Agradecemos o apoio técnico e científico de Anja Lauterbach (Lehrstuhl Biomaterialien), Lorenz Summa (Sandler AG) e Armin Boeck (B / S / H / G). SEM-imagem foi feita por Johannes Diehl (Lehrstuhl Biomaterialien). O financiamento foi obtido a partir BMBF (01RB0710).

1. Spinning Preparação Dope <ol><li> Tome liofilizado eADF4 (C16) proteína. </li><li> Pesar 20 mg de eADF4 (C16) em 1 ml de um vaso de reacção, usando uma escala de alta precisão. </li><li> Adicionar 200 ul de hexafluoroisopropanol (HFIP) e selar o recipiente com Parafilm. Nota: HFIP é altamente volátil e deletéria. Como ele pode causar danos na vias respiratórias, o trabalho sob uma capa de segurança, pipeta com cuidado, e tampar o tubo. </li><li> Vortex a suspensão por 1 min e agitar ainda mais para limpar a solução. Para garantir que toda a quantidade de proteína é completamente dissolvido, esperar durante a noite. </li></ol> 2. Eletrofiação <ol><li> Preparação do dispositivo de electrospinning (Figura 1): colocar o material de filtro na parte superior do contra-eléctrodo e a tensão predefinida de ambos os eléctrodos (-22,5 kV) e o contra-eléctrodo (2,5 kV). Defina o volume de fluxo de 315 mL / h. Nota: wnquanto electrospinning, HFIP tóxico será evaporada. Verifique se o seu dispositivo eletrofiação está ligado a um exaustor. </li><li> Dê uma agulha 20 G disponível comercialmente e moer a ponta afiada com um moedor de mão para um comprimento residual de 30 mm. Ligação a agulha a uma seringa de 1 ml. Nota: A ponta da agulha é necessária avião, a fim de gerar um cone de Taylor bem definida. </li><li> Coloque a totalidade do lubrificante de fiação (200 mL) para dentro da seringa. Sobrepor a droga com 100 ul de ar, a fim de permitir que a solução completa para ser extrudido durante o processo de fiação. Nota: A fim de evitar o entupimento da agulha, certifique-se de que não existem partículas de agregados (ou impurezas) do lubrificante de fiação. Trabalhar sob um exaustor! </li><li> Coloque a seringa cheia para a bomba de seringa do dispositivo de electrospinning e pressionar cuidadosamente o pistão na seringa até que uma gotícula de aparecer na ponta da agulha. Bloquear o pistão. </li><li> Defina a distânciaentre a ponta da agulha e o contra-eléctrodo de 8-20 cm. </li><li> Iniciar a bomba de seringa e remover o (geralmente secas) de gotículas a partir da abertura da agulha. Activar a todas as instalações de segurança do dispositivo de electrospinning imediatamente e iniciar a fonte de alta voltagem assim como uma nova gota aparece. Eletrofiação da droga fiação começará posteriormente. Use um cronômetro para controlar o tempo de fiação. Nota: A fim de evitar secagem da solução e, assim, o entupimento da agulha, que é necessário para iniciar imediatamente o processo de fiação, depois de remover a gota seco. </li><li> Desde electrospinning de proteínas de seda de aranha recombinantes, depende da temperatura e humidade, uma adaptação dos parâmetros de processo para condições laboratoriais individuais pode ser necessário (Figura 2). Nota: Para evitar que a gota de secagem (Figura 2B) permitir um caudal suficiente. Se houver uma baixa umidadty na atmosfera circundante, ajuste da umidade relativa ou aumentar a vazão. Diminuir a tensão até um cone de Taylor adequada ocorre (Figura 2A). Quando não existe uma solução na ponta (Figura 2C), aumentar a taxa de fluxo e reduzir a tensão até que uma gotícula ocorre. Em seguida, ajustar a tensão, a fim de estabelecer um cone de Taylor regular e estável (Figura 2A). </li><li> Após 30 seg / 60 seg / 90 seg de eletrofiação desligar a bomba de seringa. A fim de evitar a queda de gotas, esperar 10 segundos antes de desligar a fonte de alta tensão para libertar a pressão residual dentro da seringa. </li><li> Passos 6-8 podem ser realizados em diferentes tipos de materiais de filtro, tais como a poliamida, polipropileno e poliéster, malhas, não tecidos, papel, bem como preto para comparação. </li><li> Para produzir um não tecido mesh para os experimentos de estabilidade subseqüentes, use papel preto em vez de material filtrante e execute as etapas 5 a 7. Após 5 min de electrospinning, pareo processo tal como descrito no passo 8. </li></ol> 3. Pós-tratamento de malhas não-tecidos de seda <ol><li> Um forno de pré-aquecimento a 60 ° C. </li><li> Coloque os suportes de filtro com eADF4 (C16) malhas não tecidos verticalmente e com uma distância mínima de 2 cm em um recipiente de vidro com fechadura. O recipiente deve ter duas aberturas que irão ser utilizados para introduzir posteriormente etanol e água. Nota: Ao fixar os materiais filtrantes, certifique-se de que a área necessária para os experimentos de