VSR foi apoiada por uma IIF Marie Curie Grant (FERIDAS NA TERRA, sigla para: Ferida induzida sinais elétricos em Arabidopsis thaliana).

1. Aphid Empinar Nota: A escolha de espécies de plantas e de afídeos para gravações EPG depende do objetivo da pesquisa. Para estudos sobre a Arabidopsis thaliana, o pulgão Brevicoryne brassicae é apropriado. <ol><li> Traseira B. pulgões brassicae em uma estufa em Brassica oleracea. Manter as plantas utilizadas para a criação pulgão em gaiolas, a fim de evitar a contaminação de outras plantas. Manter plantas de criação de pulgões e plantas experimentais (no nosso caso B. oleracea e A. thaliana) em salas separadas, a fim de evitar a contaminação de plantas experimentais com pulgões. </li><li> Transferir pulgões para plantas frescas sobre a cada 2 semanas, antes de causar danos às plantas significativa, ou chegar a superpopulação. Transferir 10-20 pulgões adultos a uma planta criação fresco para iniciar uma nova colônia. </li><li> Monitorar criação plantas regularmente para contaminação por espécies de afídeos indesejados, outros insetos herbívoros, parasitóides de afídeos e fungi que podem afetar a saúde da colônia pulgão. </li><li> Recolha adultos, pulgões sem asas até uma semana após a sua última muda para a gravação EPG. </li><li> Após os experimentos, as plantas experimentais regresso que não foram utilizados para a câmara de crescimento, como muitas vezes eles têm alguns descendentes que foi produzido durante a gravação, o que poderia inadvertidamente contaminar outras plantas. </li></ol> 2. Insect Fiação para gravação EPG <ol><li> Para fazer eletrodos de insetos, obtenha pinos do conector de bronze (pregos, Ø 1,2 milímetros), fio de cobre fino (0,2 milímetros Ø), fio de ouro muito fina (Ø cerca de 20 mm), cola de prata à base de água, um parafuso de solda pequeno simples com fluido de solda e fio de solda com núcleo de resina, microscópio estereoscópico com ampliação de 10X, uma tesoura pequena ou bisturi, dois pinça fina, e uma folha de isopor ou caixa. Nota: Um misturador de vórtice pode ser útil. Nota: O protocolo passo-a-passo para fazer eléctrodos é indicado na Figura 2. </li><li> Para pulgãomanuseamento e de aplicação de cola, obtém-se: um pequeno pincel macio e camelhair aguarela (tamanho 2 ou menor) e os pinos de insectos, tais como aqueles usados ​​para conjuntos de insectos, embora uma agulha de costura ou palito fino pode funcionar tão bem. Passo 4 mostra como para iniciar a gravação EPG. </li><li> Passo 1. Nota: Os passos 1 e 2 abaixo mostram como preparar eletrodos de insetos menos o pulgão. Passo 3 mostra como ligar um afídeo ao eletrodo. Aspirador de fixação do pulgão é recomendado durante a fiação, mas nem sempre necessária para as espécies que se deslocam lenta (por exemplo, B. brassicae). <ol><li> Ligue o parafuso de solda e derreter algum fio de solda na sua ponta (Figura 2A). Umedeça a cabeça do pino conector de bronze com um pouco de fluido de solda (Figura 2B) e mergulhe-o de solda de metal derretido (Figura 2C). </li><li> Aplicar um revestimento de solda fundida de metal sobre uma extremidade de uma peça de 1-2 cm de comprimento do fio de cobre fina (figura2D). Em seguida, leve o fio do pino e cobre juntos contra o parafuso quente (Figura 2E) e movê-los juntos longe para esfriar e solidificar (Figura 2F). </li></ol></li><li> Passo 2. <ol><li> Completamente agitar (ou vortex) o frasco com cola de prata por vários minutos até que uma emulsão suave é mostrado. Cut (tesoura ou bisturi) alguns pedaços de fio de ouro (de cerca de 1,5 cm de comprimento) sobre o objeto placa do microscópio estereoscópico (Figura 2G). </li><li> Com um pino de bronze com fio de cobre soldada (feito na seção 2.3) e mergulhar a extremidade livre do fio de cobre para o pequeno reservatório de cola de prata que se reuniram no interior da tampa do frasco após abri-lo (Figura 2H). Nota: Apenas uma pequena gota é necessário. </li><li> Mover o fim-mergulhadas cola do fio de cobre para o pedaço de fio