Agradecemos Sankalpi Warnasooriya e Amy Humboldt para a leitura crítica e edição do manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Energia (DE-SC0008769) ea National Science Foundation (IOS-1127017).

1. Crescimento de S. viridis <ol><li> Definir as condições da câmara de crescimento a 31 ° C/22 ° C (dia / noite), 12 hr light/12 hr escura, 50% de umidade relativa do ar com um tratamento antes do amanhecer de 15 ° C 08h30-09:00 AM. (Figura 1). Sob estas condições, S. viridis A10.1 demora cerca de 21-22 dias de semeadura para a antese. </li><li> Preencha apartamentos (4 x 9 células) com Metro Mix 360 e remover uma célula para a rega. </li><li> Água levemente névoa na superfície do solo. </li><li> Semear as sementes na superfície do solo, uma semente por célula. </li><li> Cobrir as sementes com uma camada de solo (cerca de 0,5 cm) </li><li> Pulverizar a superfície de apartamentos de solos e de água a partir do fundo. Mantenha a rega de baixo após semeadura. </li><li> Para cada transversal que vai ser executado pelo menos três plantas vão ser utilizados como parentais femininos e nove plantas vão ser utilizadas como os pais do sexo masculino. Semeadura deve ser escalonada, como todas as plantas não florescem no mesmo dia. Sowi Sementeng é recomendada a cada dia durante um período de três dias. </li><li> Molhar as plantas de 1-2 vezes por dia, o que é dependente do tamanho das plantas e as condições do solo. O excesso de água no solo não é favorável para o crescimento óptimo das plantas, e pode levar ao crescimento de fungos no solo e os danos de tecido foliar. </li><li> Fertilizar as plantas duas vezes por semana, usando Jack 15-16-17, a uma concentração de 100 ppm. </li></ol> 2. Aparar e Rotulagem de panículas Antes emasculação - Dia 1 <ol><li> Na parte da tarde ou noite antes da polinização, mover as plantas da câmara de crescimento para o laboratório (A temperatura (T): 24,06 ° C ± 0,13 ° C, humidade relativa (HR) 21,79% ± 1,15%). </li><li> Selecione as panículas primários com 1 flor para 1/3 das flores na panícula que já floresceu. </li><li> Neste estudo, os quatro domínios dentro da panícula são definidos como se segue (Figura 2A; ponta, meio distai, média e proximal de base). </li><li> Idealmente, choosea panícula com 1-5 flores que floresceram, cortou a ponta da panícula (extremidade distal) e remova todas as flores nas seções média e base proximal usando tesoura primavera ou uma pinça fina. </li><li> Se uma panícula tem cerca de 1/10 a 1/5 de flores que floresceram, cortou a ponta e cortar flores a partir da base da panícula, apenas manter a parte inferior da parte superior do meio proximal meio distal e para aparar mais. </li><li> Se uma panícula tem cerca de 1/4 a 1/2 de flores que floresceram, cortou a parte do meio distal e apenas reter a parte do meio proximal para posterior corte. </li><li> Use uma tesoura cirúrgica para aparar levemente as cerdas. </li><li> Remova todas as flores que floresceram e todas as flores imaturas deixando aproximadamente 20-30 flores / panícula que estão uniformemente distribuídas na região (Figura 3). Praticar o cuidado de manter as cerdas da região que irá ser polinizadas para proteger florzinhas de possíveis danos provocados pelo calor.Para cada espigueta, manter a florzinha mais maduro superior. Maioria floret superior terá uma maior probabilidade de antese no momento da polinização (Figura 2B). </li><li> Marque um lado de cada flor com um marcador permanente vermelho e registrar o número de floretes na panícula (Figura 2B). </li><li> Bandeira da panícula com as seguintes informações: a data de emasculação, a duração e a temperatura à qual a emasculação é realizada. </li><li> Uma vez que a panícula é aparado, remova todos os perfilhos de cada planta para garantir a realocação de mais recursos para o desenvolvimento da panícula principal. </li></ol> 3. Emasculação com água quente-dipping - Dia 1 <ol><li> Definir o banho de água a 48 ° C ± 0,1 ° C durante o tratamento térmico. </li><li> Dobre as panículas aparadas e mergulhá-los em água quente a 48 ° C por 3-6 min. Tenha cuidado para não quebrar o caule da panícula. </li><li> Cerca de 3-4 panículas podem ser mergulhados togeterap de uma só vez, enquanto se mantém um espaço suficiente entre as panículas para distribuição uniforme de calor. É essencial para submergir toda a panícula de água quente durante o tratamento térmico. A folha bandeira (a folha que subtende a panícula que fornece os nutrientes para o panícula) não deve entrar em contato com a água quente para evitar danos causados ​​pelo calor de tecido foliar. </li><li> Uma vez que a castração é realizada durante o período desejado, remover panículas do banho-maria e gentilmente sacudir a água da panícula. </li><li> Coloque um saco de pão microfurada personalizado para cobrir integralmente a panícula castrado e prenda-o com um toque de desempate. Sacos de pão micro-perfurados podem ser personalizados de acordo com o tamanho da panícula (inclua no vídeo). </li><li> Coloque plantas de volta na câmara de crescimento até o dia seguinte. </li></ol> 4. Crossing / polinização após emasculação - Dia 2 e Dia 3 <ol><li> Às 09:00 no dia 2 e dia 3, mova feminino (castrado) e male os pais a partir da câmara de crescimento para o laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para realizar cruzamentos. </li><li> Observe e adicionar outro ponto vermelho para as flores que floresceram ou estão florescendo usando um marcador permanente vermelho. Registre o número total de flores floresceram por panícula. </li><li> Registre a data da polinização e do nome do pai masculino na etiqueta para acompanhar o que as cruzes são executadas. </li><li> Observe o horário de pico da antese em genitores masculinos. Nas nossas condições de câmara (Figura 1) flores nas panículas do progenitor masculino começam abertura síncrona em torno de 10:10. Desde o momento da abertura das flores, a exerção completa de anteras e liberação de pólen ocorrerá após 20 min. </li><li> O palco ideal para a polinização é a fase em que o pólen do progenitor masculino é liberada. As flores vão fechar depois de 20 min de liberação de pólen. Assim, a duração da antese é de cerca de 40 min a partir do momento da abertura de escoamentoers. A cor muda de pólen de branco a castanho-amarelado durante um período de cerca de 30 min depois da flor fecha. </li><li> Comece imediatamente uma vez que a polinização anteras brancas amareladas são visíveis em flores do progenitor masculino. Polinizações são realizadas no dia 2 e dia 3, utilizando uma das três técnicas: <ol><li> Panícula-to-panícula polinização: usando uma panícula destacado como o macho, esfregue suavemente a panícula, juntamente com a panícula castrado para facilitar a polinização e descartar a panícula macho para evitar a contaminação. Repita o processo de polinização, até que cada panícula castrado foi polinizada por 2-3 panículas. </li><li> Antera-se estigma polinização: usando uma pinça pegar uma flor que está florescendo com anteras brancas amareladas ou pegar anteras e fisicamente tocar o estigma da flor sobre o pai do sexo feminino. Use uma flor do progenitor masculino para polinizar uma flor na panícula castrado. Repita a polinização process até que cada um estigma na panícula castrado foi polinizada por alguns (cerca de 2-3) flores / anteras. Vestindo um visor de aumento tornará melhor visibilidade para realizar a polinização. </li><li> Entre as polinizações de diferentes genitores masculinos, mergulhe a pinça em etanol a 95%, seguido por limpeza com Kimwipes para evitar a contaminação devido à transição de pólen entre os diferentes cruzamentos. </li><li> Ligação de panículas: Após emasculação, selecione 3-4 panículas no progenitor masculino que florescem no dia seguinte. Uni-los com a panícula emasculado do pai fêmea utilizando um twist-tie. Posicione o panícula emasculado ligeiramente abaixo da panícula do progenitor masculino. Coloque um saco glassine nos panículas e segura o saco na base com um clipe de papel. Isto pode ser concluído no dia 2 uma vez que as panículas de o progenitor masculino começam a antese. </li><li> Durante o tempo em que floresce na manhã do dia 2 e dia 3, filme ou sacuda o saco glassine para facilpolinização lite. Continue a apertar ou agitar panículas a cada 15 minutos durante todo o período da antese na parte da manhã (entre as 9:00 AM-11: 00 AM). Remover panículas do progenitor masculino após a polinização e rotular o lado oposto das flores floresceu na panícula castrado. Anote o número de flores floresceram na panícula de cada progenitor feminino. </li></ol></li><li> Uma vez que a polinização tem sido realizada, coloque um saco de pão microfurada personalizado para cobrir a panícula do progenitor feminino e seguro na base usando um twist-tie após a polinização até a colheita de sementes. </li></ol> 5. Colheita de Sementes <ol><li> Colheita das sementes após 2 semanas (14-16 dias), desde o dia da polinização. Colocar a etiqueta no mesmo saco de sementes. Sementes que têm marcas vermelhas em ambos os lados representam as sementes que resultaram do cruzamento genético controlado. Estes deverão ser progênie outcross. </li><li> Descarte as sementes sem manchas vermelhas, pois representamas sementes que resultam de flores recém-desenvolvidos depois de emasculação. Sementes com marcas vermelhas apenas de um lado, provavelmente, representam as sementes resultantes da auto-polinização, pois não foram floração na altura em que os cruzamentos controlados foram realizados. </li><li> Sementes secas a 30 ° C durante 2 dias num secador de sementes. Armazenar sementes secas em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) ou em uma câmara de semente (T: 4.0 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%). </li></ol>