permeabilidade não está danificado pelos grampos. </li><li> Ligação duas seringas de 60 ml, cheio com um álcool e um cheio com água, com tubos de silicone que apontam para o interior da parte inferior do contentor de pós-tratamento (Figura 3). Nota: A fim de ser capaz de remover o líquido do recipiente, após o tratamento, o lugar das aberturas dos tubos de tão perto quanto possível do fundo. </li><li> Colocar o recipiente de pós-tratamento no ovpt e adicionar 60 ml de etanol por meio de extrusão da seringa. Use um cronômetro para controlar a duração do tratamento. </li><li> Após 90 min de tratamento de vapor de etanol, remover o etanol, com a seringa a partir do vidro, e adicionar 60 ml de água a partir da segunda seringa. </li><li> Espere por mais 90 min, em seguida, retire a água e desligue o forno. A fim de evitar a condensação de gotículas, deixar o recipiente dentro do forno até que tenha arrefecido completamente. </li></ol> 4. Análise de aranha não tecidos malhas de seda <ol><li> Prepare as malhas não tecidos de seda para testes de estabilidade em papel preto ou qualquer outro suporte removível. Corte dois quadros de papelão e ajustar fita adesiva dupla-pegajosa. Pressione um quadro para a seda não tecido mesh depositado em papel preto e usar um bisturi para cortar o excesso de fibras de seda (manter as fibras em excesso para posterior SEM-imaging). Retire cuidadosamente o quadro, a fim de destacar o não tecido do papel. Repita este passo com o segundo quadro(Figura 4). </li><li> Teste de mergulho prático: Corte um pedaço (1 cm 2) de cada um, o pós-tratados e não-tratados de seda não tecido mesh e mergulhá-lo em água deionizada. O não-tratado não tecido de seda de malha irá dissolver imediatamente, enquanto que a malha não urdido tratado será estável (Figura 5). Depois de mergulhar, secar a amostra mergulhada e prepará-lo para SEM imagem. </li><li> A espectroscopia de infravermelhos transformada de Fourier (FTIR) e subsequente medição auto-desconvolução de Fourier (FSD): Transmitância: A fim de obter informações sobre as alterações estruturais das proteínas de seda sobre pós-tratamento das malhas, não tecidos, FTIR pode ser aplicada usando os parâmetros -mode, varredura de 800 a 4.000 cm-1, 60 acumulações são medidos e média para cada espectro, uma referência é medido por espectro. Para a análise quantitativa dos dados, pode ser empregue FSD (Figura 6 e Figura 7). Assim, as curvas são reduzidos ao ar dadoseA entre 1590 e 1705 centímetros -1 e uma correção de linha de base é realizada. Um ajuste de mínimos quadrados local é calculado de acordo com as posições de pico tomadas a partir de estudos anteriores (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 cm-1) 22. </li><li> Imagem MEV: SEM pode ser aplicado para estudar diâmetros de fibra e a morfologia das fibras de seda em diferentes substratos de filtro e para analisar a influência do pós-tratamento sobre a morfologia da fibra (Figura 8). Use ampliações de 5.000 a 25.000 x x para obter imagens bastante detalhadas. </li></ol> 5. Determinação da Permeabilidade ao ar <ol><li> Coloque uma parte boa montagem do material do filtro na área de medição de um dispositivo de permeabilidade ao ar Akustron. Observação :: Se você usar outro tipo de dispositivo de permeabilidade ao ar, certifique-se de que preenche os requisitos da norma DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 e as normas ASTM D 737-96. </li><li>Empregar um dispositivo Akustron permeabilidade ao ar (ou qualquer outro, conforme ilustrado em 5.1). Se necessário calcular os dados normalizados [l / (m 2 x seg)]. </li><li> Repita pelo menos 10 vezes os passos 1 e 2 com diferentes partes de sua amostra e calcular a média aritmética (Figura 9). Nota: A permeabilidade ao ar de medição requer o contacto do dispositivo e a malha não urdida. Assim, um tratamento cuidadoso das amostras é essencial para prevenir a ruptura do delicado de seda de malha não urdido. </li></ol> 6. Determinação da eficiência do filtro <ol><li> É uma máquina adequada com controlo de pressão e contador de partículas, tal como um calibrador de partículas (Universal Palas GmbH, Karlsruhe, Ger). </li><li> Coloque as amostras de filtro no dispositivo de retenção de partículas e uma medida (Figura 10). Aerosol: Di-etil-hexil-sebacat (DEHS); tamanhos de partículas: 0,3-3 mM, duração: 30 seg; velocidade do líquido: 2,350 cm / s; fluxo de ar: 3.400 m 3 / h. <br/&gt; Nota: Lidar com a amostra com cuidado e não toque na superfície para evitar a destruição da malha não tecido e evitar qualquer tipo de poluição. Certifique-se de criar amostras suficientes de igual qualidade para medições de desempenho. </li></ol>