de ouro, ao levantar uma extremidade para evitar manchar a cola sobre a placa estereomicroscópio objecto. Tente se sobrepõem copper e um fio de ouro para alguns mm (Figura 2I), distribuindo a cola ao longo da sobreposição dos dois fios. </li><li> Espere até que a cola tenha sido seco o suficiente para manter os fios unida. Verifique o contato cola após a secagem e adicione um pouco de cola fresca com um pequeno alfinete ou outro pedaço de fio de cobre, se algumas partes dos fios aderiram mostrar peças livre de cola. </li><li> Após o eletrodo inseto está pronto, armazená-lo, por exemplo inserido em um pedaço de isopor. Nota: O comprimento do fio de ouro irá determinar a liberdade de movimento do pulgão: se for muito curto (menos do que 5 mm), o pulgão pode sentir-se constrangido e não irá comportar-se normalmente; se for muito longo (&gt; 2 cm), o pulgão vai mover-se livremente. Pulgões tendem a mover-se para o lado adaxial das folhas, se permitido. Se o fio de ouro toca a folha, o sinal será curto-circuito. </li></ol></li><li> Passo 3. <ol><li> O pulgão pode ser mantido no lugar por meio de sucção de luz, utilizando um vácuo; neste caso, instale tele sucção dispositivo, ao microscópio estereoscópico. Coloque a abertura de aspiração, no centro do campo. </li><li> Agite bem o frasco com cola de prata por vários minutos (ou até que um vortex) emulsão lisa é formado. Recolha um afídeo com a pequena escova. </li><li> Ligar o dispositivo de aspiração e montar o pulgão na abertura de sucção (Figura 2J), com a parte de trás do abdómen virou-se para o experimentador. Com o pincel fino, remova toda a cera da superfície do abdômen (abundante em pulgões de couve). </li><li> Abra o frasco de cola e molhar um pino com uma pequena gota de cola de prata (Figura 2K). Aplique a gota de cola de prata na parte traseira do abdômen do pulgão (Figura 2L-M). Que esta gotícula completamente seco durante vários minutos, agitar vigorosamente o frasco cola novamente e adicionar um segundo gota de cola de prata na parte superior da primeira. Nota: Embora a cola de prata é um condutor eléctrico, que não causa significativadanos à cutícula do inseto. </li><li> Depois de fechar o frasco de cola, inserir a extremidade livre do fio de ouro na gotícula molhado e ainda manter o fio, permitindo a cola secar completamente (Figura 2N). Evitar manchas cola sobre pernas ou antenas e descartar um afídeo se isso aconteceu. </li><li> Desligue o dispositivo de fixação de sucção e cuidadosamente levante o inseto (Figura 2O). Se necessário, utilizar um pincel fino para auxiliar na supressão do pulgão do dispositivo de sucção. Nota: Fiação B. O brassicae não requerem um vácuo, uma vez que pode ser ligado em um pedaço de tecido de um laboratório de precisão, a superfície áspera do que fornece o pulgão com aderência suficiente de modo que não será levantada depois de aplicar uma gota de cola húmida ao seu abdómen. Após secagem da cola pode-se levantar o pulgão do tecido com a ajuda de um pincel fino. </li><li> Insira o pino de bronze com o inseto com fio para o isopor e, se necessário, continuarcablagem de todos os outros insectos a ser usado para a sessão de gravação EPG. Nota: Estes protocolos para a instalação elétrica pulgões funcionar bem para nós. O usuário pode encontrar a sua / seu próprio método para fiação pulgões. </li></ol></li><li> Passo 4. <ol><li> Coloque plantas na gaiola de Faraday (Figura 2P) sobre um suporte não condutor: utilizar placas de Petri ou uma placa de vidro ou de plástico. </li><li> Insira um eletrodo planta no solo de cada vaso. Insira o pino de bronze do inseto com fio ao conector de entrada do pré-amplificador EPG (Figura 2T). Nota: o eléctrodo de terra, não corresponde ao eléctrodo de terra utilizado em outras técnicas electrofisiológicas. Ele tem a tensão de deslocamento necessário para ajustar e compensar as tensões eletrodo de polarização. </li><li> Na interface do software de aquisição Stylet +, com freqüência de amostragem fixa de 100 