The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement&#160;n&#176; 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.

ASM células primárias a partir de indivíduos não-asmáticos foram isoladas a partir de biópsias brônquicas no Hospital Glenfield (Leicester, Reino Unido), conforme descrito anteriormente. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Leicestershire e os pacientes deram seu consentimento informado por escrito. 1. Electrospinning PET Andaimes (Figura 2) <ol><li> Prepara-se uma solução (10 ml) de grau de bebida garrafa de PET numa proporção de 1: 1 de diclorometano (DCMro) - uma solução de ácido trifluoroacético (TFA). Concentrações de PET de 8%, 30% e 10% em peso / volume (p / v) são necessários para nanofibras, microfibra e andaimes alinhados, respectivamente, e, em seguida, agita-se a solução O / N à temperatura ambiente durante o PET para dissolver. </li><li> Transferir a solução PET para uma seringa e anexar uma 23-G (por nanofibras) ou um 18-G (para microfibra e alinhado) agulha na seringa e coloque a seringa em uma bomba motorizada seringa. Certifique-se a ponta da agulha é rodado para a parte inferior. </li><li> Posicione o mandrel 15 cm de distância da ponta da agulha, assegurando a agulha é apontada para o centro do tambor. </li><li> Conecte o fornecimento de energia elétrica para a ponta da agulha com clips de crocodilo e aterrar o mandril (através da tomada de banana) para a terra. Ligar o fornecimento de energia para o mandril e ajustar a velocidade de 60 rotações por minuto (equivalente a cerca de 13,2 m · min -1) de nanofibras e microfibras andaimes. Regule a velocidade de 2.000 rpm (equivalente a cerca de 440 m · min-1) andaimes para Alinhados. </li><li> Definir a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de 0,5 mL · h -1 para andaimes aleatórios e alinhadas nanofibras ou 2,0 ml · h -1 para andaimes de microfibra. Permitir que a bomba funcionar até que a solução é extrudida a partir da ponta da agulha, a fim de remover todo o ar no interior da agulha. Em seguida, parar a bomba. </li><li> Na bomba de seringa, definir o volume total da solução a ser expelido para 2 ml e ligar a bomba. </li><li> Set alimentação de tensão a 14 kV, e ligue o supp poderly. </li><li> Electrospin até 2 ml de solução foi electrospun (4 horas por nanofibras e andaimes alinhados, 1 hr para andaimes de microfibra). </li><li> Cortar o andaime com uma lâmina ao longo da largura do mandril. Isto produz uma folha de 2D de andaime o tamanho da área de superfície do mandril (neste caso, uma folha rectangular 22 centímetros x 11 cm), que pode ser cuidadosamente descascada o mandril). Guarde o andaime em papel de alumínio para reduzir a carga eletrostática). Nota: andaimes bifásicas são produzidos por eletrofiação seqüencial um andaime de nanofibras diretamente sobre um andaime de microfibra. </li></ol> 2. Esterilização de andaimes antes da utilização em cultura de células <ol><li> A partir da folha de andaime, punch out discos de andaimes bifásicos ou alinhadas usando uma caneta biópsia 0,8 milímetros de diâmetro e furar a junta usando cola aquário não-tóxicas. </li><li> Esterilizar andaimes utilizando irradiação ultra-violeta durante 30 minutos de cada lado dos suportes antes da imersão em um 20% Vol / vol solução de antibiótico / antimicótico (2x10 5 unidades de ml-1 de penicilina G, 2,000 mg mL -1 de sulfato de estreptomicina e 500? G ml -1 de anfotericina B) O / N a 4 ° C. </li><li> Lave andaimes com PBS três vezes, e depois armazená andaimes em placas de poços TCP em PBS a 4 ° C até o uso. </li></ol> 3. Celulares Constituintes Meios de Cultura <ol><li> As células epiteliais de cultura CALU3 em meio DMEM-F12 suplementado com soro a 10% vol / vol de vitelo fetal (FCS), solução 2 nM de L-glutamina, 1% vol / vol de antibiótico / solução antimicótica (10.000 unidades de ml-1 de penicilina G, 100 mg ml -1 de sulfato de estreptomicina e 25 ug ml -1 anfotericina B). </li><li> Culturas de fibroblastos MRC5 e ASM em meio DMEM suplementado com soro a 10% vol / vol de vitelo fetal (FCS), solução 2 nM de L-glutamina, 1% vol / vol de antibiótico / solução antimicótica (10.000 unidades de ml-1 de penicilina G, 100 mg ml -1 de sulfato de estreptomicina e 25 ug ml -1 anfotericina B). </li><li> Cultura de co-culturas de células epiteliais de fibroblastos-ASM em um DMEM-F12 70:30: mistura de meio DMEM. </li></ol> 4. Sementeira de fibroblastos e células epiteliais para Bifásico Andaime <ol><li> Numa placa de cultura de tecidos, embeber os andaimes em meio DMEM suplementado e incubar a 37 ° C durante 1 h antes