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Não temos nada a divulgar.

Os novos dispositivos de filtro deve permitir a redução do consumo de energia em geral em eficiências de filtração do ar constante do filtro ou superior. Aqui, esses dispositivos foram criados usando falsos tecidos feitos de seda de aranha. Devido a sua baixa tensão de superfície e elevada volatilidade, HFIP foi escolhido como um solvente adequado para o processo de electrospinning. Além disso, as soluções aquosas de seda têm sido testados em experiências anteriores, mas sem as fibras podem ser gerados. Aqui, seria essencial para o uso de aditivos, a fim de reduzir a tensão superficial e, assim, melhorar as propriedades da solução de fiação. O passo mais importante é ajustar as condições ea concentração de material utilizado e solvente da solução de fiação, fiação altura, tensão e velocidade de extrusão. Durante o desempenho, por exemplo, o entupimento da ponta pode ser impedida através do fornecimento da ponta da agulha com a humidade na forma de vapor de água, mas qualquer tipo de adições na configuração electrospinning podem posteriormente perturbaro processo sensível e campo eléctrico. Parâmetros de processo essenciais (concentração, a tensão, a distância, de humidade) foram determinados individualmente realização séries experimentais separado (dados não mostrados). Levando em consideração todos os parâmetros é fundamental para cuidar de um cone taylor contínua e processo de fiação para criar fibras uniformes. A eficácia do filtro é um dos parâmetros mais importantes de materiais filtrantes. Este parâmetro é influenciado principalmente pela estrutura do material do filtro. Wovens herdar tamanhos de poro uniformes e de permeabilidade ao ar subsequentemente consistente. É crucial para criar malhas, não tecidos homogéneas sobre estes materiais de molde para encher os poros e para gerar um filtro de defeito zero. A eficiência do filtro nos filtros mostra uma dependência directa sobre a duração de fiação (das proteínas de seda), e, por conseguinte, o número de camadas de telas não tecidas. As lacunas entre as fibras individuais são constantemente cheio, o que permite a retençãof partículas menores. Neste trabalho apresentamos um método para produzir um material de filtro romance com seda de aranha malhas não tecidos, mostrando alta eficiência do filtro. Portanto, esses filtros são candidatos promissores para uso futuro em sistemas de filtração de ar.