Hz, digite um nome de arquivo, especifique o tempo de gravação, e escrever um texto para especificar os detalhes da experiência (tratamento, planta / inse<html> ct espécies, etc.) em Linhas de comentário 2 e 3. </li><li> Abaixe os insetos para uma área de pouso adequado da planta e começar a sessão de gravação clicando no botão Iniciar do software de aquisição (Stylet +) interface. Nota 1: um máximo de 8 canais podem ser utilizados simultaneamente num EPG configurado. Um EPG-eléctrodo ou vários EPG-eléctrodos por planta pode ser usado. Nota 2: quando o foco do estudo é o comportamento do pulgão, iniciar a gravação antes do acesso planta dos afídeos para evitar perder as primeiras atividades de penetração planta. </li><li> Para estudar as respostas electrofisiológicos das SE a estímulos, esperar, pelo menos, 10 minutos após o pulgão tenha entrado em fase floema, a fim de assegurar que o pulgão está numa fase ingestão floema sustentada, e que a linha de base do sinal é estável. Só então, iniciar um experimento estimulação da planta. </li></ol></li></ol>tp_upload / 52826 / 52826fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Fazendo EPG-eletrodos com pulgões ou outros insetos hemípteros para gravações gráfico penetração elétrica (EPG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Painéis AI, etapas necessárias para preparar EPG-eletrodos menos o pulgão. Em primeiro lugar, derreter uma peça de metal de solda na extremidade de um parafuso de solda (A). Em seguida, mergulhe a cabeça do alfinete de bronze em uma gota de fluido de solda (B), e entre em contato com o metal derretido na ponta do parafuso de solda (C). Imediatamente após este passo, em contacto com a extremidade de um fio de cobre para a ponta do parafuso de solda, de modo a que a cola da cabeça do pino de latão (EF). Com um bisturi ou uma lâmina, cortar um pedaço do fio de ouro (L). Mergulhoa extremidade livre do fio de cobre (juntou-se na outra extremidade ao pino de latão) sobre a cola de prata (H), e juntar-se rapidamente o fio de ouro a ele (I) antes da prata seca-se. O fio de ouro é um excelente condutor, e pode ser polarizada. Na realidade, na maioria dos casos, a polarização é muito pequeno para ser detectado, e se assim for, isto pode ser compensado com a tensão de deslocamento (V). Painéis de JO, passos necessários para ligar um pulgão (ou outro inseto hemíptero) para o eletrodo. Primeiro, levante cuidadosamente um afídeo com um pincel fino aquarela e colocá-lo na abertura do dispositivo de sucção a vácuo (J). Ligar a bomba de vácuo e cobrir o buraco da válvula de ar com um pedaço de papel para aplicar sucção. Mergulhe a ponta do pino de inseto na cola de prata (K), e colocar uma pequena gota de cola na parte superior do abdômen do pulgão, sob microscópio estereoscópico (LM). Dentro dopróxima ~ 20 seg, antes da gota de cola de prata sobre a seca de afídeos, inserir a extremidade do fio de ouro do eléctrodo de insectos para a gotícula de cola húmida de prata, e mantê-lo no lugar para 1-3 min, até que a cola tem de prata completamente (N) secou-se ao ar. Neste ponto, desactivar sucção através da remoção da folha de papel que cobre o orifício da válvula de ar do dispositivo de sucção e cuidadosamente remover o pulgão, a partir do dispositivo de sucção: levantando o pulgão após a ligação, muitas vezes requer alguma ajuda de um pincel fino (O). Painel P mostra uma visão geral de todo o EPG criada dentro da gaiola de Faraday, e Painel Q mostra uma visão geral da combinação planta-pulgão para EPG. Consulte a seção 2 acima para uma explicação mais detalhada deste processo. Pequenas letras são rótulos referentes aos itens que se deve fazer EPG-eletrodos: um: parafuso de solda; b: derretido do metal de solda;c: fluido de solda; d: bronze conector de pino (unha); e: fio de cobre; f: Fio Ø 18μm ouro; g: dispositivo de sucção; h: pulgão; i: cola de prata à base de água; j: gaiola de Faraday; k: eletrodo planta; l: conector de entrada (BNC) do pré-amplificador EPG.

