio de cultura fresco foi usado como um nível de linha de base para as medições de glucose e concentrações de lactato. Figura 11: Lumen Endotelização imagens histológicas das secções transversais radiais de construções tubulares.. Tricoma coloração de construções tubulares de Masson estaticamente cultivadas durante 1 semana (A) e 2 semanas (B). H &amp; E coloração de uma construção tubular (C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tempo </td><td> Espessura (mm) </td><td> Compactação (%) </td></tr><tr><td> 0 hr </td><td> 4,83 ± 0,02 </td><td> 0 ± 0 </td></tr><tr><td> 2 hr </td><td> 4,26 ± 0,02 </td><td> 12 ± 0 </td></tr><tr><td> 4 hr </td><td> 4,21 ± 0,03 </td><td> 13 ± 1 </td></tr><tr><td> 6 hr </td><td> 4,06 ± 0,10 </td><td> 16 ± 2 </td></tr><tr><td> 12 hr </td><td> 3,16 ± 0,07 </td><td> 35 ± 1 </td></tr><tr><td> 1 dia </td><td> 2,08 ± 0,11 </td><td> 57 ± 2 </td></tr><tr><td> 1 semana </td><td> 0,68 ± 0,07 </td><td> 86 ± 1 </td></tr><tr><td> 2 semanas </td><td> 0,36 ± 0,00 </td><td> 93 ± 0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: compactação rápida construção de diâmetro durante a maturação estática A espessura da parede das construções e a taxa de compactação, como uma função do tempo de cultura estática.. A compactação foi medida por determinação do diâmetro externo das construções tubulares com um interferómetro laser de varredura (Série 183b, LaserMike 136). Após 24 h, as construções compactado para 57% ± 2% das suas dimensões moldadas. Os dados são expressos como média ± SD (n = 3). A presença ea atividade das células musculares lisas viver era o único responsável por essas grandes mudanças. Supplemental Vídeo 1:. colheita dos géis não remodelado colágeno tubular <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> Suplementar Video 2:. Impulsionadas Células-compactação de géis de colágeno tubulares <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video2.m4v" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> Suplementar Video 3:. Manipulação dos géis não remodelado colágeno tubular <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video3.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> Suplementar Video 4:. A manipulação das células-remodelados géis de colágeno tubular <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video4.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver th</a>é vídeo. Suplementar Vídeo. 5: ensaio de fadiga Longitudinal (em 30%) em células-remodelados géis de colágeno tubular <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video5.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> Suplementar Vídeo. 6: teste de fadiga circunferencial (em 30%) em células-remodelados géis de colágeno tubular <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52812/JoVE_Video6.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a>

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Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

engineering-3d-cellularized-collagen-gels-for-vascular-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

20.6K visualizações.  Laval University. In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Vídeo: Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Bioengenharia

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

Engenharia de Tecidos de um 3D Humano<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Teste de Tumor

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also respond to neural injuries and act to protect the tissue from degenerative events. In vitro studies of astrocytes&#39; functionality are important to elucidate the mechanisms involved in such events and contribute to developing therapies to treat neurological disorders. This protocol describes a method to biofabricate a neural-like tissue structure rich in astrocytes by 3D bioprinting astrocytes-laden bioink. An extrusion-based 3D bioprinter was used in this work, and astrocytes were extracted from C57Bl/6 mice pups&#39; brain cortices. The bioink was prepared by mixing cortical astrocytes from up to passage 3 to a biomaterial solution composed of gelatin, gelatin-methacryloyl (GelMA), and fibrinogen, supplemented with laminin, which presented optimal bioprinting conditions. The 3D bioprinting conditions minimized cell stress, contributing to the high viability of the astrocytes during the process, in which 74.08% &#177; 1.33% of cells were viable right after bioprinting. After 1 week of incubation, the viability of astrocytes significantly increased to 83.54% &#177; 3.00%, indicating that the 3D construct represents a suitable microenvironment for cell growth. The biomaterial composition allowed cell attachment and stimulated astrocytic behavior, with cells expressing the specific astrocytes marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and possessing typical astrocytic morphology. This&#160;reproducible protocol provides a valuable method to biofabricate 3D neural-like tissue rich in astrocytes that resembles cells&#39; native microenvironment, useful to researchers that aim to understand astrocytes&#39; functionality and their relation to the mechanisms involved in neurological diseases.

Here we report a method of 3D bioprinting murine cortical astrocytes for biofabricating neural-like tissues to study the functionality of astrocytes in the central nervous system and the mechanisms involving glial cells in neurological diseases and treatments.

Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...

Isolation and Culture of Primary Human Gingival Epithelial Cells using Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is an important structure of gingival tissue, especially in the repair and regeneration of periodontal tissue. Studying the functions of gingival epithelial cells has crucial scientific value, such as repairing oral defects and detecting the compatibility of biomaterials. As human gingival epithelial cells are highly differentiated keratinized cells, their lifespan is short, and they are difficult to passage. So far, there are only two ways to isolate and culture gingival epithelial cells, a direct explant method and an enzymatic method. However, the time required to obtain epithelial cells using the direct explant method is longer, and the cell survival rate of the enzymatic method is lower. Clinically, the acquisition of gingival tissue is limited, so a stable, efficient, and simple in vitro isolation and culture system is needed. We improved the traditional enzymatic method by adding Y-27632, a Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor, which can selectively promote the growth of epithelial cells. Our modified enzymatic method simplifies the steps of the traditional enzymatic method and increases the efficiency of culturing epithelial cells, which has significant advantages over the direct explant method and the enzymatic method.

Here we present a modified method for the isolation and culture of human gingival epithelial cells by adding the Rock inhibitor, Y-27632, to the traditional method. This method is easier, less time-consuming, enhances stem cell properties, and produces larger numbers of high-potential epithelial cells both for the laboratory and for clinical applications.

Isolamento e Cultura das Células Epiteliais Gengivais Humanas Primárias usando Y-27632

The gingival tissue is the first structure that protects periodontal tissues and plays meaningful roles in many oral functions. The gingival epithelium is ...