de semeadura de células. </li><li> Remova a mídia DMEM-suplementados, coloque a fase de microfibra de andaime apical e sementes 1.5 x10 4 MRC5 células de fibroblastos em 30 ï¿½ de meio DMEM-suplementados. Agitar placa num agitador orbital durante 2 horas, antes de deixar em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 em ar S / N. </li><li> Rode o andaime sobre o modo da fase de nanofibras de andaime enfrenta apical, semente 3.0 x10 4 CALU3 células epiteliais em 30 ï¿½ de meio-completada DMEM-F12 para a fase de nanofibras do andaime e incubar foR 2 h a 37 ° C, 5% de CO 2 em ar antes de submergir o andaime em 70:30 de DMEM-F12: DMEM suplementados com meios de O / N antes da transferência para o biorreactor. </li></ol> 5. Sementeira de Células ASM para o Alinhados Andaime <ol><li> Numa placa de cultura de tecidos, embeber os andaimes em meio DMEM suplementado e incubar durante 1 hora a 37 ° C antes da semeadura 2,5 x10 4 células em 30 ul de meio DMEM suplementado e incubando durante 2 horas (37 ° C, 5% de CO 2 em ar). Mergulhe andaime em retorno de mídia DMEM suplementado para incubadora e deixar O / N antes da criação de um tri-cultura no biorreator. </li></ol> 6. Configurar o Tri-cultura utilizando o Sistema de biorreator (Figura 7) <ol><li> Coloque a junta suporte bifásico na ranhura dentro de uma câmara com a fase epitelial voltada para cima na câmara. </li><li> Coloque o andaime alinhado por baixo do suporte bifásico (por isso é adjacente ao microfiber fase do andaime bifásico) e bloquear as duas câmaras do biorreator juntos. </li><li> Montar dois circuitos de fluxo de perfusão ligados a dois reservatórios médio (meio DMEM-F12 suplementado em reservatório apical, DMEM-F12 / meio DMEM suplementado em reservatório basal) e meios de bomba em torno dos dois circuitos em cerca de 0,1 mL / min utilizando uma bomba peristáltica (40 ml de meio é reciclado através de cada circuito). Casa todas as partes do sistema dentro de uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO2 em ar. </li><li> Depois de uma semana, remova a mídia da câmara apical e cultura as células epiteliais do ALI por mais um semana antes da análise. </li></ol>

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The Authors have nothing to disclose.

A capacidade de electrospin fibras poliméricas com propriedades estruturais comparáveis ​​a ECM natural leva a numerosos polímeros naturais ou sintéticos, ou misturas de polímeros que são electrospun para recriar estes ambientes,. Manipulação dos parâmetros do processo (incluindo a escolha do polímero, concentração de polímero, solvente, temperatura e distância da ponta da agulha) todos podem características influência de andaime; no entanto, alguns parâmetros podem ter maior impacto sobre as propriedades de andaime que outros 25,. Ao modificar o diâmetro da fibra de PET, encontramos os parâmetros chave para ser a concentração do polímero utilizado, a taxa em que a solução de polímero foi electrospun, e o diâmetro da agulha. Quando eletrofiação fibras alinhadas aos parâmetros principais são o método de coleta utilizado (um mandril rotativo), e a velocidade com que a rotação do mandril. Através da redução da velocidade de mandril para 60 rpm, encontramos os andaimes alinhadas aleatoriamente produzidos apresentaram maior uni andaimedeformidade em comparação com eletrofiação para um coletor de placa lisa. As características do tecido descelularizado vias aéreas foram analisados ​​para proporcionar orientação para as diferentes topografias de andaime desenvolvidos para a cultura de cada tipo de células das vias respiratórias. Nanofibras electrospun são um andaime atraente para replicar estruturas de membrana basal, devido ao tamanho de poro pequeno, mas elevada porosidade global que permite o aumento da difusão metabolito mesmo tempo que restringe o movimento celular. 9 Enquanto optimizar os parâmetros de electrospinning, uma gama de concentrações de PET e as taxas de fluxo foram testados. As fibras mais finas foram conseguidos utilizando uma solução de p / vol% de PET 6, previamente utilizado por outros grupos. No entanto, altos níveis de beading, e uma falta de uniformidade foram problemas constantes. As tentativas iniciais para remover a perolização incluído a adição de um agente tensioactivo catiónico, brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), para a solução para reduzir a tensão de superfície, e teste de várias fontesde PET. A adição de agente tensioactivo reduziu a quantidade de perolização, mas não totalmente. Depois de tentar uma série de fontes comerciais de grãos