<ol>
	<li>Salvador-Recatal&#224;, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+in+vivo.+intracellular+recordings+of+caterpillar-induced+depolarization+waves+in+sieve+elements+using+aphid+electrodes.">Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes.</a> New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).</li><li>Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Questions)n+on+phloem+biology.+1.+Electropotential+waves,+Ca2++fluxes+and+cellular+cascades+along+the+propagation+pathway.">(Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway.</a> Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).</li><li>Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. 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WFT launched EPG Systems as a retirement activity, and is affiliated with it financially.

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a tomada elétrica Penetração Gráfico (OPG) gravações. A técnica EPG está bem estabelecida, com 100-200 de usuários ativos em todo o mundo, e tem sido implementada para muitos estudos sobre diferentes temas, por exemplo: a) resistência de plantas para pulgões e outros insetos portadores de estilete 13; b) de vírus de plantas e patógenos mecanismos de transmissão 14; c) Modo de inseticida de ação, (toxicidade e mudanças de comportamento...

A capacidade para produzir sinais eléctricos de longa distância é uma característica vantajosa de organismos multi-celulares que permite respostas eficientes a estímulos externos. Esta característica tem evoluído independentemente em plantas e animais, e representa, portanto, um processo de evolução convergente. Dado que os sinais eléctricos são acoplados com funções importantes em animais, tais como a transmissão neuronal e a contracção muscular, a base molecular, o mecanismo de transmissão, e a função de sinais eléctricos induzidos por estímulos em animais são sujeitos de pesquisa intensiva. Em contraste, induzida por estímulo sinalização elétrica em plantas tem recebido pouca atenção da investigação. Embora as plantas não têm nervos ou músculos, parece haver provas suficientes para assumir que os sinais elétricos induzida por estímulo em plantas desempenham um papel fundamental nas suas respostas aos factores ambientais. O floema, o componente vivo da vasculatura planta, tem sido postulada como uma das principais substrate para a transmissão de sinais eléctricos induzidos por estímulos, a partir estimulada / danificado para áreas não estimuladas intactas / 2. As principais células do floema são os elementos de peneira (SES), células alongadas, relativamente simples. As extremidades das SEs estão ligados a outro SEs, formando um contínuo, de baixa resistência, sistema de tubo de peneira que se espalha por toda a planta. Há, no entanto, muito poucos estudos sobre as propriedades elétricas dessas células altamente especializadas. Nesses estudos anteriores, os pesquisadores acessada SEs com qualquer vidro micro-eletrodos 3 estiletes ou com eletrodos de vidro que foram acoplados a plantar-inseridos de pulgões, após stylectomy (corte) 4. Microeléctrodos de vidro são feitas a partir de capilares de vidro que são puxados numa extremidade com calor para uma ponta fina de menos do que 1 um de diâmetro, e depois encheram-se com uma solução de KCl. Um fio de Ag / AgCl ou platina, inserido no eléctrodo de vidro de KCl cheio é então ligado à entrada do amplificador, e um referenteeléctrodo for inserido no banho em torno da célula de interesse, completando o circuito. Esta configuração regista a diferença de potencial entre o eléctrodo de referência extracelular e intracelular do eléctrodo de medição, ou seja, o potencial da membrana da célula 5. Com este método, Umrath feita a primeira gravação intracelular a partir de uma célula de planta, utilizando as algas Nitella 6,7. Nitella é um organismo relativamente simples com células grandes, e portanto passíveis de experiências electrofisiologia intracelulares. Em contraste, a inserção de eléctrodos de vidro intracelular para as pequenas células de plantas terrestres, tridimensionais multi-celulares é tecnicamente exigente, requer um investigador altamente especializado, bem como a visualização sofisticado, micromanipulação, e material anti-vibração. Apesar de eletrodos de vidro são adequados para gravar a partir de células superficiais em plantas, tais como células epidérmicas raiz 8, recordin intracelulargs de células profundamente enraizado no tecido da planta, tais como SEs, muito prováveis ​​respostas induzidas por causar danos, confundindo os resultados. Em 1989, Fromm e Eschrich relataram a utilização de um método alternativo, designado por &quot;método pulgão &#39;, em que eléctrodos de vidro são acoplados a estiletes afídeos após stylectomy 4. O método pulgão é minimamente invasivo, por estiletes flexíveis não causar danos no tecido ou célula como eléctrodos de vidro fazer. Estiletes afídeos são grande invenção da natureza para a penetração planta, e pulgões são consideravelmente mais qualificados do que os seres humanos em encontrar SEs. Infelizmente, este método pulgão também é altamente exigente em termos de competências e de equipamento técnico. Além disso, o sucesso de cada experiência que implementa esta técnica depende inteiramente do pulgão estar no modo de alimentação - com o estilete estavelmente inserida num SE, no momento da stylectomy. Pensando em retrospectiva, pode-se ver que as chances de sucesso dessa técnica poderia ter sido improved adicionando à configuração experimental um instrumento que permite identificar se o estilete é pulgão na SE quando se aplica stylectomy. Em 1964, McLean e Kinsey descrito um &#39;sistema de controlo electrónico &quot;para o estudo do comportamento de alimentação de afídeos em tempo real 9,10. Neste sistema, o pulgão da planta e penetrou-estilete foram integrados num circuito eléctrico. Mais tarde, em 1978, Tjallingii concebeu uma versão modificada do sistema, chamado sistema de &#39;Electrical Penetration Graph &quot;(EPG) 11,12. Considerando que o sistema original de monitoramento eletrônico foi sensível aos potenciais originou-resistência, apenas com o sistema EPG, a força eletromotriz (fem) originou potenciais, ou seja, gerada na planta ou no inseto, pode ser gravadas, além de potenciais decorrentes da a resistência (R) no insecto. Isto representa uma melhoria importante, porque tanto o sinal componentes, emf e R,fornecer informação biológica relevante sobre os acontecimentos durante a penetração planta