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1. Produção de dorsais Substratos <ol><li> Produção de um filme plano de PLLA por evaporação de solvente. <ol><li> Trabalhar em um exaustor para preparar uma solução de 2% (w / v) de PLLA em clorofórmio (2 g PLLA em 100 ml de clorofórmio) agitando à temperatura ambiente (RT) até que esteja completamente dissolvido (cerca de 3 h). </li><li> Coloque as arruelas em uma placa de Petri de vidro. Nota: O uso anilhas de aço inoxidável com um diâmetro interno de 10,5 mm (um pouco menor do que o diâmetro da amostra ventral), de modo que a anilha é colocada no topo do substrato ventral. Outros materiais, tais como o politetrafluoroetileno (PTFE) ou anilhas de vidro poderiam ser utilizadas como bem. </li><li> Adicionar 200 ul da solução de PLLA na máquina de lavar e deixar evaporar lentamente durante 30 min à TA. A fim de permitir a evaporação lenta do solvente, fechar a caixa de Petri com uma folha de alumínio com alguns furos. </li><li> Aquecer as amostras a 120 ° C durante 5 minutos, a fim de evaporar os vestígios de solvente. </li><li> Vamos amostras legal fazerwn à TA. </li><li> Depois de as amostras terem arrefecido (aproximadamente 30 min), cobrir com 18,2 mohms · cm de água na caixa de Petri e incubar durante 8 minutos à temperatura ambiente. Nota: Se as amostras não são totalmente fria, que pode levar até 18,2 mohms · cm água e adotar um estado elástico. Além disso, a incubação em 18,2 mohms · cm de água para menos de 8 min podem resultar em desprendimento inadequada, e durante mais de 8 min em desprendimento da máquina de lavar. </li><li> Com uma lâmina de barbear, retire as anilhas para descascá-los fora da placa de Petri. </li><li> Remover quaisquer imperfeições da borda da arruela com uma pinça e deixar que as amostras de ar seco. </li><li> Armazenar as amostras num excicador sob vácuo (80 mbar) até ao dia da experiência, porque PLLA é degradável por hidrólise. </li></ol></li><li> Produção de fibras PLLA por electrospinning. <ol><li> Trabalhar em um exaustor para preparar uma solução de 8% (w / v) de PLLA em hexafluoroisopropanol (8 g em 100 ml de PLLA hexafluoroisopropanol) por stirrção à TA até dissolução completa (cerca de 3 h). </li><li> Inserir o politetrafluoretileno (PTFE) anilhas numa folha de alumínio ou de um tambor para o electrospinning, a fim de obter, respectivamente, fibras aleatórias ou alinhadas. Nota: O uso de politetrafluoretileno (PTFE) anilhas com um diâmetro interno de 10,5 mm (um pouco menor do que o diâmetro da amostra ventral), de modo que a anilha é colocada no topo do substrato ventral. Outros materiais, tais como aço inoxidável ou de vidro anilhas podem ser usados ​​também. O cilindro deve rodar a uma velocidade angular de 160,7 seg -1 (raio = 7 cm) de modo a obter fibras alinhadas. Uma velocidade mais lenta pode não provocar alinhamento de fibras e de uma velocidade mais rápida irá resultar em fibras quebradas. </li><li> Carregar a seringa com a solução de polímero e colocá-lo sobre a bomba de seringa. </li><li> Electrospin a solução PLLA utilizando uma taxa de fluxo de 0,9 ml / h com uma tensão de 30 kV e uma distância de 12 cm colector. </li><li> Pare o processo de popa electrospinninger 20-30 minutos, uma vez que uma boa densidade de fibra é obtida (uma vez que as células têm de interagir com várias fibras ao mesmo tempo). </li><li> Aquecer as amostras a 120 ° C durante 5 minutos, a fim de evaporar os vestígios de solvente. </li><li> Armazenar as amostras num excicador sob vácuo (80 mbar) até ao dia da experiência, porque PLLA é degradável por hidrólise. </li></ol></li></ol> Cultura 2. Sandwich <ol><li> Montar a cultura sanduíche-like uma vez células aderidas ao substrato 2D ventral. <ol><li> Trabalho em uma capa de cultura para garantir condições estéreis e esterilizar todos os materiais (lamelas de vidro, substratos dorsais, pinças, etc.) por exposição à radiação UV durante 30 min. </li><li> Brasão, a fim substrato ventral e dorsal com fibronectina para