Este trabalho foi apoiado por um Centro de Pesquisa Nacional de Saúde e cuidados médicos (NHMRC) subvenção de projecto para RM

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui cumprido o Cuidado e Comitê de Ética da UNSW Austrália Animal e foram realizados de acordo com o Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho da Austrália regulamentos para a experimentação animal. Todos os procedimentos deste protocolo deve ser realizado de acordo com a exigência do Comitê Animal Care and Ethics relevante. 1. Acetylcholinesterase histoquímico Coloração <ol><li> Preparar a mistura de reacção acetilcolinesterase <ol><li> Adicionar 290 mg de iodeto de acetiltiocolina a 200 ml de tampão 0,1 M de fosfato (PB). Misturar com um agitador magnético a 900 rpm. </li><li> Adicionar 600 mg de glicina sob agitação contínua. </li><li> Adiciona-se lentamente 420 mg de sulfato de cobre para a mistura reaccional, sob agitação contínua até o produto estar completamente dissolvido. </li></ol></li><li> Retirar a pele na parte da carcaça do animal (obtido através de partilha de tecido) fazendo incisõesna pele de um rato ou rato perfundido, agarrando a pele da área de pescoço e puxando-o passado seus pés. Certifique-se de que a fáscia que cobre cada músculo é removido ou perfurado de forma significativa para assegurar exposição suficiente das fibras musculares para a solução reaccional. </li><li> Imergir todo o corpo ou parte do interesse na mistura de reacção e incuba-O / N a 4 ° C. </li><li> Lava-se a carcaça durante 2 min em água destilada. Nota: Nesta fase, os músculos exibem uma coloração azul e as placas motoras terminais (MPE) pode ser vista como pontos brancos. </li><li> Expor a carcaça para uma solução de sulfureto de amónio a 10% durante 3-5 segundos. Nota: As fibras musculares vai rapidamente virar marrom e os deputados do Parlamento Europeu será observável como pontos salpicados pretos. Se a reacção ocorre muito rapidamente, e as fibras musculares são coradas muito escuro para distinguir entre os eurodeputados e as fibras musculares tente usar concentrações mais baixas da solução de sulfureto de amónio (por exemplo, 5%). O tempo de reacção para obter oóptimo contraste entre os eurodeputados e as fibras musculares varia de uma amostra para a outra. Por conseguinte, é difícil definir o tempo de exposição exacto com o reagente. A reacção deve ser cuidadosamente monitorizado e parado quando o contraste é considerada adequada. </li><li> Lave a carcaça duas vezes, com agitação em água destilada e suavemente pat a seca de carcaça. </li><li> Fotografia tanto os aspectos lateral e medial do membro, garantindo que os deputados do Parlamento Europeu para todos os músculos de interesse são capturados. </li></ol> 2. As injeções intramuscular nas placas Motor End <ol><li> Puxe micropipetas de vidro com um puxador de micropipeta (o uso de micropipetas graduadas com êmbolos é recomendado). Com a ajuda de um microscópio de dissecação, quebrar as pontas das micropipetas com um par de pinças de modo a que o diâmetro interno do lúmen da micropipeta é aproximadamente 0,5 mm. </li><li> Certifique-se de que todos os instrumentos cirúrgicos utilizados são recém-autoclavado e thna área cirúrgica é estéril. </li><li> Encha as micropipetas com Fluoro-Gold (5% em água destilada). </li><li> Anaesthetise induzir no animal numa câmara de indução com isofluorano (4% em O 2). Verifique se há reflexo de endireitamento e garantir a sua ausência antes de o retirar da câmara de indução. Garantir um cone de nariz através da focinho do rato e entregar isofluorano (2% em O 2) para a manutenção da anestesia. Comprima dedos do animal e gentilmente tocar o olho do animal para garantir que tanto a retirada pedal e os reflexos da córnea estão ausentes. Nota: Uma mistura de cetamina