por pulgões. O que torna o pré-amplificador EPG sensíveis aos R componentes é a sua relativamente baixa resistência de entrada de 1 GÊ, que é próximo da média da resistência de plantas / pulgão. Uma pequena tensão de deslocamento (Figura 1, V) de cerca de 100 mV é aplicada à planta, o qual, em seguida, é dividido entre plantas e de insectos, de um lado, e a resistência de entrada do outro. As tensões e as alterações são medidas num ponto (Figura 1A, B) entre o insecto e a resistência de entrada. Portanto, o R-componentes representam modulações de resistência de plantas pulgão da tensão de offset, enquanto os EMF-componentes são uma certa fração do potencial da planta na ponta do estilete e potenciais causados ​​no inseto. Os potenciais de plantas - mais relevantes aqui - são potenciais principalmente membrana das células vegetais perfurados por estiletes afídeos. Os potenciais de insectos parecem ser principalmentepotenciais de streaming causadas por movimentos fluidos dentro dos dois canais estilete, ou seja, a comida e os canais salivares; há potenciais nervosas ou musculares internos são registrados no EPG. Na prática, as funções de ponta de estilete como uma ponta do eletrodo. Todas as células vegetais são carregadas negativamente para dentro em relação ao exterior da célula positiva. A corrente eléctrica (isto é, o movimento de iões carregados em solução aquosa) que flui a partir do interior para o exterior e vice-versa é muito limitada devido à alta resistência da membrana celular. Normalmente, o potencial de repouso é mantida constante. No entanto, quando os iões negativos mover para fora ou iões positivos mover-se através da membrana celular, o potencial de membrana é reduzido, isto é, &#39;despolariza&#39;. A despolarização ocorre no caso de excitação celular. Íons, em seguida, entrar ou sair quando os canais iónicos específicos na membrana são abertos ou quando a membrana está danificado e íons vazar dentro e para fora. Todas as células têm canais iônicos e bombas em tele membrana plasmática que trazem o potencial de membrana para o seu nível de repouso, restaurando a concentração original de vários iões dentro da célula. O potencial de repouso e as suas modificações são componentes emf, e, por conseguinte, a técnica do EPG é adequado para medi-los. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" /> Figura 1. EPG-eletrodos. O GPE-eléctrodo é um pulgão de estar integrados no circuito eléctrico de penetração Gráfico (EPG), cuja estilete é inserido um elemento de crivo (SE) no modo de alimentação estável. Se o empalado-SE estilete está em repouso (painel A), a tensão no circuito, gravado por EPG, é estável e, ao nível de potencial de repouso (painel C, de lazer). Se o SE é animado, seus despolariza membranas (painel B), que é visualizada no EPG como um aumento gradual na voltagem (painel C, despolarização). À medida que o equilíbrio iónico no SE retorna ao descanso, ou seja, repolarizes, a tensão registrada por EPG diminui gradualmente ao resto nível potencial (Painel C, Repolarização). No painel C, &quot;A&quot; e &quot;B&quot; referem-se aos diferentes cenários apresentados nos painéis A e B, respectivamente. V = fonte de tensão compensado ajustável. Ri = resistor de entrada. Em paralelo com a resistência externa 1 GÊ, o amplificador tem uma interna (no amplificador operacional) de alta resistência de 1,5 TΩ (painéis A e B, a cinzento). Por controle remoto da chave do pré-amp EPG pode ser alterado de normal a EMF-mode, que permite a obtenção de valores de alta precisão de tensão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Na próxima seção, nós fornecemos o leitor com um protocolo básico para a realização de experimentos EPG que é válido para ambos os estudos de insetos com foco e focou-planta.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brass connector pins</td>
			<td>EPG Systems/hardw.shop</td>
			<td></td>
			<td>&#934; 1.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin copper wire</td>
			<td>EPG Systems/hardw.shop</td>
			<td></td>
			<td>approx. &#934; 0.2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin gold wire</td>
			<td>EPG Systems</td>
			<td></td>
			<td>&#934; 18 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering fluid</td>
			<td>hardware shop</td>
			<td></td>
			<td>matching the soldering wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin-cored soldering wire</td>
			<td>hardware shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-based silver glue</td>
			<td>EPG systems</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.epgsystems.eu/">recipe in: www.epgsystems.eu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper wipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soldering bolt</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Hund Wetzlar</td>
			<td></td>
			<td>minimum magnification is x10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14088-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>A. Hartenstein</td>
			<td>L46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watercolor brushes</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>Number 1 or 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air suction device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see description in: www.epgsystems.eu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>No. 1 or 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Fujitsu Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software</td>
			<td>EPG Systems</td>
			<td></td>
			<td>Stylet+d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giga-4 (-8) Complete System</td>
			<td>EPG Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>includes the following:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Main control box with USB output</td>
			<td></td>
			<td>Di155/Di710</td>
			<td>12/14 bit, rate 100Hz(softw. fixed)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPG probes 4 (8)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50x DC pre-amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swivel clamps on rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power adaptor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant electrodes and cables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional test and ground cables&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a new application of the electrical penetration graph (epg) for acquiring and measuring electrical signals in phloem sieve elements