Devido à sua combinação de força e extensibilidade, fibras de seda de aranha pode absorver mais energia cinética do que a maioria de outras fibras naturais ou sintéticas 1. Além disso, ao contrário dos materiais poliméricos sintéticos mais materiais de seda são biocompatíveis e não tóxicos e que não causam reacção alérgica quando incorporados 2,3. Riscos de saúde putativas pode ser prevenida usando seda de aranha. Estas características tornam seda de aranha altamente atractivo para uma variedade de aplicações médicas e técnicas. Uma vez que as aranhas não podem ser cultivadas, devido ao seu comportamento canibalístico, métodos biotecnológicos foram desenvolvidos para a produção de proteínas de seda de aranha, tanto de forma rentável, e em quantidades suficientes 4. A proteína de seda recombinante eADF4 (C16) foi desenvolvido com base na seqüência natural de Araneus fibroína 4 (ADF4). eADF4 (C16) tem um peso molecular de 48kDa 5 e é solúvel em vários dissolventes (hexafluoroisopropanol (HFIP) 6, 7 e ácido fórmico tampões aquosos) 8. eADF4 (C16) podem ser processados ​​em diferentes morfologias tais como películas 9, 8 cápsulas, as partículas 10, 11, hidrogéis, revestimentos de 7, 12 e malhas de fibras não urdidas 6. Devido à sua estabilidade química, este último fornecer um elevado potencial em aplicações de filtros. Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar dispositivos de filtro de ar, incluindo uma malha não-tecido de proteínas da seda de aranha recombinantes electrospun. Electrospinning fiação ou electrostático é uma técnica geralmente utilizada para a produção de fibras de polímeros com diâmetros na gama de 10 nm, 13 -10 mM, malhas e não tecidos já foram investigados para aplicações de filtro 14. No passado, electrospinning tem sido aplicado com sucesso para a transformação de regeneração 15, bem como produzida de forma recombinante de seda de aranha 16proteínas. Tipicamente, uma alta tensão (5-30 KV) é aplicada a uma seringa e um contra-eléctrodo (0-20 kV), colocada a uma distância de 8-20 cm. O campo electrostático forte induz forças repulsivas na solução carregada. Se a tensão superficial é excedido, um cone de Taylor é formado, e um jacto fino irrompe da ponta 17,18. Após formação, as instabilidades de dobragem ocorrem no jacto causando mais estendendo-se o solvente se evapora, e uma fibra sólida é formada. Finalmente, a fibra é depositado aleatoriamente no contra-eléctrodo como uma malha não urdido 19. Propriedades da fibra, como topologia de diâmetro e superfície (lisa, porosa) são principalmente dependentes de parâmetros de solução, como a concentração, a viscosidade, a energia livre de superfície e intrínseco de condutividade elétrica do solvente e permeabilidade 20. Eletrofiação de eADF4 (C16) dissolvido em resultados HFIP em fibras lisas com diâmetros de 80-1,100 nm dependendo da concentração de proteína na solução.eADF4 (C16) a partir de HFIP electrospun exibe uma estrutura predominantemente α-helicoidal secundário e as fibras são solúveis em água 6. A fim de estabilizar as fibras de seda, as estruturas β folhas tem que ser induzida por meio de tratamento subsequente com etanol. Em contraste com os métodos de tratamento de pós-21 previamente estabelecidas, neste estudo eADF4 (C16) não-tecidos foram tratados com o vapor de etanol, a fim de preservar a morfologia das fibras de seda. Análise da estrutura secundária foi realizada utilizando espectroscopia de infravermelhos transformada de Fourier (FTIR) e subsequente auto-desconvolução de Fourier (FSD), como descrito na literatura, 22. FSD é um instrumento de processamento de sinal que permite a resolução dos espectros de FTIR que consiste em várias bandas sobrepostas. Deste modo, as bandas indistintas da ampla em meio I região pode ser reduzida utilizando um filtro passa-alto para receber um espectro deconvoluídos com melhores resoluções de pico. A fim de avaliar a eficiency de substratos de filtro complementadas com malhas, não tecidos de seda, ensaios de permeabilidade ao ar foram realizadas utilizando um dispositivo de Akustron de acordo com protocolos padrão. As taxas de deposição foram medidos usando um Palas universal sizer partícula.

