This research is funded by an operating grant from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) to C.A. and D.A.J. The authors acknowledge the Canadian Foundation for Innovation and Princess Margaret Cancer Foundation for funding the STTARR research facility that enables the imaging and therapy research components of this work.

1. Preparação de Lipossomas <ol><li> Dissolve-se os lípidos 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1-estearoil-2-hidroxi- sn-glicero-3-fosfatidilcolina (MSPC ou S-liso-PC) e N - (carbonil- methoxypolyethyleneglycol 2000) -1,2-distearoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina (mPEG 2000 -DSPE) em clorofórmio. Por exemplo, para a preparação de 10 ml de HTLC, pesam-se 314,4 mg de DPPC, 39,4 mg MSPC, e 83,9 mg de mPEG 2000 -DSPE em um frasco de vidro âmbar. Em seguida, dissolve-se os lípidos em 2 ml de clorofórmio e aquece-se o frasco durante 30 segundos num banho de água a 60 C °. </li><li> Remover o clorofórmio utilizando um evaporador rotativo. Coloque a película de lípido resultante sob a alta pressão de vácuo S / N. </li><li> Para 10 ml de HTLC, hidratar o filme de lípidos com 5 ml de tampão Tris 0,1 N (pH 7,4) durante 1 h. Ao mesmo tempo, pesam-se 162,4 mg de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG) lípido em pó e 100 mg de CDDP e hidrato Wom 5 ml de tampão Tris a 0,1 N contendo 30% de etanol (pH 7,4) durante 1 h. </li><li> Para a formulação de Gd-HTLC, pesam-se a mesma quantidade de lípido DPPG e 10 mg de CDDP em pó, em seguida hidratado com 2,5 ml de solução de Gd-HP-DO3A (279,3 mg / ml) com 2,5 ml de tampão Tris a 0,1 N contendo 30% de etanol ( pH 7,4) durante 1 h. Durante a hidratação, as misturas devem ser mantidos em frascos âmbar e colocado numa placa de aquecimento a 70 ° C com agitação constante e vórtex a cada 10 min. </li><li> Combinar a mistura de lípidos e a mistura de lípidos de drogas, e novamente hidratar durante 1 h. Vortex cada 15-20 min. </li><li> Montar a extrusora de 10 ml com duas pilhas de 200 nm filtros de policarbonato. Ligue o Thermobarrel do extrusor a um banho de circulação de água a 70 ° C, e ligar o extrusor a um tanque de azoto comprimido. </li><li> Imediatamente após a hidratação, transferir a mistura para dentro da câmara do extrusor. Abra o fluxo de azoto (para ajustar a pressão de 200 psi) para fazer a extrusão dos lipossomas através das membranas. Recolher o Liposomes em um tubo de 50 ml. Manter o tubo num banho de água quente (70 ° C) em todos os momentos durante o processo de extrusão. Repita este processo 5 vezes. </li><li> Desmonte a extrusora e mudar para duas pilhas de 100 nm filtros de policarbonato. Remontar o extrusora e ajustar a pressão de 400 psi. Repita a Etapa 5, excepto expulsar os lipossomas 10 vezes. Recolha da amostra a partir da extrusão final para um tubo de 15 ml. </li><li> Arrefecer os lipossomas até à TA, e centrifugar a 1000 xg durante 3 minutos para precipitar a CDDP insolúvel. </li><li> Dialisar os lipossomas S / N com 0,9% de soro fisiológico em tubagem de diálise com um corte de peso molecular de 15000 (MWCO) sob condições estéreis. </li><li> Dilui-se 10 ul de lipossomas em 990 ul de água destilada. Use dispersão dinâmica da luz para medir a distribuição do tamanho de HTLC e Gd-HTLC. Faça 3 medições com 10 corridas cada. </li><li> Dilui-se 40 ul de lipossomas em 3.960 mL de água destilada. Faça 5-6 soluções-padrão de platina e gadolíniona gama de concentrações de 0,1 a 20 ug / ml. Medem-se as concentrações de platina e gadolínio usando indutivamente acoplado espectrómetro de emissão atómica de plasma (ICP-AES) em 3 diferentes comprimentos de onda. Faça 3 medições em cada comprimento de onda para o resultado da média. </li><li> Determinar o gel até à temperatura líquida de fase cristalina de transição (Tm) da formulação de lipossomas HTLC utilizando um calorímetro de varrimento diferencial (DSC). Carga de 5-10 mg de HTLC numa panela de DSC e utilizar um recipiente vazio como uma referência. Usar uma velocidade de varrimento de 5 ° C / min a rampa até a temperatura de 0 ° C a 60 ° C. </li><li> Enrole os lipossomas em papel de alumínio para evitar a exposição à luz e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Em lançamento vitro a partir de lipossomas <ol><li> Prepare colunas de giro. <ol><li> Incubar 50 g de grânulos de filtração em gel em 400 ml de 0,9% de soro fisiológico à temperatura ambiente durante 3-4 h. Role-se um pedaço de lã de vidro, molhados com solução salina 0,9% e colocá-lo na ponta de uma seringa de 1 ml. Pressionar a lã de vidro para encher aproximadamente 0,05-0,1 mL da seringa. Usar uma pipeta de vidro para adicionar