Propriedades electrofisiológicas de células são frequentemente estudado in vitro, depois dissociando-os dos seus ambientes nativos. No entanto, o estudo de transmissão eléctrico entre células distantes de um organismo requer in vivo, gravações livre de artefactos de células embebidas dentro do seu ambiente nativo. A transmissão de sinais elétricos a partir de feridos para áreas sem ferimentos em uma planta tem, desde há muito despertou o interesse de botânicos. O floema, a parte viva da vasculatura planta que se espalha por toda a planta, tem sido postulada como uma das principais tecido em transmissão eléctrica em plantas. A falta de métodos eletrofisiológicos adequados coloca muitos desafios para o estudo das propriedades elétricas das células do floema in vivo. Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para eletrofisiologia intracelular de elementos crivados (SEs) que usa pulgões vivos ou outros insetos hemípteros floema-alimentação, integrado no gra penetração elétricaph (EPG) circuito. A versatilidade, robustez e precisão deste método, foi possível gravar e estudar em detalhe os sinais elétricos induzidos por feridas em SEs das veias centrais da planta modelo Arabidopsis thaliana 1. Aqui mostramos que GPE-eléctrodos pode ser facilmente implementado para registos electrofisiolicos intracelulares de SE em veias marginais, bem como estudar a capacidade das SE para responder com sinais eléctricos de vários estímulos externos. A abordagem EPG aplicado a electrofisiologia intracelular das SE pode ser implementada de uma grande variedade de espécies de plantas, em um grande número de combinações de plantas / insectos, e para muitos pesquisa pretende.

