Este protocolo permite novos testes pré-clínicos de hipertermia alvo tumoral em combinação com drogas termossensíveis, que podem ser aplicadas para melhorar a sobrevida e reduzir a toxicidade sistêmica em pacientes com sarcoma. A principal vantagem dessa técnica é que a liberação de quimioterapia fica confinada à região aquecida, maximizando a liberação do fármaco dentro do tumor e minimizando a liberação sistêmica do fármaco no tecido normal. Nossos métodos podem ser traduzidos clinicamente para o tratamento de sarcomas.
Além disso, nosso trabalho está aprendendo como a hipotermia localizada pode incitar o sistema imunológico a ajudar o corpo a atacar o câncer ao lado da quimioterapia padrão. Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Warren Foltz, o físico líder da ressonância magnética no Star Innovation Center, o Dr. Adam Waspe, o físico líder do HIFU no Hospital for Sick Children, e Suzanne Wong, uma mestranda em ciência aplicada do Drake Lab no hospital para crianças doentes em Toronto. Para começar, raspe a perna traseira do rato contido usando cortadores e limpe-a com etanol a 70%.
Aspirar aproximadamente 10.000 células em 10 microlitros de solução de suspensão celular usando uma seringa de microlitros. Estenda a perna traseira direita do rato e injete a suspensão celular em movimento constante na musculatura da coxa usando uma seringa de microlitro com uma agulha calibre 26. A agulha deve ser inserida paralelamente ao fêmur em direção ao joelho, tomando cuidado para não atingir o nervo ciático.
Retire a agulha e devolva o rato a uma segunda gaiola. Avaliar os animais diariamente e monitorar os membros pélvicos quanto ao crescimento do tumor através da palpação. Imagem do mouse anestesiado usando o scanner de ressonância magnética.
Na imagem ponderada em T2 anote-se as dimensões planas e o número de cortes axiais em que o tumor aparece. Observe a localização do tumor em referência ao fêmur e à face lateral da coxa onde a onda ultrassônica entraria. Para preparar o sistema HIFU de pequeno furo, ligue o gerador, coloque a membrana no transdutor e encha o transdutor com água deionizada suficiente até que a membrana seja expandida abaixo do transdutor.
Mas não tão firme a ponto de comprimir o mouse. Desgaseifique a água no circuito do transdutor por 30 minutos para remover o oxigênio dissolvido do meio. Depois de anestesiar o camundongo e transferi-lo para um cone nasal, aplique um lubrificante corneano nos olhos para evitar danos devido à falta de reflexo de piscar sob anestesia.
Faça a barba no membro posterior direito do rato. Aplique creme depilatório na área raspada, incluindo todo o membro posterior direito. Posicione o mouse sob uma lâmpada de calor enquanto estiver no gabinete de biossegurança para ajudar na regulação térmica.
E retire os pelos e o creme depilatório um minuto após a aplicação. Mova o mouse para um cone nasal compatível com ressonância magnética no trenó de ressonância magnética e coloque o mouse com o lado de baixo sem suporte tumoral e o tumor superior dentro de um suporte de mouse impresso em 3D no trenó. Coloque uma lâmpada de calor perto do mouse para mantê-lo aquecido.
Se necessário, corte para o segmento compressivo da almofada de gel de ultrassom para colocar sob o mouse que reveste a parte inferior do suporte com uma espessura para nivelar o tumor até a parte superior do suporte. Empurre a perna não envolvida para longe da perna do tumor, sob o camundongo ou estendida com a perna do tumor flexionada. Certifique-se de que os pés não estão no campo próximo ou distante do tumor e no caminho do feixe de ultrassom.
Para inserir a sonda de temperatura esofágica, rosqueie a sonda esofágica através do cone nasal e raspe o pescoço do rato. Incline o nariz do rato para cima para criar uma linha da boca até o estômago, estendendo a cabeça. Deslize a sonda térmica acima da língua cerca de 0,5 centímetros no esôfago do camundongo e substitua o cone do nariz ao redor do nariz do rato.
Fixe a sonda esofágica e o cone nasal na parte superior do trenó. Em seguida, insira a sonda de temperatura retal e fixe-a com fita adesiva. Insira outra almofada de gel, se necessário, e aplique lubrificante ocular ou gel de ultrassom ao redor do membro posterior direito para preencher quaisquer lacunas.
Insira um cateter de cauda com agulha borboleta de calibre 27 em uma veia lateral da cauda conectada a uma microtubulação com 40 microlitros de espaço morto e fita adesiva com segurança. Coloque o monitor respiratório com o cabo de conexão em direção à cabeça do mouse para que ele não interfira na colocação do transdutor de ultrassom, fixado com fita adesiva. Use duas pessoas para carregar o mouse preparado, o trenó do mouse, a linha de anestesia, a linha respiratória, o cateter da veia da cauda e os cordões da sonda térmica no scanner de ressonância magnética e coloque-os no suporte do trenó de ressonância magnética.
Todos foram rastreados e nada é trazido para a suíte MR, que é ferromagnética ou pode ser danificada dentro do forte campo magnético do sistema. Depois que o operador do software HIFU move o menisco do transdutor diretamente sobre o tumor para um alinhamento inicial, aplique lubrificante ocular, ou gel de ultrassom desgaseificado, na pele sem pelos acima do tumor e acople o transdutor HIFU à área do tumor. Conecte a linha de administração de medicamentos da bomba automática ao cateter da veia caudal e calcule a quantidade de espaço morto na linha da veia caudal e na linha de conexão.