gradualmente cerca de 1 ml de meio de filtração em gel para a seringa. </li><li> Colocar a seringa para um tubo de 15 ml e centrifugar a 1000 xg durante 3 min. Remova a coluna giro e colocá-lo em um tubo de 15 ml. </li></ol></li><li> Amostra 400 uL de HTLC ou Gd-HTLC em 8 1-dram frascos de vidro e incubar em banho de água de temperatura controlada a 37 ° C quer a 42 ° C ou. Retire um frasco em cada ponto de tempo (isto é, 5, 15, 30 e 60 min) e colocá-la imediatamente em gelo. </li><li> Adicionar 100 ul de solução salina a 0,9% para a coluna de centrifugação preparado, em seguida, adicionar 100 ul de HTLC ou Gd-HTLC antes da incubação (controlo) ou após a incubação em banho de água para dentro da coluna de spin. Centrifugar a 1.000 xg durante 3 min. Remover a seringa do tubo e diluir a solução no tubo para a análise ICP-AES. </li></ol> 3. Implantação de subcutânea Xenoenxerto do colo do úteroTumor <ol><li> Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com protocolos de uso de animais aprovados pelo Comité de Animal Care da University Health Network (UHN). </li><li> Executar todas estudos com animais em uma cabine de segurança biológica (BSC). Autoclave todas as ferramentas cirúrgicas antes de qualquer cirurgia. Depois de cada cirurgia, limpe as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol e esterilizar novamente usando um esterilizador talão quente. </li><li> Por eutanásia, colocar o animal em uma CO 2 câmara de isolamento, em seguida, executar deslocamento cervical. </li><li> Para anestesia geral, utilizando 100% de oxigênio, utilizar 5% de isofluorano para indução e 2% para a manutenção. Para assegurar a profundidade da anestesia, aplicar pressão com uma pinça para a superfície palmar da pata observar resposta animal. Aplique lubrificante ocular para evitar a secura sob anestesia. </li><li> Para um animal que foi submetido a cirurgia, colocar o animal em uma gaiola limpa sem a companhia de outros animais. Monitore até que a consciência é suficiente recuperou. </li><li> CulturaO Me-180 células em meio essencial mínimo alfa-(α-MEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS) e antibióticos. </li><li> Colher as células e manter as células em meio completo antes da inoculação. Contar as células usando um hemocitômetro. </li><li> Inocular cada camundongo doador de suportar uma intramuscular (im) ME-180 (células de câncer cervical humano) do tumor. Nota: Crescimento no local im foi selecionado a fim de garantir o desenvolvimento de tumores vascularizados bem. Compra SCID fêmea (com idade de 6-8 semanas, aproximadamente 20 g) a partir de uma instalação de criação de animais in-house. <ol><li> Anestesiar um rato SCID fêmea e injectar 1 x 10 6 Me-180 em células do músculo do gastrocnémio de membro posterior utilizando uma agulha de 27 G. </li><li> Medir o tamanho do tumor utilizando um calibrador até os tumores atingiram 9-12 mm na sua maior dimensão. Terminar o estudo, se o tumor ultrapassou 12 mm, ou se a massa do tumor compromete a ingestão normal de comportamento, deambulação, comida e água. </li></ol></li><li> Peças tumorais implante de murganhos dadores em ratinhos receptores. <ol><li> Anestesiar um rato doador usando 5% de isofluorano. Euthanize o mouse usando deslocamento cervical sob anestesia. Remover o tumor a partir do doador rato dador. Cortar o tumor em fragmentos cúbicos de 2-3 mm 3. </li><li> Anestesiar um rato destinatário usando 5% de isofluorano. Injectar 100 ul de 0,5 mg / mL de meloxicam subcutaneamente antes da cirurgia. Aplicar a solução de iodo cirúrgico esfrega, em seguida etanol a 70%, solução de iodo e, por último, a pele raspada. Raspar o membro posterior esquerdo do mouse destinatário. Faça uma incisão no nível da pele. Insira um doador pedaço do tumor por via subcutânea através da incisão. Feche a incisão utilizando 1-2 clipe (s) ferida. </li><li> Remover os clipes de 3-5 dias após a implantação. Tumor subcutâneo é necessário para usar o aquecimento com base na configuração de laser. </li><li> Permitir que os tumores crescer durante 2-3 semanas antes do tratamento de aquecimento. </li></ol></li></ol> 4. Concepção, AssemCalibração bly e de uma entrega Iluminador Laser para Conformal In Vivo Aquecimento <ol><li> Atingir o aquecimento dos tecidos utilizando um laser de diodo 763 nm acoplado a um iluminador conformada utilizando uma fibra óptica. <ol><li> O iluminador fornece iluminação a laser superficial uniforme do tumor xenoenxerto. É composto por um milímetro bloco de material altamente reflectora contendo três luz adjacente integrando esferas câmara com uma câmara no meio (16 mm de diâmetro) e 2 pequenas câmaras de ambos os lados (16 