Em um estudo anterior, implementamos a técnica EPG-eletrodo com o objetivo de caracterizar os sinais elétricos produzidos em SEs do midvein durante o ataque da lagarta 1. A nervura central é um local de inserção preferencial para eléctrodos de vidro convencionais, bem como dos eléctrodos de vidro e de estilete, porque é SE-denso, e relativamente robustos, portanto, susceptível de fixação necessários para a implementação destas técnicas. Aqui, nós tiramos proveito da versatilidade do eletrodo E...

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A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

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Research

JoVE Journal

Environment

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

14.6K visualizações.  University of Würzburg. Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants. 

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Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail millet. Recently, the 510 Mb genome of foxtail millet, S. italica, has been sequenced 1,2 and a 25x coverage genome sequence of the weedy relative S. viridis is in progress. S. viridis has a number of characteristics that make it a potentially excellent model genetic system including a rapid generation time, small stature, simple growth requirements, prolific seed production 3 and developed systems for both transient and stable transformation 4. However, the genetics of S. viridis is largely unexplored, in part, due to the lack of detailed methods for performing crosses. To date, no standard protocol has been adopted that will permit rapid production of seeds from controlled crosses.
The protocol presented here is optimized for performing genetic crosses in S. viridis, accession A10.1. We have employed a simple heat treatment with warm water for emasculation after pruning the panicle to retain 20-30 florets and labeling of flowers to eliminate seeds resulting from newly developed flowers after emasculation. After testing a series of heat treatments at permissive temperatures and varying the duration of dipping, we have established an optimum temperature and time range of 48 &deg;C for 3-6 min. By using this method, a minimum of 15 crosses can be performed by a single worker per day and an average of 3-5 outcross progeny per panicle can be recovered. Therefore, an average of 45-75 outcross progeny can be produced by one person in a single day. Broad implementation of this technique will facilitate the development of recombinant inbred line populations of S. viridis X S. viridis or S. viridis X S. italica, mapping mutations through bulk segregant analysis and creating higher order mutants for genetic analysis.

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

We have developed a methodology for performing crosses in Setaria viridis (S. viridis). The method involves pruning the panicle prior to a hot water treatment to kill viable pollen. Crosses are performed following a well-controlled growth regime and typically result in the recovery of 1 to 7 cross-pollinated seed/s per panicle.

Métodos para a realização Cruzes em<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

Ambiente

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with more than 150 of economic value. It is a major pest of greenhouse crops, especially in Solanaceae and Cucurbitaceae (e.g., tomatoes, eggplants, peppers, cucumbers, zucchini) and greenhouse ornamentals (e.g., roses, chrysanthemum, carnations), annual field crops (such as maize, cotton, soybean, and sugar beet), and in perennial cultures (alfalfa, strawberries, grapes, citruses, and plums)1,2. In addition to the extreme polyphagy that makes it an important agricultural pest, T. urticae has a tendency to develop resistance to a wide array of insecticides and acaricides that are used for its control3-7.
T. urticae is an excellent experimental organism, as it has a rapid life cycle (7 days at 27 &#176;C) and can be easily maintained at high density in the laboratory. Methods to assay gene expression (including in situ hybridization and antibody staining) and to inactivate expression of spider mite endogenous genes using RNA interference have been developed8-10. Recently, the whole genome sequence of T. urticae has been reported, creating an opportunity to develop this pest herbivore as a model organism with equivalent genomic resources that already exist in some of its host plants (Arabidopsis thaliana and the&#160;tomato Solanum lycopersicum)11. Together, these&#160;model organisms could provide insights into molecular bases of plant-pest interactions.
Here, an efficient method for quick and easy collection of a large number of adult female mites, their application on an experimental plant host, and the assessment of the plant damage due to spider mite feeding are described. The presented protocol enables fast and efficient collection of hundreds of individuals at any developmental stage (eggs, larvae, nymphs, adult males, and females) that can be used for subsequent experimental application.

Application of Two-spotted Spider Mite Tetranychus urticae for Plant-pest Interaction Studies

Protocols for efficient preparation of homogenous samples of spider mites, infestation of experimental plants, and assessment of plant damage, as required for studies of plant-pest interaction were developed.