<ol>
	<li>Bennetzen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+genome+sequence+of+the+model+plant+Setaria.">Reference genome sequence of the model plant Setaria.</a> Nat Biotechnol. 30, 555-561 (2012).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+foxtail+millet+(Setaria+italica)+provides+insights+into+grass+evolution+and+biofuel+potential.">Genome sequence of foxtail millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and biofuel potential.</a> Nat Biotechnol. 30, 549-554 (2012).</li><li>Li, P., Brutnell, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setaria+viridis+and+Setaria+italica,+model+genetic+systems+for+the+Panicoid+grasses.">Setaria viridis and Setaria italica, model genetic systems for the Panicoid grasses.</a> J Exp Bot. 62, 3031-3037 (2011).</li><li>Brutnell, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setaria+viridis:+a+model+for+C4+photosynthesis.">Setaria viridis: a model for C4 photosynthesis.</a> Plant Cell. 22, 2537-2544 (2010).</li><li>Doust, A. N., Kellogg, E. A., Devos, K. M., Bennetzen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxtail+millet:+a+sequence-driven+grass+model+system.">Foxtail millet: a sequence-driven grass model system.</a> Plant Physiol. 149, 137-141 (2009).</li><li>Siles, M. M., Baltensperger, D. D., Nelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+for+artificial+hybridization+of+foxtail+millet+[Setaria+italica+(L.)+Beauv.].">Technique for artificial hybridization of foxtail millet [Setaria italica (L.) Beauv.].</a> Crop Sci. 41, 1408-1412 (2001).</li><li>Li, H. W., Meng, C. J., Liu, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Problems+in+the+Breeding+of+Millet+(Setaria+Italica+(L.)+Beauv.).">Problems in the Breeding of Millet (Setaria Italica (L.) Beauv.).</a> Agron. J. 27, 963-970 (1935).</li><li>Willweber-Kishimoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecific+relationships+in+the+genus+setaria.">Interspecific relationships in the genus setaria.</a> Contributions from the Biological Laboratory, Kyoto University. 14, 1-41 (1962).</li><li>Chang, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+flowering+and+hybridization+technique+in+Setaria.">Studies on flowering and hybridization technique in Setaria.</a> Nungyeh-hsueh Pao (Jour. Agric.) Act. Agric. Sin. 9, 68-76 (1958).</li><li>Darmency, H., Pernes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+wild+Setaria+viridis+(L.)+Beauv.+to+improve+triazine+resistance+in+cultivated+S.+italica+(L.)+by+hybridization.">Use of wild Setaria viridis (L.) Beauv. to improve triazine resistance in cultivated S. italica (L.) by hybridization.</a> Weed Research. 25, 175-179 (1985).</li><li>Sakai, S., Shin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+hybridization+of+Setaria+italica+by+hot+water+treatment.">Artificial hybridization of Setaria italica by hot water treatment.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 28-37 (1955).</li><li>Malm, N. R., Rachie, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Setaria millets: A review of the world literature S.B. , 513-529 (1971).</li><li>Miyaji, Y., Samura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+atmospheric+humidity+on+flowering+and+pollination+in+Setaria+italica.">The influence of atmospheric humidity on flowering and pollination in Setaria italica.</a> Bull. Fac. Agric. Kagoshima Univ. , 1-6 (1954).</li><li>Wang, Z. M., Devos, K. M., Liu, C. J., Wang, R. Q., Gale, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+RFLP-based+maps+of+foxtail+millet,+Setaria+italica+(L.).">Construction of RFLP-based maps of foxtail millet, Setaria italica (L.).</a> P. Beauv. Theoret. Appl. Genetics. 96, 31-36 (1998).</li><li>RangaswamiAyyangar, G. N., Narayanan, T. R., Seshadri Sarma, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+Setaria+italica+(Beauv.),+the+Italian+millet.+Part+I.">Studies in Setaria italica (Beauv.), the Italian millet. Part I.</a> Indian J. Agr. Sci. , 561-571 (1933).</li><li>Heh, C. M., Mei, T. F., Yang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anthesis+of+Millet,+Setaria+Italica+(L.)+Beauv.">Anthesis of Millet, Setaria Italica (L.) Beauv.</a> Agron. J. 29, 845-853 (1937).</li><li>Doust, A. N., Devos, K. M., Gadberry, M. D., Gale, M. D., Kellogg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+basis+for+inflorescence+variation+between+foxtail+and+green+millet+(poaceae).">The genetic basis for inflorescence variation between foxtail and green millet (poaceae).</a> Genetics. 169, 1659-1672 (2005).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Importância do tratamento antes do amanhecer Para obter uma alta freqüência de progênie outcross é essencial ter antese altamente síncrona de pais masculinos e femininos. Inicialmente, pedalamos regimes de temperatura e luz (31 ° C/22 ° C, dia / noite) e usou o S. viridis A10.1 adesão para todas as polinizações. Sob essas condições, a maioria das flores abrem de manhã cedo antes que a temperatura sobe para 31 ° C, embora algumas flores abertas aleatoriamente entre 8h00-8: 00 PM. Estudos anteriores em S. italica indicam que hora do dia, local e época contribuir para a variação em antese 7,15,16. Siles et al. 6 observou que a antese foi associada com variações bruscas de temperatura e umidade, mas não com baixa temperatura e alta umidade, por si só, como concluiu em estudos anteriores 7,15. Por isso, nós empregamos um pré-tratamento do amanhecer frio de 15 ° C por 30 min (das 8:30 AM-9: 00 AM) para imitara condição de pré-amanhecer natural. Este tratamento frio da madrugada auxiliado na sincronização antese nos pais. Observou-se que, apesar de a câmara de ajuste para níveis de humidade relativa de 50%, a humidade relativa no interior da câmara aumentou para um nível superior a 70% quando a temperatura caiu de 22 ° C a 15 ° C e continuou a manter acima de 70% até a temperatura gradualmente subiu para 31 ° C depois de 9:30. Às 9:00 AM, emasculado genitores femininos e plantas do progenitor masculino são levados para o laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%). As flores dos genitores masculinos começar a abrir em torno de 10:10, ea polinização pode ser realizada às 10:30 AM-11: 00 PM. Uma lista detalhada de todos os reagentes e equipamento é fornecido na Tabela 2. Importância da preparação panícula para emasculação Sob as condições da câmara neste estudo (Figura 1), o tempo de floração panícula primário variou de2-3 dias. Tipicamente, flores localizados no meio distal da inflorescência (Figura 2A) aberto primeira abertura e precede proximal e distal. O número ideal de flores a serem retidos na panícula é 20-30. O cuidado deve ser tomado durante a remoção de flores imaturas para que apenas flores bem desenvolvidos (a flor superior ou maiores na espigueta 17) são mantidas. A marcação com marca vermelha em ambos os lados das flores ajuda a distinguir eficientemente progenitura outcross putativo a partir de sementes de flores recentemente desenvolvidos após a castração. Além disso, é importante para deixar as cerdas sobre as panículas antes emasculação para proteger as florzinhas de danos extensos de calor, no entanto, como uma opção, que pode ser removido após a emasculação usando tesouras de mola, a fim de facilitar a polinização, especialmente quando a ligação de um panícula técnica é utilizada (Figuras 2C e 2D). Optimizado uma temperaturaduração do tratamento d para tratamento de água quente A base para a castração através de imersão de água quente é que o pólen é mais sensível ao calor do que a superfície estigmática. No entanto, a duração ea temperatura de tratamento térmico pode variar entre as espécies Setaria e adesões. Em geral, uma temperatura mais elevada, com um tempo de tratamento mais curto, ou uma temperatura mais baixa, com um tempo de tratamento mais prolongado terá o mesmo efeito sobre a emasculação. Tem sido relatado que um tratamento térmico de 42 ° C durante 20 min ou 10 a 47 ° C durante 10 min 14 rendeu S. italica pólen não viáveis, mas a eficácia destes tratamentos não foi determinada. Nós desenvolvemos o nosso protocolo seguindo a hipótese de que, sob uma temperatura otimizada e duração do tratamento, o pólen de todas as flores retida no progenitor feminino será inviável enquanto estigmas permanecerá receptivo. No entanto, depois de comparar e analisar os efeitos de diferentes temperaturas eperíodos de tratamento (Tabela 1), observou-se que a sensibilidade ao tratamento pelo calor varia entre as flores retidos em cada panícula, portanto, é difícil de eliminar completamente as sementes resultantes da auto-polinização. Conclui-se que a eficiência de produção de descendência cruzamento aberto é a maior quando os tratamentos são efectuados a 48 ° C durante 3-6 min em S. viridis A10.1 adesão. Horário de pico de antese e polinização cruzada Quando as flores atingem a maturidade e está prestes a abrir, as anteras são de cor branca amarelada na cor e pólen é derramado assim que as anteras das flores exsert 8. Anteras gradualmente virar marrom após pólen é derramado como as flores começam a fechar. Uma vez liberado, a viabilidade do pólen é desconhecida. Assim, é crítica a utilização do pólen de abertura ou as flores recém abertas com o progenitor masculino o mais rapidamente possível. Nas nossas condições de câmara (Figura 1), a maioria das flors dos genitores masculinos começam a abrir às 10:10 e as flores abertas lançar pólen às 10:30. Assim, a janela desejável para a realização de polinização é 10:30-11:00. Os estigmas permanecem fora das glumas após flores perto e pode ser receptivo ao pólen. Isto tem sido observado anteriormente e confirmada em S. italica que os estigmas são receptivos por cerca de 48 horas de abertura pós-flor por Siles et al. 6, por isso é importante saco panículas após tratamento térmico e após a realização de cruzamentos controlados. Como discutido acima, recomendamos polinizações desempenho em ambos os dia 2 e dia 3 pós-castração. Métodos para a polinização Comparou-se a eficiência de três técnicas de polinização. Se flores desabrochando não se limitando, a polinização panícula-to-panícula é a técnica mais eficiente e irá produzir um maior número de descendentes outcross. Se panículas florescendo estão limitando, uma maior frequência de outcross progénie será produzida quando o método de antera a-estigma é usado. Obtivemos progênie outcross de ambos os métodos de sucesso. O método &quot;panículas ligação&quot; tem sido utilizado na travessia S. italica 6, mas nós achamos que este método seja o método menos eficiente quanto a janela de tempo para o derramamento de pólen do progenitor masculino é curto. Além disso, há menos controlo sobre a polinização e as cerdas em S. panículas viridis também pode dificultar o movimento do pólen na superfície estigmática. Colheita da semente, a secagem e armazenamento Após a colheita, as sementes devem ser secos a 30-33 ° C durante 2 dias. Anthecium deve ser removido para a coloração de GUS, se necessário. As sementes devem ser armazenados em local fresco e seco (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%) para o armazenamento de curto prazo (menos de dois anos) ou em uma câmara de semente (T: 4.0- 10 ° C ± 1,0 ° C, RH: 20% ± 1%) para o armazenamento a longo prazo.Más condições de armazenamento pode resultar em taxas de viabilidade baixos 8. Temos observado que a taxa de germinação de sementes de S. viridis A10.1 é de aproximadamente 5% quando semeadas quatro dias após a colheita, mas pode ser aumentado para 90-96% depois da armazenagem em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, HR: 21,79% ± 1,15%) para 110 dias pós-colheita seguido por uma estratificação de três dias a -80 ° C para quebrar a dormência das sementes. Para a estratificação a -80 ° C, sementes secas pode ser colocado em um recipiente hermeticamente fechado (por exemplo, tubo de micro-centrifugação ou envelope moeda num saco de plástico selado) e mantida a -80 ° C durante 3 dias antes do plantio. Após 16 meses de armazenamento em laboratório (T: 24,06 ° C ± 0,13 ° C, RH: 21,79% ± 1,15%), os percentuais de germinação de 90-95% ainda pode ser obtida. Além disso, para quebrar a dormência, as sementes podem ser secos a 30-33 ° C durante 2 dias após a colheita, e, em seguida, dada de três dias a estratificação a -80 ° C seguido pela remoção deanthecium antes de plantar. Após estes tratamentos, as taxas de germinação da semente até 33% pode ser conseguido. Vantagens, limitações e possíveis modificações Aqui nós fornecemos o primeiro protocolo padrão para a realização de cruzamentos em S. viridis A10.1 usando um tratamento térmico para emasculação. Em contraste com a castração física, este protocolo é menos invasivo e relativamente fácil de estabelecer em um laboratório. Geralmente, leva cerca de 15 minutos para cortar uma panícula e cerca de 15 panículas podem ser aparadas e cruzou / pessoa / dia. Assumindo uma média de 3-5 outcross progênie / panícula pode ser recuperado em condições otimizadas, um total de 45-75 progênie outcross pode ser produzido por uma pessoa em um único dia. Além disso, esta técnica pode ser aplicada a atravessa, em outras espécies de Setaria, embora optimizações adicionais serão susceptíveis. Se o espaço em câmara de crescimento é limitado, as plantas podem ser cultivadas em casa de vegetação ou câmaras de crescimento, sem um tesouro pré-amanhecertamento até a panícula emerge antes de serem transferidas para as condições da câmara otimizados.