de PET, alimento bebida grau garrafa PET foi utilizado, cortando-se garrafas de bebidas e dissolver estes no DCM: solução de solvente TFA. Utilizando esta como a fonte de PET resultou num aumento da uniformidade da fibra e uma redução em fibra de perolização. Aumentando a concentração da solução ligeiramente a 8% p / v e a redução do diâmetro da agulha (18G a 23G) que consistentemente produzidos nanofibras livre de defeitos com um diâmetro de fibra de cerca de 250 nm. Andaimes nanofibras electrospun pode ser altamente eletrostática após a recolha do mandril fazendo movimentação manual dos andaimes difíceis. Este foi melhorado, armazenando os andaimes em papel alumínio após fiação e imersão em 70% IMS antes do uso. Este apareceu para ajudar a dissipar a carga eletrostática residual deixado no cadafalso do processo de eletrofiação. Para fornecer topoographies semelhante aos microambientes individuais encontradas pelos três tipos de células das vias aéreas principais dentro parede das vias aéreas, um protocolo de electrospinning básica foi adaptada para produzir três andaimes exclusivos para estes tipos de células: por eletrofiação uma solução PET baixa concentração lentamente, nanofibras alinhadas aleatoriamente foram gerados, em que as células epiteliais foram semeadas (mimetizando o MAE). Por electrospinning uma solução mais elevada concentração de PET a uma taxa mais rápida, microfibras alinhadas aleatoriamente foram gerados (produzindo um andaime mais porosa), no qual foram semeados fibroblastos (imitando a área da sub-mucosa imediatamente abaixo da RBM). Por electrospinning uma solução de baixa concentração de PET para uma alta velocidade de rotação do mandril alinhado nanofibras foram produzidos, sobre o qual as células de músculo liso orientados na direcção das fibras, produzindo folhas de células alinhadas. Diâmetros de fibras aumentou a vantagem para o aumento da dimensão dos poros, permitindo maior penetratio celularn em andaimes e assim ajudar a criar um verdadeiro ambiente 3D,. Andaimes microfibra foram empregues para a cultura de fibroblastos no estudo para assegurar que as células residia em planos múltiplos dentro do andaime. Ao aumentar a concentração de PET e 30% em peso / volume, de fibras de PET com um diâmetro médio de 2,5 um foi produzido. Fibras de maior diâmetro (≈ 4 mm) foram produzidas usando uma solução a 35% de PET p / v, mas a uniformidade da espessura de andaime foi perdido, e maior variabilidade entre as fibras individuais era aparente. Poros no andaime de microfibra foram mais de 7 vezes maior do que os medidos nos andaimes de nanofibras (10,45 mm vs 1,43 mm, respectivamente), mas ainda estática semeadura de células fornecida limitada penetração celular. Este foi melhorada por sementeira de forma dinâmica as células usando um misturador orbital, um método demonstrou ser eficaz anteriormente. Andaimes nanofibras altamente alinhadas foram criados por eletrofiação a 10%em peso / vol solução PET para o mandril em rotação a 2000 rpm (440 ≈ m · min -1). A concentração de PET foi aumentada de 8% para evitar uma morfologia irregular de onda que as fibras expostas a concentrações mais baixas. Apesar do aumento da concentração, o alinhamento das fibras reduziu o diâmetro médio da fibra (216 nm versus 255 nm, alinhadas vs aleatório). A alta velocidade do mandril desenho as fibras para fora antes de terem secado é susceptível de causar este efeito. O alinhamento das fibras influenciado o alinhamento de células ASM, e também tem outros efeitos fisiológicos sobre as células ASM que foram caracterizadas em outra parte 21. A principal limitação deste protocolo é a incapacidade de células vivas imagem on / nos andaimes que fazem de ligação celular ou diferenciação inicial ao longo de um período de tempo prolongado impossível determinar, sem sacrificar amostras. Isso significa mais de otimização ocorre após o período de cultura, ou seja, corrigiring amostras e depois medir se cultura de células foi bem sucedida depois de não durante a cultura de células. Observando uma mudança de cor em andaimes incubadas em alamarBlue (azul para rosa) indica células estão presentes e viável, mas não é o ideal. Electrospinning polímeros mais transparentes, tais como gelatina pode ajudar a visualizar as células nos andaimes. O electrospinning de um andaime nanofibrous dentro do nosso modelo permitiu a replicação do FRP das vias aéreas, de forma semelhante composto de nanofibras densas em que as células epiteliais residem. Foi previamente demonstrado que as células estruturais não pode migrar através do andaime de nanofibras 