mm de comprimento e 5 mm, 30 x 20 x 17 de diâmetro) (Figura 1). </li><li> Para que a passagem de luz a partir de uma câmara para a outra, com dois pequenos furos de 5 mm de diâmetro foram cortadas entre as pequenas câmaras exterior e o compartimento central maior. A luz é entregue a partir do laser para as câmaras exteriores 400 um usando uma fibra cortada-extremidade ligada ao laser, que é passada para dentro da câmara através de um orifício de 600 um de diâmetro. </li><li> Devido à natureza da luz interaction com as paredes da câmara, de luz entregue a uma das câmaras pequenas espacialmente é homogeneizado em seguida, passa através das portas de interior para dentro da câmara maior onde é adicionalmente homogeneizada espacialmente. Luz em seguida, sai da porta de 10 mm de diâmetro na câmara intermédia. </li></ol></li><li> Calibrar a entrega luz do iluminador com relação ao ajuste de potência do laser usando um NIST calibrado 50 milímetros esfera de integração para medir a potência fornecida. <ol><li> Calcula-se a distribuição da luz no tumor utilizando simulações de Monte Carlo com base em uma geometria simplificada do tumor. Gerar o código Monte Carlo em um algoritmo personalizado escrito com um pacote de software computacional comercial e de base sobre o código padrão de modelagem de Monte Carlo de transporte de luz em tecidos com múltiplas camadas de Jacques et al. 14. </li><li> Modelo do tumor como um hemisfério encontra-se na pele uma linha plana com um diâmetro correspondente à dimensão do tumor média de 7 mm na superfície da pele e um eleight de 5 mm. Iluminação homogênea modelo da superfície, lançando aleatoriamente fótons em todo o hemisfério expostos e directa, ao centro da esfera. </li><li> Use propriedades ópticas incluindo a absorção, u a = 0,025 milímetros -1, dispersão, μ s = 10 milímetros-1, fator de anisotropia, g = 0,9 e índice de refração, n = 1,4. Use um milhão de fótons no cálculo. </li><li> Execute estas medidas antes de quaisquer experimentos de aquecimento in vivo sem modificações adicionais após a calibração inicial. </li></ol></li></ol> 5. Conformal Aquecimento de Tumor usando Custom-projetado Setup Câmara Laser <ol><li> Conectar uma extremidade de uma fibra do laser para o dispositivo laser e a outra extremidade para o iluminador. </li><li> Anestesiar o animal utilizando 5% de isofluorano. Inserir um cateter de 27 G injecção na veia lateral da cauda do rato. Inserir um cateter de 22 G para o centro do tumor. Coloque uma temperatura pr fibra ópticaobe no cateter oco para monitorar a mudança de temperatura. </li><li> Cobrem todo o tumor com o iluminador (Figura 2). Primeiro defina o poder de 0,8-1 W. Ligue o laser e esperar que a temperatura subir. Manter a temperatura do tumor a 42 ° C, ajustando manualmente a potência do laser entre 0,1-0,8 W. </li></ol> 6. Temperatura Distribuição avaliada através de termometria RM (MRT) <ol><li> Medir a distribuição da temperatura do tumor aquecido usando a configuração de aquecimento à base de laser através de deslocamento de frequência de ressonância do protão (FRP-shift) MRT em um sistema de ressonância magnética pré 7 Tesla 15 em conjunto com as medições de temperatura da sonda de fibra óptica. </li><li> Adquirir imagens de termometria em intervalos de 10 segundos, utilizando uma sequência de impulsos 2D-FLASH (tempo de eco 4,5 ms, tempo de repetição 156,25 ms) com 312 x 312 ^ M no plano resolução e 2 mm de espessura de corte numa única fatia ao nível da fibra óptica temperatura proser. </li></ol> 7. MR Monitoramento de agente de liberação <ol><li> Execute T 1 imagens ponderadas antes e 20 min após a administração de Gd-HTLC. </li><li> Dois tumores implante, um em cada um dos membros posteriores, de um ratinho SCID fêmea usando o método descrito acima na Secção 3 para a implantação. Pré-aqueça o tumor no membro posterior esquerdo durante 5 min a 42 ° C antes da injecção de Gd-HTLC a uma dose de 66,3 mg / kg de Gd-HP-DO3A e 1,4 mg / kg de CDDP, em seguida, aquecer o tumor por um adicional de 20 min pós-injecção. Realizar injecção durante o tratamento de aquecimento. Utilizar o tumor na pata traseira direita como um controlo não aquecida. </li><li> Adquirir imagens de RM dinâmicas (36 x 20 mm campo de visão, 200 x 200 mm no plano de resolução, espessura de corte 2 milímetros; protocolo seqüência MR) para monitorar liberação Gd-HP-DO3A em intervalos de 12 seg para toda a 20 min administração cargo de Gd-HTLC, começando 30 segundos antes da injeção. </li><li> Contorno do tumor (aquecida e não aquecida) e volumes musculares.Calcula-se a média do sinal MR de todos os voxels dentro de cada volume com contornos. </li></ol>