S. viridis é uma NADP-ME subtipo C 4 grama intimamente relacionado com o estoque switchgrass alimentação bioenergia (NAD-ME subtipo), o foxtail milho safra de grãos, ea erva daninha agrícola guiné grama 5. O genoma 510 Mb de forma cultivada de Setaria, S. italica, foi recentemente seqüenciado 1,2 e uma seqüência do genoma 25x cobertura da relação de convivência, S. viridis, está em andamento (não publicado). S. viridis tem uma série de características que o tornam um potencial excelente sistema genético modelo incluindo um tempo de geração rápido, pequena estatura, os requisitos de crescimento simples e prolífica produção de sementes 3. Importante, métodos têm sido recentemente desenvolvidos para a transformação tanto transiente e estável de S. viridis, que oferecem a oportunidade para a criação de plantas transgênicas 4. No entanto, o principal entrave para o desenvolvimento de ferramentas genéticas para S. viridis é sua recalcitrance para cruzamento. Até à data, nenhum protocolo padrão foi publicado que irá permitir a rápida produção de sementes a partir de cruzamentos controlados. Cruzamentos genéticos em S. italica são normalmente realizados por emasculação através da remoção das anteras das flores 6,7,8 ou através de tratamento térmico de flores de genitores femininos 9-11. Após esses tratamentos, anteras ou panículas de flores não tratados / pais masculinos são suavemente desgastada contra estigmas liberando pólen. Em emasculação, anteras são removidos usando uma pinça fina imediatamente após a florzinha abre eo anteras está começando a exsert, mas ainda não tem a vertente pólen 6-8. Entre os desafios deste último método é a dificuldade em realizar emasculação em um intervalo de tempo entre a abertura estreita e polinização da flor. A duração de abertura e de fecho de uma única flor irá variar dependendo da adesão e as condições ambientais e podem variar de 7 min &lt;sup&gt; 6-2,5 h 12 em S. italica. Uma vez que o derramamento de pólen ocorre como anteras exsert do flósculo, anteras precisam de ser removidos cuidadosamente e rapidamente, e por conseguinte, é difícil evitar a contaminação devido a auto-polinização. Além disso, como a polinização são realizadas imediatamente após a castração, o número de cruzamentos que podem ser exercidas por pessoa / dia é limitado. Como um método alternativo, panículas maduras podem ser mergulhados em água quente para aquecer-matar desenvolvimento grãos de pólen 9,10,13,14, com a vantagem de realizar cruzamentos em um grande número de panículas. No entanto, a temperatura e duração do tratamento térmico varia largamente a partir de experiências diferentes (por exemplo, 47 ° C durante 10 minutos 14 e 42 ° C durante 20 min) 10. Além disso, há análises sistemáticas sobre a eficácia do emasculations mediada pelo calor foram publicados. Assim, um padrão e método simples para a realização de cruzamentos genéticos no S. viridis aceleraria muito o desenvolvimento de recursos genéticos e de estabelecimento de S. viridis como um sistema modelo no seio da comunidade de pesquisa. Relata-se o desenvolvimento e otimização de um protocolo padrão para a realização de cruzamentos genéticos em S. viridis. As plantas são cultivadas em ambientes controlados para sincronizar o desenvolvimento da flor e aumentar a reprodutibilidade do processo. Cruzes são realizadas utilizando um S. transgénico A linha viridis como o progenitor masculino que contém o gene repórter GUS 4 para facilitar a identificação de cruzamentos genéticos controlados sucesso. O transgene GUS é accionado por um promotor de ubiquitina de arroz, que permite a contagem de sementes F1 imediatamente após a colheita e, assim, proporciona um ensaio qualitativo fácil de determinar a eficiência de emasculação e polinização. Nós empregamos um tratamento térmico simples, com água morna para emasculação acompanhada de rotulagem de flores que foram emasculated para eliminar as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidos após a emasculação. Depois de testar uma série de tratamentos térmicos a temperaturas permissivas, e variando o tempo de imersão em água quente, nós estabelecemos a uma temperatura e tempo ideais durações de 48 ° C, 3-6 min. Um tratamento a frio madrugada foi encontrado para promover a antese síncrono em ambos os progenitores, de modo a facilitar a polinização cruzada. Também discutimos os principais passos no protocolo ea futura aplicação deste método a outras adesões Setaria.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Cat. Number</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Scissors, spring</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc</td>
			<td>14126</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps, Dumostar Biology Polished</td>
			<td>SPI Supplies</td>
			<td>TD5BP-XD</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T (Fine Science Tools)</td>
			<td>14005-12</td>
		<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Europack Clear Polypropylene Micro-Perforated Crusty Bread Bags 6"x28"</td>
			<td><a href="http://www.pjpmarketplace.com" target="_blank">http://www.pjpmarketplace.com</a></td>
			<td>361001</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flats</td>
			<td>T.O. Plastics</td>
			<td>715401C </td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>metro mix 360</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>10-0356-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Jack's 15-16-17</td>
			<td>Hommert International</td>
			<td>07-5925-1</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie Ultra Fine Point Permanent Markers, Red</td>
			<td>Staples</td>
			<td>37002</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donegan DA-10 OptiVisor Headband Magnifier, 3.5x Magnification, 4" Focal Length</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>DA-10, B0015IP380</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12"24/7 Packaging Hand Impulse Sealer Heat Seal Machine Poly Sealing Free Element Grip </td>
			<td>Amazon</td>
			<td>N/A</td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>water bath</td>
			<td>VWR scientific</td>
			<td>Model: 1166</td>
			<td></td>	
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BDW walk in plant growth chamber</td>
			<td>Conviron</td>
			<td>BDW 40</td>
 <td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