22, embora as células imunes são capazes de (dados não mostrados). Embora vantajosa para a cultura de tipos de células específicos sobre uma superfície em 3D (tais como células epiteliais e endoteliais), esta prevenção da migração das células através das nanofibras estrutural pode ser prejudicial para a cultura de outros tipos de células. Como músculo liso é incapaz de migrar através the alinhado nanofibras andaime que montou o co-cultura tri-camadas com o músculo liso e camadas de fibroblastos frente para o outro (oposto ao cadafalso alinhados que separa os dois tipos de células). Enquanto isto permite que as células sejam em estreita justaposição, o presente estudo não pode concluir se um tipo de célula (ou o de fibroblastos ou o músculo liso) ultrapassaria toda a camada ao longo de um período de cultura de mais prolongado. Apesar destas limitações, um modelo tri-camada viável de parede das vias aéreas tem sido desenvolvida que fornece uma plataforma alternativa para investigar as interacções entre estes vários tipos de células. Um estudo semelhante tri-camadas foi recentemente publicado onde fibroblastos foram incorporados dentro de um colagénio cilíndrica eu hidrogel com músculo liso semeados sobre a superfície externa e células epiteliais na superfície luminal 17. A estabilidade mecânica dos andaimes electrospun desenvolvidos aqui permitiria tubular semelhante constrói a ser formada, e mantém-se uma corrente ReseaRCH objetivo dentro do nosso grupo. Enquanto o estudo tem incidido sobre as vias respiratórias, vários órgãos dentro do corpo partes desta unidade estrutural básica da mucosa, e através da modificação dos inquilinos realçado neste estudo, plataformas semelhantes poderia ser desenvolvido para tecidos contendo uma unidade de membrana basal, vasos sanguíneos, incluindo o da bexiga e a córnea, onde modelos baseados em várias camadas de colagénio têm sido utilizados.

O campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos está avançando rapidamente, com avanços na traquéia e nos rins regeneração duas conquistas recentes notáveis. Os biomateriais desenvolvidos na engenharia de tecidos estão se tornando mais acessíveis, com oportunidades para transferir tais protocolos para laboratórios menos especializados. Um campo preparado para se beneficiar através do aumento da utilização de biomateriais está em diagnóstico in vitro. Os estudos in vitro são uma importante plataforma para investigar vias de sinalização intra-celulares dentro de tipos de células individuais, e ajudaram a delinear mecanismos subjacentes inúmeras pathophysiologies doença. Estes estudos geralmente dependem de um único tipo de célula a ser cultivada como uma monocamada em plástico de cultura de tecido (TCP); um bidimensional (2D) superfície rígida muito menos elástico e poroso do que as células de ambiente (3D) tridimensional são expostos a dentro de um tecido ou órgão. Os modelos animais têm sido tradicionalmente employed para confirmar os efeitos encontrados in vitro também se traduzem em todo o tecido, e também pode ser utilizado como plataformas pré-clínicos para investigar doenças humanas. No entanto, as diferenças entre espécies minar esta confiança em modelos animais em nossa compreensão da doença humana -. Por exemplo, muita compreensão da asma doença pulmonar é baseado em um modelo de rato, apesar das diferenças inerentes entre a condição humana e este modelo, incluindo pouca evidência de infiltração de mastócitos do feixe de músculo liso das vias aéreas, ou a capacidade de desenvolvimento da doença espontânea dentro do animal modelar 3,4. Há também considerações éticas relacionadas com a utilização de modelos animais, com o &quot;3Rs&quot; padrão de &quot;substituição, aperfeiçoamento e redução&quot; na experimentação animal que está sendo incentivada no Reino Unido e em outros países. Uma alternativa atraente seria a recapitulação de tecido humano na estrutura criando vitros para investigar a natureza cooperativa entre os tipos de células de seres humanos adultos, em uma única unidade. As células existem em estruturas multicelulares 3D dentro de tecido, cada um dentro de um micro-ambiente único. A cultura de células em TCP só permite a cultura de monocamadas de células, incapazes de se replicar este ambiente, ou fornecer a capacidade para a cultura multi-celular. Biomateriais avanço proporciona a oportunidade de desenvolver ambas as plataformas 3D naturais e sintéticos para cultura de células. Descelularizado ECM pode ser utilizado para cultura de células 3D quando repovoados com outros tipos de células, incluindo