<ol>
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There are no disclosures.

Os lipossomas foram desenvolvidos na década de 1960 como veículos de distribuição de drogas que transportam drogas hidrofílicas em seu volume aquoso interno e fármacos hidrofóbicos dentro de sua bicamada lipídica 2. Além disso a utilização em aplicações terapêuticas, os lipossomas têm sido exploradas para aplicações de diagnóstico quando marcados com radionuclidos ou carregado com agentes de contraste de imagem 17. Nos últimos anos, theranostics e pares terapêuticos-diagnóstico...

A fisiopatologia de tumores sólidos resultados na permeabilidade aumentada e retenção (EPR) de sistemas em nano-escala. Isto levou ao desenvolvimento de muitos sistemas de distribuição de drogas que tiram proveito deste efeito para atingir o tecido de tumor ao mesmo tempo minimizando os efeitos secundários sistémicos 1. Entrega tecnologias lipossomal têm sido amplamente investigadas por drogas ou de imagiologia sondas 2. Embora os lipossomas reduziram significativamente a toxicidade sistémica comparado com a quimioterapia convencional, houve poucas melhorias em 3,4 eficácia clínica. Estudos têm mostrado que a eficácia é limitada devido à falta de libertação do fármaco a partir do transportador 4,5. Como resultado, o desenvolvimento de lipossomas que são activados para libertar o fármaco encapsulado em resposta a estímulos externos tem atraído uma atenção considerável. Hipertermia tem sido utilizada há décadas como uma modalidade de tratamento relativamente seguro para pacientes com câncer 6. Por conseguinte, a desenvolvermento de lipossomas termossensíveis com calor como um gatilho externo tem sido uma combinação lógica com potencial significativo para a tradução clínica. De facto, a formulação de lipossoma contendo lisolípido termossensível da doxorrubicina, conhecido como LTSL-DOX, chegou agora a avaliação clínica 7. Dados clínicos recentes com LTSL-DOX mostrou que o protocolo de entrega de calor é um factor importante que pode influenciar fortemente os resultados dos pacientes 8. Nos seres humanos, radiofreqüência, microondas, laser e ultra-som transdutores são usados ​​para aplicar hipertermia localmente nos locais de tumor 9. Em estudos pré-clínicos que necessitam de aquecimento de tumores subcutâneos, cateteres de aquecimento 10,11 e 12,13 banhos de água são mais freqüentemente empregadas. Neste manuscrito, nós introduzimos um novo método para aquecimento de tumores subcutâneos usando uma configuração de aquecimento projetado baseado em laser, o que permite um aquecimento mais conformada do volume do tumor. Usando ma compatível MRteriais, a configuração é pequeno o suficiente para caber dentro do furo de um pequeno gerador de imagens MR animal, permitindo o monitoramento das mudanças na temperatura do tecido em tempo real durante o aquecimento a laser. O agente de contraste MR, gadoteridol (Gd-HP-DO3A), foi co-encapsulados com CDDP em uma formulação lipossomal termossensível de CDDP (HTLC), conhecido como Gd-HTLC, monitoramento e avaliação de calor em tempo real guiadas imagem MR liberação da droga -activated e validação do protocolo de aquecimento. Os nossos resultados demonstram que o aparelho de aquecimento a laser activada eficazmente a libertação de agentes encapsulados a partir da formulação de Gd-HTLC enquanto está a ser monitorizado através de ressonância magnética.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Heidolph Instruments GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>Laborota 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High pressure extruder</td>
			<td>Northern Lipids Inc.</td>
			<td>T.001</td>
			<td>10 mL thermobarrel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating circulator</td>
			<td>VWR International LLC.</td>
			<td>11305</td>