Aplicação de duas avistou Ácaro<em&gt; Tetranychus urticae</em&gt; De Estudos Planta-praga de Interação

The two-spotted spider mite, Tetranychus urticae, is a ubiquitous polyphagous arthropod herbivore that feeds on a remarkably broad array of species, with ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

A remoção do Trace Elements por Óxido de Cupric nanopartículas de urânio<em&gt; In Situ</em&gt; Recuperação sangro água e seu efeito na viabilidade celular

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and enables to perform rapid, automated and simple SPE. The pre-concentrated solution is compatible with analysis by immunoassay, with a low organic solvent content. A method is described for the extraction and pre-concentration of natural hormone 17&#946;-estradiol in 100 ml water samples. Reverse phase SPE is performed with octadecyl-silica sorbent and elution is done with 200 &#181;l of methanol 50% v/v. Eluent is diluted by adding di-water to lower the amount of methanol. After preparing manually the SPE column, the overall procedure is performed automatically within 1 hr. At the end of the process, estradiol concentration is measured by using a commercial enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). 100-fold pre-concentration is achieved and the methanol content in only 10% v/v. Full recoveries of the molecule are achieved with 1 ng/L spiked de-ionized and synthetic sea water samples.

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Um método simples para a extração automatizada de fase sólida das amostras de água para análise imunológica de Pequenas Poluentes

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

Modification and Application of a Leaf Blower-vac for Field Sampling of Arthropods

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropod populations in rice. When used in combination with an enclosure, application of this sampling device provides absolute estimates of the populations of arthropods as numbers per standardized sampling area. The sampling efficiency depends critically on the sampling duration. In a mature rice crop, a two-minute sampling in an enclosure of 0.13 m2 yields more than 90% of the arthropod population. The device also allows sampling of arthropods dwelling on the water surface or the soil in rice paddies, but it is not suitable for sampling fast flying insects, such as predatory Odonata or larger hymenopterous parasitoids. The modified blower-vac is simple to construct, and cheaper and easier to handle than traditional suction sampling devices, such as D-vac. The low cost makes the modified blower-vac also accessible to researchers in developing countries.

Assessment of arthropod abundance in crops is critical for investigating population dynamics and species interactions. Here we describe the modification and application of a leaf blower-vac for suction sampling of arthropods in rice.

Modificação e Aplicação de uma Folha Blower-vac para Campo Amostragem de Artrópodes

Rice fields host a large diversity of arthropods, but investigating their population dynamics and interactions is challenging. Here we describe the ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Medição e mapeamento de padrões de erosão e deposição relacionadas às concentrações de carbonato de solo sob gestão agrícola

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Desenvolvimento de novos métodos para quantificar a densidade de peixes usando ferramentas de estéreo-vídeo subaquáticas

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

O teste de infecção da planta: Spray e inoculação mediada por ferimento com o de patógeno vegetal Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocolo experimental pela análise de perfis de resposta comportamental em peixes Larval: aplicação para a Neuro-estimulantes cafeína

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Combining Eye-tracking Data with an Analysis of Video Content from Free-viewing a Video of a Walk in an Urban Park Environment

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. Eye-tracking informatics are known to connect to a range of feelings, health conditions, mental states and actions. But because vision is the result of constant eye-movements, teasing out what is important from what is noise is complex and data intensive. Furthermore, a significant challenge is controlling for what people look at compared to what is presented to them.
The following presents a methodology for combining and analyzing eye-tracking on a video of a natural and complex scene with a machine learning technique for analyzing the content of the video. In the protocol we focus on analyzing data from filmed videos, how a video can be best used to record participants&#39; eye-tracking data, and importantly how the content of the video can be analyzed and combined with the eye-tracking data. We present a brief summary of the results and a discussion of the potential of the method for further studies in complex environments.

The objective of the protocol is to detail how to collect video data for use in the laboratory; how to record eye-tracking data of participants looking at the data and how to efficiently analyze the content of the videos that they were looking at using a machine learning technique.

Combinando dados de rastreamento de olhos com uma análise de conteúdo de vídeo de livre-visualizando um vídeo de uma caminhada em um ambiente de parque urbano

As individuals increasingly live in cities, methods to study their everyday movements and the data that can be collected becomes important and valuable. ...