células-tronco 1, no entanto, tais protocolos pode ser complexo e demorado, com a disponibilidade de tecido e limitada em grande parte de origem não-humana. Outros protocolos permitem maior controle sobre os ambientes celulares criadas como nanoimpressão, a deposição de ECM, tecnologias de camada de células, ou electrospinning. Electrospinning cria esteiras porosas 3D não-tecidos de fibras com diâmetros que variam de nanômetros para micrômetro, replicating dimensões ECM naturais. Andaimes electrospun são cada vez mais utilizados como plataformas de cultura de células em 3D -. Manipulação dos parâmetros Electrospinning permite o controle intrincado sobre características de andaime, tais como o tamanho dos poros, diâmetro da fibra, topografia e alinhamento, e química de superfície. As alterações de tais parâmetros foram mostrados para afectar directamente a adesão celular e o crescimento, quando as células foram cultivadas isoladamente. Estas vantagens têm sido explorado no presente estudo para permitir que a cultura de vários tipos de células como uma única construção de tecido 3D, utilizando o bronquíolo das vias aéreas como uma estrutura de tecido modelo 3D. A parede bronquíolo consiste em três regiões principais (Figura 1). A mucosa é em que as células epiteliais das vias respiratórias sentar-se na interface ar-líquido (ALI), proporcionando uma barreira importante para o meio ambiente externo. Eles residem na membrana reticular basal (RBM), a ECM firmemente compacta composta principalmente de collagen IV, perlecans e lamininas. A camada de sub-mucosa encontra-se imediatamente abaixo da mucosa, uma região mais porosa composta por vários tipos de células incluindo fibroblastos, miofibroblastos e leucócitos de infiltração sob condições de doença. Finalmente feixes de músculo liso das vias aéreas a envolver em torno de uma forma helicoidal, e são constituídas por folhas alinhadas de músculo liso das vias aéreas (ASM). É parente estado contrátil do músculo liso do que controla o tônus ​​das vias respiratórias. O emprego de andaimes electrospun dentro do sistema pulmonar tinha até recentemente sido limitada a fins regenerativos; com uma substituição traqueal electrospun ser transplantadas com sucesso. Embora bem sucedido, esses tratamentos são limitados em número, e estão focados em cima da traquéia devido à natureza relativamente simples da função do tecido. Exemplos limitado de modelos de vias aéreas utilizadas para diagnóstico in vitro existem, e estão principalmente concentradas em medições contração do músculo liso,. O não-tóxico e nãopolímero de tereftalato de polietileno n-degradável (PET) foi previamente electrospun, e foi utilizado no presente estudo para garantir andaimes produzidos pode ser armazenada por longos períodos sem degradar (o que lhes permite ser usado &quot;na prateleira&quot;), e também ser adequado para cultura de células estável durante períodos de tempo prolongados. Estudos anteriores de nosso grupo mostraram que o emprego de três variações de um protocolo de electrospinning base, três andaimes electrospun PET individuais podem ser produzidos para fornecer topografias óptimas para a cultura epitelial das vias aéreas, de fibroblastos e células musculares lisas em 21,22 isolamento e a co-cultura das vias aéreas células epiteliais e de fibroblastos 22. Diâmetro da fibra foi encontrado para afectar grandemente funcionalidade epitelial 22, o alinhamento das fibras e permitiu a geração de folhas alinhadas de músculo liso 21. Estes estudos foram realizados de forma independente um do outro, em condições estáticas. No presente estudo, estes differeandaimes nt, contendo as células de seres humanos adultos totalmente diferenciada foram co-cultivadas durante uma semana no ALI num biorreactor disponível comercialmente como uma secção 3D de parede das vias aéreas, proporcionando uma fisiologicamente relevantes no modelo in vitro para investigar as respostas das vias respiratórias inter-celulares. Embora este protocolo está usando o bronchiole das vias aéreas como um sistema modelo, poderia ser adaptado como uma plataforma para a co-cultura 3D de unidades mucosas de outros órgãos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Lucozade (GSK) bottles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Mandrel</td>
			<td>Built in house</td>
			<td></td>
			<td>Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td>used in the electrospinning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for CALU3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for HASM cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for MRC5 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/ antimycotic solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital mixer (Orbital shake 503)</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td>Watson Marlow</td>