			<td>Connected to extruder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605;110606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential scanning calorimeter (DSC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Q100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer (ICP-AES)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Optima 7300DV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetasizer</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd.</td>
			<td>Nano-ZS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>NuAire Inc.</td>
			<td>NU-5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip wound clip applier</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip wound clip remover</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>427631</td>
			<td>9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>763 nm Laser device</td>
			<td>Biolitec</td>
			<td>Ceralas CD 403 laser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser probe</td>
			<td>Thorlabs Inc.</td>
			<td>FT400EMT</td>
			<td>With SMA and flat cleave connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectralon (illuminator)</td>
			<td>Labsphere Inc.</td>
			<td>FAST-SL-5CMX5CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CSTM-SL-5CMX5CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 Tesla prelinical magnetic resonance (MR) imaging system</td>
			<td>Bruker Corporation</td>
			<td>Biospec 70/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic temperature sensor</td>
			<td>LumaSense Technologies Inc.</td>
			<td>Luxtron FOT Lab Kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrating sphere</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>819C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical power meter</td>
			<td>Newport Corporation</td>
			<td>1830-R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

custom-designed laser-based heating apparatus for triggered release of cisplatin from thermosensitive liposomes with magnetic resonance image guidance

Os lipossomas têm sido utilizados como sistemas de entrega de droga para atingir os tumores sólidos, através da exploração da permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efeito resultando em reduções significativas na toxicidade sistémica. No entanto, a liberação insuficiente de medicamento encapsulado a partir de lipossomas tem limitado a sua eficácia clínica. Lipossomas sensíveis à temperatura foram manipuladas para proporcionar uma libertação específica de sítio do fármaco a fim de ultrapassar o problema de tumor limitada biodisponibilidade da droga. O nosso laboratório concebeu e desenvolveu uma formulação activado pelo calor termossensível lipossomas de cisplatina (CDDP), conhecido como HTLC, para proporcionar a libertação desencadeada de CDDP em tumores sólidos. Fornecimento activado por calor in vivo foi conseguido em modelos murinos utilizando um aparelho de aquecimento a laser integrado personalizado que fornece um padrão de aquecimento conformada no local do tumor, como confirmado por MR termometria (MRT). Um dispositivo de monitorização de temperatura de fibra óptica foi utilizado para medir a temperatura em tempo realdurante todo o período de aquecimento com ajustamento de entrega de calor on-line, alternando a potência do laser. Entrega da droga foi optimizado sob ressonância magnética (MR) imagem orientação por co-encapsulação de um agente de contraste para RM (ou seja, gadoteridol) juntamente com CDDP nos lipossomas termossensíveis, como um meio para validar o protocolo de aquecimento e para avaliar a acumulação tumoral. O protocolo de aquecimento consistiu de um período de pré-aquecimento de 5 minutos antes da administração de HTLC e 20 min de aquecimento pós-injecção. Este protocolo resultou em libertação aquecimento eficaz dos agentes encapsulados com o maior sinal MR mudança observada no tumor aquecido, em comparação com o tumor sem aquecimento e músculo. Este estudo demonstrou a aplicação bem sucedida do aparelho de aquecimento a laser para o desenvolvimento pré-clínico e lipossomas termossensível a importância da validação MR-guided do protocolo de aquecimento para a otimização de entrega da droga.