methods for performing crosses in setaria viridis, a new model system for the grasses

Setaria viridis é um sistema modelo emergente para C 4 gramíneas. Ela está intimamente relacionada com o estoque switchgrass alimentação bioenergia ea foxtail milho safra de grãos. Recentemente, o genoma 510 Mb de painço foxtail, S. Itálica, foi seqüenciado 1,2 e uma seqüência do genoma 25x cobertura da convivência em relação S. viridis está em andamento. S. viridis tem uma série de características que o tornam um potencial excelente sistema genético modelo incluindo um tempo de geração rápido, pequena estatura, os requisitos de crescimento simples, prolífica produção de sementes 3 ​​e sistemas desenvolvidos para a transformação tanto transitória e estável 4. Contudo, a genética de S. viridis é em grande parte inexplorado, em parte, devido à falta de métodos detalhados para a realização de cruzamentos. Até o momento, nenhum protocolo padrão foi adotado, que permitirá a rápida produção de sementes a partir de cruzamentos controlados. As pressões de protocolotura orientada aqui é otimizado para a realização de cruzamentos genéticos em S. viridis, A10.1 adesão. Nós empregamos um tratamento térmico simples, com água morna para castração após a poda da panícula de reter 20-30 florzinhas e rotulagem de flores para eliminar as sementes resultantes de flores recém-desenvolvidos após a emasculação. Depois de testar uma série de tratamentos térmicos a temperaturas permissivas, e variando o tempo de imersão, nós estabelecemos a uma temperatura óptima e intervalo de tempo de 48 ° C durante 3-6 min. Ao utilizar este método, um mínimo de 15 cruzamentos pode ser realizada por um único operador por dia e uma média de 3-5 descendência por cruzamento aberto panícula pode ser recuperado. Portanto, uma média de 45-75 progenitura cruzamento aberto pode ser produzido por uma pessoa num dia. Implementação Broad desta técnica vai facilitar o desenvolvimento de populações de linhas puras recombinantes de S. viridis X S. viridis ou S. viridis X S. italica, mapeando as mutações através de massa seanálise gregant e criar mutantes de ordem superior para a análise genética.