air filter devices including nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins

Com base na sequência natural de Araneus fibroína 4 (ADF4), a aranha proteína de seda recombinante eADF4 (C16) foi projetado. Esta proteína é altamente repetitiva tem um peso molecular de 48kDa e é solúvel em solventes diferentes (de hexafluoroisopropanol (HFIP), o ácido fórmico e tampões aquosos). eADF4 (C16), dispõe de um elevado potencial para diversas aplicações técnicas, quando transformados em morfologias tais como películas, cápsulas, partículas, hidrogéis, revestimentos, fibras, não tecidos e malhas. Devido à sua estabilidade química e morfologia controlada, esta última pode ser usada para melhorar os materiais de filtro. Neste protocolo, apresentamos um procedimento para aumentar a eficiência de diferentes dispositivos de filtro de ar, por deposição de malhas não tecidos de proteínas da seda de aranha recombinantes electrospun. Eletrofiação de eADF4 (C16) dissolvido em HFIP resultados de fibras lisas. Variação da concentração de proteína (5-25% w / v), resulta em diferentes diâmetros de fibras (80-1,100 nm) eassim, os tamanhos dos poros da malha não urdida. O pós-tratamento dos eADF4 (C16) a partir de HFIP electrospun é necessário uma vez que a proteína exibe uma estrutura predominantemente α-helicoidal secundário recentemente fiados em fibras, e, por conseguinte, as fibras são solúveis em água. O tratamento subsequente com vapor de etanol induz a formação de resistente à água, as estruturas estáveis ​​β folhas, preservar a morfologia das fibras de seda e malhas. Análise da estrutura secundária foi realizada utilizando a espectroscopia de infravermelho transformada de Fourier (FTIR) e posteriores Fourier auto-deconvolution (FSD). O principal objectivo foi o de melhorar a eficiência do filtro de substratos de filtro existentes através da adição de camadas não tecidas de seda superior. Para avaliar a influência de electrospinning duração e, portanto, a espessura da camada não tecida sobre a eficiência do filtro, foram realizados ensaios de permeabilidade ao ar, em combinação com as medições de deposição de partículas. As experiências foram realizadas de acordo com a normaprotocolos.