Os lipossomas são fabricados HTLC utilizando métodos comuns, incluindo a formação do filme de lípidos, hidratação, extrusão e diálise. Durante as etapas que envolvem a CDDP, deve ser tomado cuidado para não expor a CDDP para qualquer material de alumínio, como a CDDP irá ser desactivado através da formação de um depósito de preto. Uma ilustração de HTLC é mostrado na Figura 3. As propriedades físico-químicas de HTLC foram resumidos num manuscrito, recentemente publi...

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Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Aparelho de aquecimento de uma ressonância magnética compatível customizado à base de laser tem sido desenvolvido para proporcionar aquecimento local dos tumores subcutâneos, a fim de activar os agentes de libertação de lipossomas termossensíveis especificamente na região do tumor.

Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

custom-designed-laser-based-heating-apparatus-for-triggered-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K visualizações.  University of Toronto.  Aparelho de aquecimento de uma ressonância magnética compatível customizado à base de laser tem sido desenvolvido para proporcionar aquecimento local dos tumores subcutâneos, a fim de activar os agentes de libertação de lipossomas termossensíveis especificamente na região do tumor. 

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Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

Metodologia Elastografia por Ressonância Magnética para a Avaliação de engenharia de tecidos Crescimento Construct

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

Bioengenharia

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

Magneticamente Assistida deflexão da ponta Remote Controlled microcateter em Imagem por Ressonância Magnética

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

Alternando microgéis de gelatina híbrido Campo-Responsive magnética para controlada de fármacos de libertação

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Magnetic and Thermal-sensitive Poly(N-isopropylacrylamide)-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release

Magnetically and thermally sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm)/Fe3O4-NH2 microgels with the encapsulated anti-cancer drug curcumin (Cur) were designed and fabricated for magnetically triggered release. PNIPAAm-based magnetic microgels with a spherical structure were produced via a temperature-induced emulsion followed with physical-crosslinking by mixing PNIPAAm, polyethylenimine (PEI), and Fe3O4-NH2 magnetic nanoparticles. Because of their dispersity, the Fe3O4-NH2 nanoparticles were embedded inside the polymer matrix. The amine groups exposed on the Fe3O4-NH2 and PEI surface supported the spherical structure by physically crosslinking with the amide groups of the PNIPAAm. The hydrophobic anti-cancer drug curcumin can be dispersed in water after encapsulation into the microgels. The microgels were characterized by transmission electron microscopy (TEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), and UV-Vis spectral analysis. Furthermore, magnetically triggered release was studied under an external high frequency magnetic field (HFMF). A significant &#34;burst release&#34; of curcumin was observed after applying the HFMF to the microgels due to the magnetic inductive heating (hyperthermia) effect. This manuscript describes the magnetically triggered controlled release of Cur-PNIPAAm/Fe3O4-NH2 encapsulated curcumin, which can be potentially applied for tumor therapy.

Magnetic and Thermal-sensitive PolyN-isopropylacrylamide-based Microgels for Magnetically Triggered Controlled Release

This manuscript describes the preparation of magnetic and thermal-sensitive microgels via a temperature-induced emulsion without chemical reaction. These sensitive microgels were synthesized by mixing poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm), polyethylenimine (PEI) and Fe3O4-NH2 nanoparticles for the potential use in magnetically and thermally triggered drug-release.

Poli (Magnetic and Thermal-sensitive Poly)<em&gt; N</em&gt; Microgels com base em isopropilacrilamida) para liberação controlada com disparo magnético

Magnetically and thermally sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAAm)/Fe3O4-NH2 microgels with the encapsulated anti-cancer drug curcumin (Cur) were ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Suporte metabólico de extirpado, tecidos de cérebro vivos durante a aquisição de microscopia de ressonância magnética

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparação, purificação e utilização de lipossomas contendo ácido graxo

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

Aparelhos para colheita de tecido Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Produção microfluida de liposomos sensíveis à temperatura contendo lisolipóides

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...