Neste estudo, foi utilizado o S. seqüenciado viridis A10.1 adesão como o pai do sexo feminino, e um S. transgênico linha viridis (também A10.1) contendo o gene repórter GUS 4 como o progenitor masculino para todas as polinizações. Um regime de crescimento optimizado foi utilizado para sincronizar a floração como mostrado na Figura 1. Nós testamos várias combinações de temperatura e tempo de tratamento térmico para a emasculação e observou que cerca de 40-80% das flores retidos na panícula emasculado floresceu no 2 º dia, enquanto o restante floresceu no 3 º dia (Figura 2). No entanto, se o tratamento térmico foi muito grave, por exemplo, 49 ° C por 4 min, muito poucas ou nenhumas flores floresceu no 2 º dia. A polinização cruzada foi realizada no 2 º ou 3 º dia após a emasculação, que era dependente do horário de pico da antese de pais masculinos. Foi observáveled que os jovens flores continuou a se desenvolver após a emasculação, amadurecido e auto-polinizadas polinizações 3-6 dias depois de controladas. Depois de 7-10 dias pós-polinização, as flores que são de cor branca são visíveis na panícula. Estas flores brancas são não fertilizados, quer devido a danos causados ​​pelo calor ou pobre polinização. Ao mesmo tempo, as flores que foram polinizadas com sucesso começam a dar sementes escuras e comece a quebra depois de 14 dias. As sementes escuras com marcas vermelhas colhidas no 14 º dia após a polinização pode ser claramente distinguida das sementes sem manchas vermelhas que ainda estavam verdes e não quebrar. Se a colheita é retardada, o anthecium das sementes com e sem marcas vermelhas tanto ficar escuro, o que torna difícil distinguir rapidamente as sementes com marcas vermelhas em piscinas colhidas. Para optimizar o protocolo de passagem de várias experiências de tratamento térmico foram efectuados tal como resumido na Tabela 1. Uma média de0-10 sementes / panícula foram recuperados a partir de vários experimentos de tratamento térmico. Após a colheita, as sementes foram secas a 30 ° C durante 2 dias num secador de sementes, seguido pela remoção do anthecium usando um removedor anthecium. Após a anthecium foi removido, as sementes F1 putativos foram corados com solução de coloração GUS, e progênie outcross manchado cor azul em 1-2 horas (Figura 2F). Com base nesses resultados, recomendamos um tratamento térmico de 48 ° C por 3-6 min. Além disso, recomendamos que cruzes ser realizada em ambos os dias 2 e dia 3 seguinte emasculação. Para examinar a eficácia desta técnica na realização de cruzamentos com outras adesões Setaria ou espécies, cruzamentos entre S. viridis A10.1 e oito diversificada S. adesões viridis e um S. adesão pumila foram realizados. Apesar de dias para o florescimento variou entre os acessos, descobrimos que as flores de todos os oito S. adesões viridis e um S.adesão pumila começam abertura entre 10:00-11:00 com um tempo de abertura pico em 10:20-11:00 após o tratamento pelo frio da madrugada. Isto indica que o tratamento a frio da madrugada pode ser aplicada a diversas adesões Setaria. Um tratamento térmico de 48 ° C durante 5-6 min foi usado para castrar S. viridis A10.1, que foi utilizada como o progenitor feminino, para todos os cruzamentos realizados. Recuperamos de um a 12 sementes de cruzamentos entre A10.1 e três do diverso S. adesões viridis e seis sementes de um único cruzamento entre S. viridis A10.1 e uma única S. adesão pumila. No entanto, neste momento, não ter determinado se estes semente resultou de uma testcross sucesso ou foram o resultado de auto-contaminação. Independentemente disso, estes resultados preliminares sugerem que as condições de crescimento usadas para S. viridis A10.1 pode ser usado para gerar cruzamentos com diversas S. adesões viridis e, possivelmente, outras espécies de Setaria. <table border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Temp tratamento térmico (° C) </td><td> Tempo de tratamento térmico (min) </td><td> # cruzes </td><td> Médio. # De flores depois da guarnição </td><td> Dia da polinização (dia depois emasc) </td><td> Médio. # sementes (vermelho) / panícula (média) </td><td> Médio. Gus% (+) / sementes (vermelho) </td><td> Médio. Sementes # hyb (Gus +) </td><td> Min. # Hyb sementes </td><td> Max # hyb sementes </td></tr><tr><td> 47 </td><td> 10 </td><td> 2 </td><td> 27 </td><td> 2 º dia </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 48 </td><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 36 </td><td> 2 º dia </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> 4</td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> 3 º dia </td><td> 10 </td><td> 50 </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 7 </td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2 º dia </td><td> 5 </td><td> 60 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> 3 </td><td> 25 </td><td> 2 º dia </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 4 </td><td> 24 </td><td> 2 º dia </td><td> 3 </td><td> 33 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 1 </td><td> 25 </td><td> 3 º dia </td><td> 4 </td><td> 75 </td><td> 3 </td><td> N / D </td><td> N /A </td></tr><tr><td> 49 </td><td> 1 </td><td> 3 </td><td> 23 </td><td> 2 º dia </td><td> 5 </td><td> 25 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 7 </td><td> 26 </td><td> 2 º dia </td><td> 8 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 5 </td><td> 22 </td><td> 2 º dia </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 25 </td><td> 2 º dia </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Optimização do tratamento térmico para a emasculação. Resulta da alteração da temperatura e tempo de tratamento térmico. Polinizações foram realizadas um (2 º dia) ou dois dias (3 º dia) após a emasculação e cruzamentos bem sucedidos sendocarpo com coloração GUS <img alt="Figura 1" fo:content-src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1highres.jpg" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig1.jpg" /> Figura 1. São mostrados otimizados condições da câmara de crescimento com um pré-tratamento madrugada fria. Temperatura e períodos de tempo para o crescimento ideal e sincronia de produção de flores. Setas verdes e vermelhas mostram a janela ideal para a realização de cruzamentos e emasculação, respectivamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de panículas por cruzamento e GUS coloração de progênie outcross. (A) A panícula de Setaria viridis A10.1 antes de cortar, mostrando aproximadamente 1/10 de flores abertas. As quatro seções e direcionalidade na progressão da antese ao longo da panícula é mostrado. <strongPanícula&gt; (B) A aparadas antes de emasculação com cerdas retidos. (C) Uma panícula castrado após a remoção dos pêlos. (D) Uma panícula castrado no dia 2 pós-castração, mostrando as flores que estão florescendo (foto tirada às 10:30 AM). (E) A panícula do progenitor masculino (transgênico Setaria viridis linha A10.1 carregando uma β-glucuronidase (GUS) gene repórter) que está florescendo após o tratamento antes do amanhecer (foto tirada às 10:30 AM). A a E, barra de escala = 1 mm. (F) progenitura outcross putativos após coloração GUS, durante 2 horas, seguido por distaining em 70% (v / v) de etanol. As duas sementes do direito são controles negativos e positivos, respectivamente. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50527/50527fig3.jpg" /> Figura 3. Gráfico do protocolo de Fluxo Uma representação esquemática do mRINCIPAIS etapas envolvidas na realização S. viridis atravessa.

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses at JoVE.com

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Nós desenvolvemos uma metodologia para a realização de cruzes em Setaria viridis (S. viridis). O método envolve a poda da panícula antes de um tratamento com água quente para matar pólen viável. Cruzes são executadas seguindo um regime de crescimento bem controlada e tipicamente resulta na recuperação de 1 a 7, a polinização cruzada de sementes / s por panícula.

Métodos para a realização Cruzes em<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

Setaria viridis is an emerging model system for C4 grasses. It is closely related to the bioenergy feed stock switchgrass and the grain crop foxtail ...

methods-for-performing-crosses-setaria-viridis-new-model-system-for

Research

JoVE Journal

Environment

Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

21.5K visualizações.  Donald Danforth Plant Science Center.  Nós desenvolvemos uma metodologia para a realização de cruzes em Setaria viridis (S. viridis). O método envolve a poda da panícula antes de um tratamento com água quente para matar pólen viável. Cruzes são executadas seguindo um regime de crescimento bem controlada e tipicamente resulta na recuperação de 1 a 7, a polinização cruzada de sementes / s por panícula. 

Vídeo: Methods for Performing Crosses in Setaria viridis, a New Model System for the Grasses

Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues comprising the Caribbean reef building corals Montastraeaannularis and M. faveolata. These approaches include fluorescence microscopy (FM), serial block face imaging (SBFI), and two-photon confocal laser scanning microscopy (TPLSM). SBFI provides deep tissue imaging after physical sectioning; it details the tissue surface texture and 3D visualization to tissue depths of more than 2 mm. Complementary FM and TPLSM yield ultra-high resolution images of tissue cellular structure. Results have: (1) identified previously unreported lobate tissue morphologies on the outer wall of individual coral polyps&#160;and (2) created the first surface maps of the 3D distribution and tissue density of chromatophores and algae-like dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption peaks of 500 nm and 675 nm, respectively, suggest that M. annularis and M. faveolata contain similar types of chlorophyll and chromatophores. However, M. annularis and M. faveolata exhibit significant differences in the tissue density and 3D distribution of these key cellular components. This study focusing on imaging methods indicates that SBFI is extremely useful for analysis of large mm-scale samples of decalcified coral tissues. Complimentary FM and TPLSM reveal subtle submillimeter&#160;scale changes in cellular distribution and density in nondecalcified coral tissue samples. The TPLSM technique affords: (1) minimally invasive sample preparation,&#160;(2) superior optical sectioning ability,&#160;and (3) minimal light absorption and scattering, while still permitting deep tissue imaging.