Deslize o trenó HIFU do mouse nos trilhos da ressonância magnética para o centro da ressonância magnética e coloque o dispositivo de aquecimento por convecção de ar na configuração mais quente. Aponte o tubo que sopra o ar em direção ao mouse no centro do furo da ressonância magnética e prenda-o com fita adesiva. O dispositivo de aquecimento será posteriormente ligado à sua configuração mais baixa para evitar o superaquecimento do mouse durante a sonicação.
Adquirir as imagens de RM de pesquisa axial e sagital para determinar a localização do tumor para o direcionamento da sonicação, incluindo a profundidade. Ajuste a posição do transdutor de acordo usando o software HIFU inserindo a distância de movimento desejada medida na imagem e, em seguida, clicando na direção da seta para se mover. Além disso, observe a localização do tubo de deriva.
Repita conforme necessário. Determinar a localização do ponto focal do transdutor no plano cornal realizando uma breve sonicação contínua de 50 milivolts por cinco segundos durante a aquisição da termometria do tiro de teste. Alinhe as imagens da pesquisa de RM com a visão cornal do ponto focal dentro do software HIFU.
Revisar as imagens quanto à localização do tumor em relação à estrutura óssea e ao reto e revisar o posicionamento do transdutor quando necessário. Repita a sonicação do tiro de teste durante a imagem térmica de nove repetições para confirmar se há aquecimento uniforme e preciso no volume do tumor com aquecimento mínimo fora do alvo. Ajuste a localização da fatia, a localização do transdutor e a profundidade da direção e confirme o desempenho de aquecimento com disparos de teste repetidos, conforme necessário.
Usando o software de monitoramento de tratamento HIFU, defina a região de interesse, ou ROI, para o monitoramento de termometria dentro do perfil de aquecimento final, medindo a distância a ser movida e, em seguida, alterando as coordenadas da grade no programa. Defina uma ROI dentro do sinal de fluido do tubo de deriva para correção de deriva da saída de termometria. Se este sinal de fluido não estiver bem definido dentro da imagem de planejamento axial no nível do tumor, então a saída direta da sonda de temperatura de fibra óptica dentro do tubo de deriva é usada para correção de deriva.
Insira a temperatura basal com base na temperatura da sonda retal para medições de termometria. Abra as especificações de tratamento de hipertermia de 20 minutos no software e inicie a sonicação assim que as imagens de referência de RM forem coletadas e a termometria começar. Execute um tratamento de 20 minutos durante a imagem térmica usando o software de controlador integrador integrador integrado, ou PID.
Injetar a droga selecionada 1,5 minutos após a temperatura na ROI aquecer para a temperatura desejada. Se a temperatura retal estiver aumentando rapidamente durante o tratamento e exceder 40 graus Celsius, interrompa a sonicação e permita que a temperatura retal caia antes de reiniciar. Após o término do tratamento, remova o camundongo do furo da RM, garantindo a hemostasia no local de inserção do cateter da veia caudal e transfira-o para o gabinete de biossegurança.
Lave o gel de ultrassom e o lubrificante da pata traseira usando água. Transfira o mouse para sua gaiola e monitore sua recuperação. Aponte a lâmpada de calor em uma extremidade da gaiola para ajudar na regulação térmica durante a recuperação.
Com esse protocolo de hipertermia, os tumores do membro pélvico puderam ser aquecidos consistentemente até a temperatura desejada durante o tratamento. A temperatura monitorada durante o tratamento representativo é mostrada nesta figura. A média do percentil 10 superior e as temperaturas do percentil 90 superior de todos os voxels no ROI são apresentadas aqui.
As temperaturas médias durante o tratamento dentro da ROI para cada camundongo foram testadas durante a fase de otimização com o desvio padrão. A temperatura média geral também é mostrada. As taxas de sucesso do tratamento da hipertermia também melhoraram ao longo do tempo.
O sucesso do tratamento dependeu dos critérios de inclusão. Ou seja, a temperatura sistêmica, a temperatura tumoral e a variação com a ROI e sem aquecimento distal. Aqui, a linha azul representa a porcentagem de camundongos para os quais o tratamento foi bem-sucedido e as barras laranjas representam o número de camundongos tratados.
Cada tratamento refere-se a uma data separada em que os experimentos foram realizados. Para determinar o tempo ideal de tratamento da hipotermia para estudos posteriores, foram testadas duas durações de tratamento, 10 minutos e 20 minutos. Cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas, ou HPLC MS, foi usada para avaliar a quantidade de doxorrubicina nos tumores e quantificar a diferença no acúmulo de doxorrubicina entre as durações testadas.
Os resultados demonstram a significância entre a quantidade de doxorrubicina no tumor no grupo doxorrubicina lipossomal termossensível de 20 minutos mais hipertermia em comparação com o controle térmico normal. Não foram observadas diferenças no tumor nos grupos com doxorrubicina livre. Ao preparar e posicionar a massa, é imperativo que o feixe de HIFU esteja desobstruído.
Bolhas de ar no gel ou osso no trajeto do feixe devem ser evitadas. Coletamos tecidos e sangue para analisar a farmacocinética e os níveis de toxicidade em vários órgãos, bem como examinar a resposta imediata e tardia do sistema imunológico ao tratamento.