e xylazil também pode ser usada (80 e 10 mg / kg, respectivamente, entregue por via intraperitoneal). A ketamina é um anexo 8 (&quot;Controlada&quot;) de drogas e protocolos necessários associados com a compra, uso, armazenamento e eliminação da droga terão de ser respeitados. </li><li> Aplicar lubrificante olho para evitar a secagem dos olhos durante o decurso do processo. </li><li> Raspar a tmembro argeted e uso de gaze para limpar a área raspada com três esfrega alternadas de clorexidina e álcool 70%. Transferir o animal à zona cirúrgica. </li><li> Colocar o animal em um underpad limpo e posicioná-lo de forma adequada para garantir um bom acesso ao músculo alvo (s). </li><li> Utilizar um par de pinças com dentes apertos para levantar a pele sobre o músculo orientada para longe da musculatura subjacente e fazer uma incisão na pele com tesouras cirúrgicas. Assegure-se que a incisão seja suficientemente grande para expor completamente o músculo (s) de interesse. Certifique-se de que não há o mínimo de interrupção para a fáscia. </li><li> Use as fotografias de MEP para transpor mentalmente a localização e forma da região de MEP para o músculo (s). Nota: Um marcador de feltro fino poderia ajudar a reproduzir a região do MEP da fotografia para o músculo (s) de interesse. </li><li> Executar múltiplas injecções ao longo do comprimento total da região de MEP (para Fluoro-Gold, 3 a 4 injecções de 1-2 ul cada should ser suficiente). Limpe cuidadosamente o músculo (s) para remover qualquer infiltração. </li><li> Traga as duas extremidades da pele incisão perto junto com uma pinça sem corte e fechar a ferida com grampos cirúrgicos. Se infiltrar Bupivacaína 0,1 ml (0,5% em água) (ou outros anestésicos locais) ao longo de toda a extensão da ferida. </li><li> Desligue a máquina anestésico fora e monitorar o animal até que ele tem está totalmente recuperado da anestesia. </li><li> Esperar durante 14 dias entre a administração de injecções intra-musculares e a perfusão dos animais. </li></ol> 3. As perfusões <ol><li> Administrar uma dose letal de pentobarbitona solução de sódio (por exemplo Lethabarb; 150 mg / kg) ao animal por injecção intraperitoneal. <ol><li> Acompanhar de perto o animal até um nível profundo de anestesia é alcançado, como foi confirmado pela ausência da retirada pedal e os reflexos da córnea. </li></ol></li><li> Posicione o animal à sua volta em uma placa de dissecação colocado sobre um perfusion pia. </li><li> Utilizar um par de pinças com dentes apertos para levantar a pele que cobre a base do esterno. Faça uma pequena incisão na pele com um par de tesouras cirúrgicas fortes imediatamente abaixo do esterno e em seguida, usar a pinça para agarrar a cartilagem xifóide do esterno. Mantendo a cartilagem xifóide, alargar a incisão em ambos os lados da cavidade torácica, a partir do esterno para as axilas. </li><li> Cortar o diafragma para expor o coração. <ol><li> Injectar 0.ml de heparina directamente para o vértice do coração para impedir a coagulação do sangue. </li><li> Cortar o vértice para permitir a inserção de uma cânula no ventrículo esquerdo, e, em seguida, apertar rapidamente a cânula no lugar com a ajuda de um hemostático. </li><li> Faça uma incisão no átrio direito com um par de tesouras finas e iniciar imediatamente a bomba peristáltica. Perfundir com 0,1 M PB até que o líquido que flui para fora do átrio é quase livre de sangue e a cor do fígado torna-se castanho claro. Em seguida, perfundir com uma solução de paraformaldeído (4% em 0,1 M PB) até que todo o corpo do animal se torna rígida. </li></ol></li></ol> 4. Cervical Spinal Cord Dissecção e Preparação para Histologia <ol><li> Coloque a carcaça do animal em seu abdômen. </li><li> Cortar a pele na linha média do corpo com um bisturi e reflectir a partir da base