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine polyp morphology and tissue structure in the Caribbean corals Montastraeaannularis and M. faveolata. Fluorescence, serial block face,&#160;and two-photon confocal laser scanning microscopy have identified lobate structure, polyp walls, and estimated chromatophore and zooxanthellae densities and distributions.

Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais

An integrated suite of imaging techniques has been applied to determine the three-dimensional (3D) morphology and cellular structure of polyp tissues ...

Ambiente

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of electrical transmission between distant cells in an organism requires in vivo, artifact-free recordings of cells embedded within their native environment. The transmission of electrical signals from wounded to unwounded areas in a plant has since long piqued the interest of botanists. The phloem, the living part of the plant vasculature that is spread throughout the plant, has been postulated as a major tissue in electrical transmission in plants. The lack of suitable electrophysiological methods poses many challenges for the study of the electrical properties of the phloem cells in vivo. Here we present a novel approach for intracellular electrophysiology of sieve elements (SEs) that uses living aphids, or other phloem-feeding hemipteran insects, integrated in the electrical penetration graph (EPG) circuit. The versatility, robustness, and accuracy of this method made it possible to record and study in detail the wound-induced electrical signals in SEs of central veins of the model plant Arabidopsis thaliana1. Here we show that EPG-electrodes can be easily implemented for intracellular electrophysiological recordings of SEs in marginal veins, as well as to study the capacity of SEs to respond with electrical signals to several external stimuli. The EPG approach applied to intracellular electrophysiology of SEs can be implemented to a wide variety of plant species, in a large number of plant/insect combinations, and for many research aims.

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

Um novo aplicativo do Electrical Penetration Graph (EPG) para aquisição e medição de sinais elétricos em Floema Sieve Elements

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

Methods of Soil Resampling to Monitor Changes in the Chemical Concentrations of Forest Soils

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental changes. Repeated sampling to monitor these changes in forest soils is a relatively new practice that is not well documented in the literature and has only recently been broadly embraced by the scientific community. The objective of this protocol is therefore to synthesize the latest information on methods of soil resampling in a format that can be used to design and implement a soil monitoring program. Successful monitoring of forest soils requires that a study unit be defined within an area of forested land that can be characterized with replicate sampling locations. A resampling interval of 5 years is recommended, but if monitoring is done to evaluate a specific environmental driver, the rate of change expected in that driver should be taken into consideration. Here, we show that the sampling of the profile can be done by horizon where boundaries can be clearly identified and horizons are sufficiently thick to remove soil without contamination from horizons above or below. Otherwise, sampling can be done by depth interval. Archiving of sample for future reanalysis is a key step in avoiding analytical bias and providing the opportunity for additional analyses as new questions arise.

Repeated soil sampling has recently been shown to be an effective way to monitor forest soil change over years and decades. To support its use, a protocol is presented that synthesizes the latest information on soil resampling methods to aid in the design and implementation of successful soil monitoring programs.

Métodos de Reamostragem do solo para monitorar as mudanças nas concentrações químicas de Solos Florestais

Recent soils research has shown that important chemical soil characteristics can change in less than a decade, often the result of broad environmental ...

Measuring and Mapping Patterns of Soil Erosion and Deposition Related to Soil Carbonate Concentrations Under Agricultural Management

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonate (CaCO3) profiles. The objective is to describe a simple conceptual model and detailed protocol for repeatable field and laboratory measurements of these quantities. Here, accurate elevation is measured using a ground-based differential global positioning system (GPS); other data acquisition methods could be applied to the same basic method. Soil samples are collected from prescribed depth intervals and analyzed in the lab using an efficient and precise modified pressure-calcimeter method for quantitative analysis of inorganic carbon concentration. Standard statistical methods are applied to point data, and representative results show significant correlations between changes in soil surface layer CaCO3 and changes in elevation consistent with the conceptual model; CaCO3 generally decreased in depositional areas and increased in erosional areas. Maps are derived from point measurements of elevation and soil CaCO3 to aid analyses. A map of erosional and depositional patterns at the study site, a rain-fed winter wheat field cropped in alternating wheat-fallow strips, shows the interacting effects of water and wind erosion affected by management and topography. Alternative sampling methods and depth intervals are discussed and recommended for future work relating soil erosion and deposition to soil CaCO3.

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes in elevation are related to changes in near-surface soil carbonates. Repeatable methods for field and laboratory measurements of these quantities and data analysis methods are described here.

Medição e mapeamento de padrões de erosão e deposição relacionadas às concentrações de carbonato de solo sob gestão agrícola

Spatial patterns of soil erosion and deposition can be inferred from differences in ground elevation mapped at appropriate time increments. Such changes ...

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and rates of mortality in populations, which has a variety of applications in ecology, including agricultural ecosystems. Horizontal, or cohort-based, life tables provide for the most direct and accurate method of quantifying vital population rates because they follow a group of individuals in a population from birth to death. Here, protocols are presented for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field that takes advantage of the sessile nature of the immature life stages of a global insect pest, Bemisia tabaci. Individual insects are located on the underside of cotton leaves and are marked by drawing a small circle around the insect with a non-toxic pen. This insect can then be observed repeatedly over time with the aid of hand lenses to measure development from one stage to the next and to identify stage-specific causes of death associated with natural and introduced mortality forces. Analyses explain how to correctly measure multiple mortality forces that act contemporaneously within each stage and how to use such data to provide meaningful population dynamic metrics. The method does not directly account for adult survival and reproduction, which limits inference to dynamics of immature stages. An example is presented that focused on measuring the impact of bottom-up (plant quality) and top-down (natural enemies) effects on the mortality dynamics of B. tabaci in the cotton system.

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables allow quantification of the sources and rates of mortality in insect populations and contribute to understanding, predicting and manipulating population dynamics in agroecosystems. Methods for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field for an insect with sessile immature life stages are presented.

Metodologia para desenvolvimento de tabelas de vida para insetos sésseis no campo utilizando a mosca branca, Bemisia tabaci, em algodão como um modelo de sistema

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye anatomy of insects. These include traditional histological techniques optimized for work on ant eyes and adapted to work in concert with other techniques such as transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). These techniques, although vastly useful, can be difficult for the novice microscopist, so great emphasis has been placed in this article on troubleshooting and optimization for different specimens. We provide information on imaging techniques for the entire specimen (photo-microscopy and SEM) and discuss their advantages and disadvantages. We highlight the technique used in determining lens diameters for the entire eye and discuss new techniques for improvement. Lastly, we discuss techniques involved in preparing samples for LM and TEM, sectioning, staining, and imaging these samples. We discuss the hurdles that one might come across when preparing samples and how best to navigate around them.