			<td></td>
			<td>For providing media flow through bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DKube</td>
			<td>Kiyatec</td>
			<td></td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adapting the electrospinning process to provide three unique environments for a tri-layered in vitro model of the airway wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Imagens de microscopia eletrônica de varredura de tecido das vias aéreas decelularizado ou imagens immunohistological de biópsias de vias aéreas identificadas características desejáveis ​​do ECM vias aéreas queríamos introduzir em topografias de andaime electrospun: Native RBM matriz constituído por fibras de cerca de 153 nm ± 30,6 nm (média ± DP n = 50 medições ) de diâmetro (Figura 3A e 5A), enquanto que a matriz em torno do MAE foi mais porosa na natureza (Figura 3C). Seções immunohistological através de feixes musculares lisas mostrar ASM presente como folhas alinhadas de células 21 (Figura 3E). Esta informação foi utilizada para guiar as características introduzidas nos andaimes electrospun. Um mandril rotativo foi capaz de rodar de forma estável em altas velocidades (&gt; 2.000 rpm / 440 m · min -1) para produzir scaffolds com fibras alinhadas. Mandril rotação lenta (60 rpm 13,2 m · min -1) não afetou a orientação da fibra, Mas produziu andaimes com espessura mais uniforme do que quando eletrofiação em um prato estático. Ao alterar os parâmetros electrospinning (concentração de PET e de taxa de fluxo de solução), que foi possível a criação de andaimes fibras com diâmetros de alguns micrómetros ou centenas de nanómetros (electrospinning parâmetros são estabelecidos na Tabela 1). Electrospun fibras com diâmetros de fibra equivalentes às fibras naturais FRP (a 150 nm) foram produzidos utilizando uma solução de 6% de PET, no entanto em concentrações tão baixas PET, perolização das fibras ocorreu (Figura 4A). Este foi eliminado através do aumento da concentração da solução de PET a 8%, o que produziu nanofibras uniformes possuindo um diâmetro médio de 255 nm ± 2,4 nm (média ± SEM) e o tamanho médio de poros de 1,43 ^ M ± 0,02 uM (Figuras 4B, 5A e B). Para electrospin nanofibras era necessária para reduzir o tamanho da agulha de 18 G a 23 G, permitindo taxas de fluxo mais lentas whilst manter uma velocidade de fluxo mais elevada e reduzir a obstrução da agulha, um problema recorrente com a agulha maior. Quando electrospinning microfibras, um aumento na solução de PET para&gt; 30% de chumbo de PET a uma falta de uniformidade de diâmetro de fibra (Figura 4F) em adição a vários bloqueios na ponta da agulha, devido à alta viscosidade da solução. Esteiras de microfibra uniformes que possuem um diâmetro médio de fibra de 2,50 ± 0,02 ^ M ^ M (média ± SEM) e o tamanho médio do poro de 10,45 ± 0,13 ^ M ^ M foram produzidas quando o PET electrospinning uma solução peso / volume a 30% a uma taxa de fluxo de 2 ml / h -1 (Figuras 4F, 5A e B). Electrospinning sequencial do andaime de nanofibras directamente sobre um andaime de microfibra (ainda ligado ao mandril) criado um suporte bifásico (Figura 3D). Os diâmetros médios de fibra eram de 280 nm ± 20 nm e 2,30 ± 0,06 ^ M ^ M para as fases de nanofibras e microfibras, respectivamente,comparável às dimensões de nanofibras e microfibras andaimes individuais. Além disso, a espessura do suporte bifásico foi semelhante à soma das nanofibras e microfibras andaimes individuais (Figura 5C). Através do aumento da velocidade mandril (2.000 rpm / 440 m · min -1), nano ou microfibra andaimes altamente alinhados foram produzidos. A solução a 8% de PET p / v não era óptima para a produção de nanofibras alinhados e fibras produzidas possuem uma morfologia de onda (Figura 3F). Um aumento de 10% de PET anulada este efeito, mas ainda resultou em um diâmetro de fibra reduzida (216 nm ± 2,2 nm (média ± SEM)) em comparação com os suportes de nanofibras alinhadas aleatoriamente. Alinhamento das fibras foi calculada por determinação do desvio do ângulo de cada fibra a partir do ângulo de fibra de média. Em andaimes nanofibras alinhados 79% de fibras estavam alinhados (± 10 ° de ângulo de fibra de média) em comparação com 10,2% de fibras alinhadas aleatoriamente scaff nanofibrasidade (Figura 5D). O andaime nanofibras 8% foi usada para recapitular o MAE em que as células epiteliais