do crânio até ao nível do osso ilíaco. </li><li> Cortar e refletem os músculos paravertebrais para expor o aspecto dorsal da coluna vertebral. </li><li> Identificar o processo espinhoso óssea do Atlas, o segundo segmento cervical (ou seja, C2), e removê-lo com um par de fórceps ou pinças cirúrgicas para localizar a raiz dorsal correspondente subjacente. <ol><li> Identificar a raiz C2 direito colorindo-o com um marcador de feltro permanente. </li><li> Remover o próximo vértebras, um por um e marcar as raízes dorsais direito com cores alternadas (ou seja, C2, C4, C6, C8 e pode ser colorido de verde e C3, C5, C7, T1 pode ser colORed em azul). </li></ol></li><li> Utilize uma pequena agulha cirúrgica (por exemplo, 30 L agulha de calibre) para suavemente perfure através da dura-máter que cobre a extremidade inferior da medula espinhal. Com o bisel da agulha virada para cima, levantar a dura-máter longe do cabo enquanto move a agulha de rostral para fazer uma fenda longitudinal. <ol><li> Reflectem a dura. </li></ol></li><li> Corte o transversalmente da medula espinhal em blocos de um ou dois segmentos com uma nova lâmina de bisturi. <ol><li> Deixar os segmentos da medula espinhal in situ e, para cada bloco, cuidadosamente fazer uma pequena marca fiducial no lado esquerdo de cada bloco com a meio caminho entre a lâmina de bisturi duas raízes adjacentes. Certifique-se de que a marca fiducial é suficientemente profundo através do tecido a ser visível a partir do aspecto ventral dos blocos. Adicione a marca fiducial a um ângulo de aproximadamente 45 °, que aponta ou anteriormente ou posteriormente com respeito à anatomia animal, para auxiliar na orientação do segmento de tecido a seguir a dissecção. </li></ol></li><li> Recolher os blocos individuais em frascos pequenos, claramente marcado contendo uma solução de paraformaldeído (4% em 0,1 M PB) e deixar à TA S / N. </li><li> Transferir os blocos em garrafas limpas, claramente marcado contendo uma solução de sacarose (30% em 0,1 M PB) e manter a 4 ° C durante pelo menos dois dias. </li><li> Coloque os segmentos em crio moldes e os cobriu com meio congelamento do tecido. Para a preparação histológica longitudinal, orientar os blocos com o dorso voltado para cima e usar a marca fiducial para orientar o bloco nos moldes crio. </li><li> Congelar as crio-moldes à temperatura de -20 ° C e cortado com um crióstato em secções de 50 micrometros de espessura. Nota: As secções podem ser directamente montadas em lâminas de microscópio de adesão e deixa-se secar S / N. Em alternativa, as seções podem ser lançada em placas de 48 poços cheios de 0,1 M PB e posteriormente montado usando a marca fiducial para orientar as secções de tecido sobre os slides. </li></ol> 5. lombar Spinal Cord Dissecção e Preparação para Histologia <ol><li> Coloque a carcaça do animal nela está para trás. </li><li> Realizar uma incisão na linha média ao longo do abdómen do animal e remover as vísceras. Dissecar os músculos da parede abdominal posterior para expor o aspecto ventral da coluna vertebral. </li><li> Localize a costela caudal-mais curto e sua adjacente vértebra T13 onde a raiz ventral T13 sai do osso. <ol><li> Consecutivamente remover um por um a rostral dois ou três vértebras para T13 (isto é, T12, T11 e, se necessário, T10) com fórceps cirúrgicas finas para seguir a raiz ventral T13 até ao seu ponto de entrada na face ventral da medula ventral e marcá-lo com um marcador de feltro permanente. </li><li> A partir deste ponto em diante, repetir o mesmo processo para identificar a localização dos pontos de entrada de raiz ventral para L1, L2, L3, L4, L5, L6 e S1, colori-los com cores alternadas. </li></ol></li><li> Siga o mesmo procedimento como descrito na Seção 4,5-4,10 para lumbar dissecção da medula espinhal. </li></ol>