This article outlines a suite of techniques in light and electron microscopy to study the internal and external eye anatomy of insects. These include several traditional techniques optimized for work on ant eyes, detailed troubleshooting, and suggestions for optimization for different specimens and regions of interest.

Técnicas para investigar a anatomia do sistema Visual de formiga

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Development of New Methods for Quantifying Fish Density Using Underwater Stereo-video Tools

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and estimating fish abundance. We developed and implemented a rotating stereo-video camera tool that covers a full 360 degrees of sampling, which maximizes sampling effort compared to stationary camera tools. A variety of studies have detailed the ability of static, stereo-camera systems to obtain highly accurate and precise measurements of fish; the focus here was on the development of methodological approaches to quantify fish density using rotating camera systems. The first approach was to develop a modification of the metric MaxN, which typically is a conservative count of the minimum number of fish observed on a given camera survey. We redefine MaxN to be the maximum number of fish observed in any given rotation of the camera system. When precautions are taken to avoid double counting, this method for MaxN may more accurately reflect true abundance than that obtained from a fixed camera. Secondly, because stereo-video allows fish to be mapped in three-dimensional space, precise estimates of the distance-from-camera can be obtained for each fish. By using the 95% percentile of the observed distance from camera to establish species-specific areas surveyed, we account for differences in detectability among species while avoiding diluting density estimates by using the maximum distance a species was observed. Accounting for this range of detectability is critical to accurately estimate fish abundances. This methodology will facilitate the integration of rotating stereo-video tools in both applied science and management contexts.

We describe a new method for counting fishes, and estimating relative abundance (MaxN) and fish density using rotating stereo-video camera systems. We also demonstrate how to use distance from camera (Z distance) to estimate species-specific detectability.

Desenvolvimento de novos métodos para quantificar a densidade de peixes usando ferramentas de estéreo-vídeo subaquáticas

The use of video camera systems in ecological studies of fish continues to gain traction as a viable, non-extractive method of measuring fish lengths and ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, lower vapor pressure, non-flammability, higher heat capacity, and tunable solubility and acidity. Here, we demonstrate a method for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from the pentosan present in jute biomass in a one-pot process by utilizing a catalytic amount of Br&#248;nsted acidic 1-methyl-3-(3-sulfopropyl)-imidazolium hydrogen sulfate IL. The acidic IL is synthesized in the lab and characterized using NMR spectroscopic techniques for understanding its purity. The various properties of BAIL are measured such as acid strength, thermal and hydrothermal stability, which showed that the catalyst is stable at a higher temperature (250 &#176;C) and possesses very high acid strength (Ho 1.57). The acidic IL converts over 90% of pentosan into sugars and furfural. Hence, the presenting method in this study can also be employed for the evaluation of pentosan concentration in other kinds of lignocellulosic biomass.

We present a protocol for the synthesis of C5 sugars (xylose and arabinose) from a renewable non-edible lignocellulosic biomass (i.e., jute) with the presence of Br&#248;nsted acidic ionic liquids (BAILs) as the catalyst in water. The BAILs catalyst exhibited better catalytic performance than conventional mineral acid catalysts (H2SO4 and HCl).

Um novo método para a análise de Pentosan presentes na biomassa de juta e sua conversão em monômeros de açúcar usando ácido líquido iônico

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) in vitro exposure systems are often large and bulky, making transport to the field and operation at the source of emission or within the breathing zone difficult. Through miniaturization of these systems, the lab can be brought to the field, expediting processing time and providing a more appropriate exposure method that does not alter the aerosol prior to contacting the cells. The Portable In vitro Exposure Cassette (PIVEC) adapts a 37 mm filter cassette to allow for in vitro toxicity testing outside of a traditional laboratory setting. The PIVEC was characterized using three sizes of copper nanoparticles to determine deposition efficiency based on gravimetric and particle number concentration analysis. Initial cytotoxicity experiments were performed with exposed lung cells to determine the ability of the system to deposit particles while maintaining cell viability. The PIVEC provides a similar or increased deposition efficiency when comparing to available perpendicular flow in vitro exposure devices. Despite the lower sample throughput, the small size gives some advantages to the current in vitro ALI exposure systems. These include the ability to be worn for personal monitoring, mobility from the laboratory to the source of emission, and the option to set-up multiple systems for spatial resolution while maintaining a lower user cost. The PIVEC is a system capable of collecting aerosols in the field and within the breathing zone onto an air-interfaced, in vitro model.

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Here, we present a protocol to perform portable cellular aerosol exposures and measure cellular response. The method uses cells, grown at the air-liquid interface, mimicking in vivo physiology. Cellular response to copper nanoparticle aerosols was observed as oxidative stress through reactive oxygen species generation and cytotoxicity as lactate dehydrogenase release.

Um novo portátil em Vitro Cassette exposição para amostragem de aerossol

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a significant increase and decrease in guard cell volume, respectively. Because shuttle transport of ions and water occurs between guard cells and larger neighboring epidermal cells during stomatal movement, the spaced distribution of plant stomata is considered an optimal distribution for stomatal movement. Experimental systems for perturbing the spaced pattern of stomata are useful to examine the spacing pattern's significance. Several key genes associated with the spaced stomatal distribution have been identified, and clustered stomata can be experimentally induced by altering these genes. Alternatively, clustered stomata can be also induced by exogenous treatments without genetic modification. In this article, we describe a simple induction system for clustered stomata in Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sucrose-containing medium solution. Our method is easy and directly applicable to transgenic or mutant lines. Larger chloroplasts are presented as a cell biological hallmark of sucrose-induced clustered guard cells. In addition, a representative confocal microscopic image of cortical microtubules is shown as an example of intracellular observation of clustered guard cells. The radial orientation of cortical microtubules is maintained in clustered guard cells as in spaced guard cells in control conditions.

An Induction System for Clustered Stomata by Sugar Solution Immersion Treatment in Arabidopsis thaliana Seedlings

The goal of this protocol is to demonstrate how to induce clustered stomata in cotyledons of Arabidopsis thaliana seedlings by immersion treatment with a sugar-containing medium solution and how to observe intracellular structures such as chloroplasts and microtubules in the clustered guard cells using confocal laser microscopy.

Um sistema de indução de estomas agrupado por tratamento de imersão de solução de açúcar em plântulas de Arabidopsis thaliana

Stomatal movement mediates plant gas exchange, which is essential for photosynthesis and transpiration. Stomatal opening and closing are accomplished by a ...