Eletrofiação de soluções de seda de aranha recombinantes, com concentrações de 10% w / v de HFIP resultou em fibras lisas, com diâmetros variando de 80 a 120 nm, permitindo a formação de malhas, não tecidos. Pós-tratamento com vapor de etanol não levou a alterações morfológicas conspícuas, que era, por isso, estabeleceu como uma forma adequada de não tecido de seda de pós-tratamento (Figura 8). As mudanças estruturais foram detectados utilizando FT-IR e subsequente FSD meio de bandas que foi realizado para analisar os picos contribuição individuais (Figura 6). Pode ser mostrado que o pós-tratamento conduz a um aumento em estruturas β folhas, enquanto o teor de α-und estruturas helicoidais aleatórios bobina decresce (Figura 7). Este resultado pode ser praticamente provado por meio de imersão um pós-tratado não urdido em água (Figura 5). Mesmo depois de uma semana, sem dissolução da malha não tecida irá ocorrer. A fiação duração é o parâmetro mais importante relativo à aplicação de falsos tecidos de seda em materiais filtrantes, devido à queda de pressão baseado no aumento da densidade de fibras electrospun. Extendida fiação durações und assim um maior número de camadas de fibra, em resultado de uma diminuição exponencial da permeabilidade ao ar. Este efeito pode ser detectado por todos os materiais de substrato de filtro diferentes, antes e depois do pós-tratamento (Figura 9). Da mesma forma, a eficiência de filtração dos materiais de filtro de seda contendo de partículas sub-micrométricas aumenta (Figura 10). Enquanto durações fiação curtos (30 seg) ganhar eficiência filtro de baixa, durações de giro mais altas (90 sec) levam a uma maior eficiência. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1.jpg" /> Figura 1. Alta tensão elétrica (0-30 kV) i<html> s aplicados a uma seringa cheia com uma solução de seda, e um contra-eléctrodo (0-20 KV) é colocado a uma distância de 8-20 cm. Esta configuração conduz a um campo electrostático forte, induzindo forças repulsivas na solução carregada. Se a tensão superficial é excedido, um cone de Taylor é formado, e um jacto fino irrompe da ponta. Após formação, as instabilidades de dobragem ocorrem no jacto causando mais estendendo-se o solvente se evapora, e uma fibra sólida é formada. Finalmente, a fibra é depositado aleatoriamente no contra-eléctrodo na forma de uma malha não urdida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig2.jpg" /> Figura 2. De fotografias de um cone de Taylor normal (A), uma gota seca (B), e os custos sem gotícula (C). iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Processo esquemático de vapor durante pós-tratamento. No primeiro passo, a câmara é cheia com o etanol, e a amostra é vaporizada a 60 ° C durante 90 min. A fim de suavizar as malhas, não tecidos para o tratamento subsequente, o etanol é removido e as fibras são cozinhados com vapor de água durante 90 min a 60 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver figura maior</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig4.jpg" /> Figura 4. Fotografia de uma estrutura de papelão com anexas malhas, não tecidos de seda para ser utilizados para o pós-tratamento. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig5.jpg" /> Figura 5. Electrospun e posteriormente pós-tratadas não tecida no estado seco (A) e em água (B). <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6.jpg" /> Figura 6. Fourier auto-deconvoluídos espectro de absorção de uma amida de uma banda I não tratado (A) e um pós-tratado (B) não tecido de malha de seda de aranha. A linha sólida mostra a banda de absorção resultante dos picos de contribuição individuais (linhas pontilhadas), como derivado após deconvolução. A atribuição das respectivas curvas foi baseada em valores previamente publicados na literatura 22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 7" fo:conten<html> t-width = &quot;5 polegadas&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7. Teor de estrutura secundária de malhas, não tecidos não-tratadas e pós-tratado eADF4 (C16). <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8.jpg" /> Imagens Figura 8 SEM de electrospun eADF4 (C16) fibras em diferentes substratos de filtro:. Poliamida (PA), poliéster (PE), polipropileno (PP) e eADF4 puro (C16) fibras antes (S1) e depois (S2) pós- tratamento com vapor de etanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . / Ftp_upload/50492/50492fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. Ensaios de permeabilidade ao ar, antes de (A) e depois do pós-tratamento (B) das malhas, não tecidos de seda com vapor de etanol, aumentando os tempos de fiação conduzem a camadas mais, não tecidos, subsequentemente, a redução da permeabilidade do ar. <img alt="Figura 10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10.jpg" /> Figura 10. Eficiência Filtro de aerosol di-etil-hexil-sebacat em electrospun aranha de seda malhas não tecidos em poliamida materiais filtrantes em diferentes durações fiação, que influenciam a quantidade de camada de seda, depois de pós-tratamento com etanol.

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Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

Fibras de seda de aranha exibir extraordinárias propriedades mecânicas. Projetada<em&gt; Araneus</em&gt; Fibroína 4 (eADF4) podem ser transformadas em não tecidos, usando malhas de electrospinning. Aqui, os eADF4 malhas, não tecidos são utilizados para melhorar o desempenho dos dispositivos de filtragem de ar.

Filtro de ar de dispositivos, incluindo malhas não tecidos de electrospun Proteínas Recombinantes de seda de aranha

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.0K visualizações.  University of Bayreuth. Fibras de seda de aranha exibir extraordinárias propriedades mecânicas. Projetada Araneus Fibroína 4 (eADF4) podem ser transformadas em não tecidos, usando malhas de electrospinning. Aqui, os eADF4 malhas, não tecidos são utilizados para melhorar o desempenho dos dispositivos de filtragem de ar.

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Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

Processamento de pós-produção de Fibras electrospun para Engenharia de Tecidos

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

Bioengenharia

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

Produção de seda sintética Aranha em escala de laboratório

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&amp;#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

Baseada em Silk-colágeno Engineered 3D Model of Tissue polarizada Neural

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Fabricação de algodão dispositivos analíticos

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...