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P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Segmentação intramuscular e subsequente transferência de transgenes retrógrada terapêuticas para os correspondentes neurónios motores α para o tratamento experimental da condição neuromuscular não é uma nova estratégia. Por exemplo, este método de entrega tem sido usado para retardar a degenerescência neuromuscular em diferentes fases da progressão de ALS em ratinhos e ratos SOD1 1,9-12, bem como em ratinhos com SMA 13. Embora promissora, a eficácia destes cenários de terapia de ge...

A perda de controle do movimento voluntário que resulta de condições neurológicas, como a doença do neurônio motor e spinal-, bem como atrofia muscular de Duchenne é uma condição debilitante que tem um impacto elevado e duradouro na vida todos os dias dos indivíduos afetados. Durante a última década, os esforços de pesquisa com o objetivo de parar ou pelo menos retardar os efeitos deletérios dessas doenças neuromusculares tem sido uma prioridade para muitos médicos e cientistas de todo o mundo. A este respeito, a recente geração de modelos animais que imitam estas doenças neuromusculares foi essencial na obtenção de conhecimentos fundamentais sobre os mecanismos fisiológicos subjacentes ao desenvolvimento e à progressão destas condições 1-13. O tratamento destas doenças neuromusculares requer acesso directo à medula espinal e pode ser conseguida através de injecções na medula espinhal 14,15. Os recentes avanços na terapia genética também têm como alvo os músculos estriados do superior emembros inferiores a genes terapêuticos de transporte para os neurônios motores α correspondentes que estão localizados dentro do corno anterior da medula espinhal 1,9-13. No entanto, esta estratégia promissora uma vez não conseguiu melhorar o resultado dessas condições neurológicas. Embora seja justo concluir que estes resultados pobres poderia ser, pelo menos em parte, ser atribuída à baixa eficácia destes genes protetores, não se pode excluir a baixa eficácia destes métodos de entrega de genes. Placas motoras (MPE) são regiões especializadas das miofibras esqueléticos que são recuados pelos terminais do axônio de grandes fibras motoras periféricas provenientes de α neurônios motores. Em conjunto, as terminações de fibras nervosas periféricas e os eurodeputados formar a junção neuromuscular, ou seja, o local onde os impulsos sinápticos são desencadeadas pela libertação anterógrada do neurotransmissor, acetilcolina. Importante, a relação entre as fibras nervosas periféricas e os eurodeputados é bi-direccional, embora diferentes motores são responsáveis ​​pelo transporte de moléculas e organelas, bem como no sentido para longe do neurónio somata 16-18. À luz dessas considerações anatômicas, os deputados parecem ser os alvos de escolha para a entrega e transporte retrógrado subsequente de material genético para os neurônios motores correspondentes. Neste contexto, não é surpreendente que o sucesso da transdução de neurónio motor depende muito da distância entre a injecção intramuscular de vectores virais e do PE do músculo 19-20. Surpreendentemente, no entanto, a localização exacta das zonas de MEP nos miofibras do rato de laboratório e do rato, as duas espécies de escolha para modelar doenças neuromusculares, não estavam disponíveis até recentemente. Temos produzido mapas detalhados da região do MEP para vários músculos forelimb no rato eo rato 21-22. Mais recentemente, nós mostramos os detalhes da organização do MEP region por vários músculos do membro posterior do rato 23 e estamos actualmente a analisar as características dos deputados do Parlamento Europeu sobre o membro posterior de ratos. Em nossas mãos, injeções intramusculares de traçadores retrógrados dirigidos às zonas inteiras MEP nestes músculos deu origem a neurônios motores mais marcadas que estão abrangendo segmentos da medula espinhal mais do que o relatado anteriormente. Aqui apresenta-se o protocolo que tem sido desenvolvida ao longo dos últimos anos a revelar a localização dos eurodeputados na superfície externa, bem como em toda a profundidade do membro posterior e músculos do membro anterior, tanto no rato e na ratazana.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Doenças que afetam a integridade da medula espinhal neurônios motores estão entre as doenças neurológicas mais debilitantes. Durante as últimas décadas, o desenvolvimento de vários modelos animais destas doenças neuromusculares forneceu a comunidade científica com cenários terapêuticos diferentes destinadas a retardar ou inverter a progressão destas condições. Tirando partido da maquinaria retrógrada de neurónios, uma destas abordagens tem sido a alvejar os músculos esqueléticos, a fim de genes terapêuticos de transporte em correspondentes neurónios motores da medula espinal. Embora uma vez promissora, o sucesso da abordagem de entrega de tal gene tem sido dificultada pelo número sub-ótimo de neurônios motores transduzidas até agora tem mostrado a ceder. Placas motoras (MPE) são regiões altamente especializados na musculatura esquelética que estão em contato direto sináptica para a medula espinhal α neurônios motores. A este respeito, é importante notar que, até agora, os esforços para retrogradamentegenes transferência para os neurônios motores foram feitas sem referência à localização da região de MEP nos músculos alvo. Aqui, descrevemos um protocolo simples 1) para revelar a localização exata dos deputados na superfície dos músculos esqueléticos e 2) usar esta informação para guiar a entrega intramuscular e transporte retrógrado ideal subsequente de traçadores retrógrados em neurônios motores. Esperamos utilizar os resultados desses experimentos de rastreamentos em novos estudos sobre investigando transporte retrógrado de genes terapêuticos para os neurônios motores da coluna vertebral cabo através da segmentação dos deputados.

Coloração histoquímica da acetilcolinesterase revela a localização das placas terminais do motor no sentido da largura dos músculos. A Figura 1 ilustra os resultados de coloração tais realizada em um membro anterior de rato inteiro. Sugere-se para optimizar a concentração da solução de sulfureto de amónio (por ex., 5-7% em vez de 10%), bem como o momento em que o espécimen é imerso na solução se a coloração de fundo não específica sobre as fibras musculares é demasiado exc...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K visualizações.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

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Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar os neurônios motores de um pool do motor muscular em<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Neurociência

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Abordagem endoscópica Endonasal Trans-esfenoidal: Cirurgia minimamente invasiva para Adenomas da hipófise

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Rastreamento neuroanatômica retrógrado do frênico neurônios em ratos

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Modulação não invasiva e mapeamento robótico do córtex motor no cérebro em desenvolvimento

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análise Cinética 3D para a Avaliação Funcional no modelo de rat da lesão ciática de esmagamento nervoso

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Geração organoide do nervo motor tridimensional

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...