residem, e foi utilizado para suportar a cultura de células CALU3 (uma linha de células epiteliais das vias respiratórias). O peso / vol andaime de microfibra de 30%, sendo mais porosa na natureza foi usado para imitar a região sub-mucosa, e foi cultivado com células MRC5 (uma linha de células de fibroblasto das vias aéreas). Os 10% peso / volume de nanofibras alinhados andaime fornecida referência topológica para garantir o alinhamento de células ASM quando cultivadas no cadafalso. Todos os três tipos de células mostraram um aumento na viabilidade quando cultivadas nos seus suportes individuais ao longo de um período de 2 semanas (Figura 6A), e expressaram proteínas específicas do tipo de células, após o período de cultura de duas semanas (Figura 6B, 6C, e 6D). Além disso caracterização de interações célula-andaime individuais têm sido relatados em outros lugares 21,. O electrospinning sequencial do andaime de nanofibraspara o andaime de microfibra produzido um suporte bifásico para a co-cultura das células epiteliais CALU3 e células de fibroblastos MRC5 para as fases de nanofibras e microfibras, respectivamente. A cultura de células os dois em conjunto sob condições estáticas foi relatada noutro local 22. Além disso o trabalho de tentar adicionar outras camadas de células ou prolongar os tempos de cultura bifásicas para além de 2 semanas sob condições estáticas, não foi bem sucedida (dados não mostrados). Para a cultura de um modelo tri-camadas durante um período prolongado, usamos um biorreator fluxo de perfusão. O CALU3 e MRC5 células foram semeadas sobre o suporte bifásico, e as células semeadas em ASM um andaime alinhados, e ambas foram cultivadas separadamente, durante 2 dias. Os dois suportes, em seguida, foram comprados em conjunto para formar um modelo tri-camada de parede das vias aéreas dentro do bioreactor (Figura 7). Ambas as câmaras foram perfundidos com meios para 7 dias antes da câmara de epitélio apical tinha seus meios removido, e as células epiteliais foram cultivadas a aALI durante mais 7 dias. Os andaimes foram fixadas e quer seccionado e corado, ou andaimes inteiras foram histoquímica para marcadores específicos de células. Secções através da cultura tri-camada mostrou núcleos celulares distribuídos através de todas as três camadas da co-cultura (Figura 8B). Quando as células foram imunocoradas para marcadores específicos das células, as células epiteliais preenchida a fase de nanofibras apical como uma camada confluente de células e coraram positivas para citoqueratina (Figura 8C), na fase de microfibra, fibroblastos coradas positivas para S100A4 (Figura 8D), e em os 10% de células andaime ASM alinhados manchadas positivo para SM22α (Figura 8E), indicando boa sobrevida de cada tipo de célula dentro do modelo 3D da parede das vias aéreas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" /> Figura 1. O bronchiole vias aéreas. A biópsia brônquica de um gravedas vias aéreas asmáticas que mostra o epitélio sobre a membrana reticular porão (RBM), com a região da submucosa subjacente preenchido com células mesenquimatosas, e os feixes de músculo liso que envolve povoadas com células de músculo liso do músculo liso coradas para alfa-actina (castanho). A barra de escala indica 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" /> Figura 2. Um diagrama esquemático do equipamento de electrospinning. Uma seringa contendo a / solução solvente do polímero (com agulha) é colocada numa bomba de seringa de frente para o mandril. Um potencial eléctrico é estabelecido entre a agulha e fazendo com que as fibras do mandril a ser ejectadas a partir da ponta da agulha e depositadas no mandril rotativo. À medida que a fibra passa através da atmosfera,o solvente evapora, causando deposição de fibras de polímero sobre o mandril. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" /> Figura 3. Comparação de andaimes electrospun para ECM vias aéreas nativa. Imagens de microscópio eletrônico de varredura de membrana decelularizado cave (A), vias aéreas decelularizado bronchiole seção transversal (C) e um corte histológico de um pacote de músculo liso das vias aéreas (corados com hematoxilina e eosina, escala bar 40 mm) (E), em comparação com nanofibras (B) bifásica (D) e alinhados (F) andaimes PET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver</a>uma versão maior desta figura. Tabela 1. Parâmetros utilizados para eletrofiação a microfibra, nanofibras e andaimes alinhados individualmente e para o suporte bifásico. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" /> Figura 4. A alteração na concentração de PET afecta as características da fibra. Imagens de microscopia electrónica de varrimento de andaimes electrospun fiados a partir de 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% e 35% (EG) (p / v), soluções de PET . Também são mostrados andaimes alinhados produzido a partir de 8% (D) e 30% de soluções PET (H) peso / vol. AD fotografada na ampliação 5,000X, EH fotografada com uma ampliação de 1000X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver um maior</a>versão desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" /> Figura 5. Propriedades de andaimes PET electrospun. Curvas (A) Distribuição mostrando distribuição do diâmetro das fibras da matriz extracelular da membrana basal reticular (RBM ECM), nano e micro-fibra de andaimes alinhadas aleatoriamente, eo andaime de nanofibras alinhados. (B) Histograma mostrando a distribuição de tamanho de poro relativo em nano- e micro-fibra de andaimes. (C) A espessura média das nanofibras, microfibras, andaimes bifásicas e alinhadas (média ± desvio padrão, n = 6). (D) Histograma gráfico que mostra o desvio da orientação das fibras médio em andaimes nanofibras aleatórios ou alinhados análise de fibra andaime foi realizada utilizando o software ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">P</a>locação clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" /> Figura 6. A cultura dos tipos de células individuais sobre os suportes individuais. (A) os resultados do ensaio alamarBlue a viabilidade das células para células ASM em estruturas de suporte alinhados, CALU3 células em estruturas de suporte de nanofibras e células MRC5 em estruturas de suporte de microfibra (média ± SEM, n = 3- 20). Imagens de microscopia eletrônica de varredura do nanofibras, microfibra e andaimes fibra alinhados (B, C e D, respectivamente) e imagens de imunofluorescência de células CALU3 coradas para E-caderina (vermelho), MRC5 células marcadas para vinculin (vermelho) e ASM células coradas para SM22α (vermelho) tudo em seu andaime especializado (E, F e G, respectivamente). Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul), barra de escala indica 40 &amp;# 181;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" /> Figura 7. Sistema de Perfusão para tri-camada de modelo parede das vias aéreas. (A) Fotografia do navio biorreator conectado a bomba peristáltica e reservatórios de mídia 2x. (B) Esquema dos andaimes tri-camadas. (C) esquemática dos dois circuitos de biorreatores quando o modelo das vias aéreas é realizada na interface ar-líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" /> Figura 8. Completa 3D modelo da parede das vias aéreas. (A) A biópsia brônquica da parede das vias aéreas com a camada mucosa destacados em vermelho, a região da submucosa destacada em verde, eo feixe de músculo liso destaque em ouro. (B) Seção através da parede das vias aéreas em camadas-tri consiste em andaimes bifásicas e alinhadas povoadas com epitelial, fibroblastos e células musculares lisas fixas após 2 semanas de co-cultura. Núcleos celulares foram coradas com DAPI (azul) com reflectância andaime (cinza) simultaneamente trabalhada. Andaimes também foram fixados e histoquímica para marcadores específicos de células após 2 semanas, com células CALU3 coradas para citoqueratina (verde) (C), MRC5 células marcadas para S100A4 (verde) (D), e células musculares lisas coradas para SM22α (vermelho) ( E). A barra de escala indica 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tabela 1.

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Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

12.3K visualizações.  University of Nottingham. Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall. 

Vídeo: Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-layered Electrospinning para Mimic Arquitetura Arterial nativos usando policaprolactona, elastina e colágeno: um estudo preliminar

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Bioengenharia

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

A Pele Tridimensional Humanos Reconstruir Modelo: uma Ferramenta para o Estudo da Pele Normal e Progressão Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Um kit de ferramentas para permitir a conversão de hidrocarbonetos em ambientes aquosos

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigando a separação de fluxo tridimensional induzida por um polip de dobra vocal modelo

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

A cultura in vitro modelo celular para Toxic Chemical Testing Inhaled

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.