dirigir-adesão proteína celular específica. Para fazer isso, incubar as amostras de 20 ug / ml de fibronectina dissolvidos em Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo Ca 2+ e Mg 2+ (200 ^ l / samplo), durante 1 h. Nota: Devido ao processo de fabrico, os substratos dorsais tem um lado superior e inferior designados porque as fibras de película e electrospun solvente fundido ligado a um dos lados da máquina de lavar. Esta é, portanto, o lado de frente para uma das células (Figura 3). <ol><li> Depois de o revestimento de proteína, lavar as amostras duas vezes com DPBS, a fim de remover a proteína em excesso. Em seguida, incubar as amostras em DPBS até à sua utilização, a fim de impedir que as amostras de ficar seco uma vez que isso causa desnaturação de proteínas. Utilização DPBS contendo Ca 2+ e Mg 2+ desde catiões divalentes regular o dobramento de proteínas. </li></ol></li><li> Células de sementes no vidro lamelas 13. Observação: Como a cultura tipo sanduíche é baseada em substratos 2D, a sementeira de células será efectuada da mesma forma como no exemplo 2D. Por exemplo, C2C12 de mioblastos são semeadas a 17500 células cm -1 para as experiências de diferenciação e de fibroblastos NIH3T3 foram semeadas a 7000 cells cm -1 para culturas isoladas para estudar a morfologia das células e aderência. </li><li> Coloque as amostras em estufa a 37 ° C com 5% de CO 2 e permitir que as células aderem ao substrato ventral durante 3 h. </li><li> Colocar o substrato semeado ventral em um poço de uma nova 12 multi-poços (onde anilhas fit). Nota: Montagem da cultura tipo sanduíche em um novo poço é uma maneira de se livrar das células que aderiram ao fundo do poço após a semeadura uma vez que estes irão consumir nutrientes e segregam factores de crescimento e de resíduos que influenciam células cultivadas dentro do sanduíche-como sistema. Esta é também uma obrigação para extrações celulares, a fim de lisar apenas as células cultivadas dentro do ambiente de tipo sanduíche. </li><li> Cuidadosamente e com a ajuda de um par de pinças, sobrepor o substrato dorsal sobre as células. Recarga com meio (1 ml) e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Nota: O peso da anilha vai impedir que o sub dorsalestraté de flutuar. </li><li> Mudar o meio duas vezes por semana, como em culturas 2D padrão. Não mova o substrato dorsal desde que isso poderia resultar em danos às células. </li></ol></li><li> Montar a cultura sanduíche-como logo após semeadura de células. <ol><li> Trabalho em uma capa de cultura para garantir condições estéreis e esterilizar todos os materiais (lamelas de vidro, substratos dorsais, pinças, etc.) por exposição à radiação UV durante 30 min. </li><li> Brasão, a fim substrato ventral e dorsal com fibronectina para dirigir-adesão proteína celular específica. Para fazer isso, incubar as amostras de 20 ug / ml de fibronectina dissolvidos em DPBS contendo Ca 2+ e Mg 2+ (200 ul / amostra) durante 1 hora. <ol><li> Depois de o revestimento de proteína, lavar as amostras duas vezes com DPBS, a fim de remover a proteína em excesso. Em seguida, incubar as amostras em DPBS até à sua utilização, a fim de impedir que as amostras de ficar seco uma vez que isso causa desnaturação de proteínas. Utilização DPBS contendo Ca 2+ e Mg <sup&gt; 2+ desde cátions bivalentes regular dobramento de proteínas. </li></ol></li><li> Semear as células em lamelas de vidro em um poço de um 12 multi-poços (onde arruelas caber). Para fazer isso, use uma suspensão celular altamente concentrado para evitar a perda de células após a colocação do substrato dorsal. </li><li> Cuidadosamente e com a ajuda de um par de pinças, sobrepor o substrato dorsal sobre as células. Recarga com meio (1 ml) e incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. Nota: O peso da anilha vai impedir que o substrato dorsais de flutuação. </li><li> Mudar o meio duas vezes por semana, como em culturas 2D padrão. Nota: Não mova o substrato dorsal desde que isso poderia resultar em danos às células. </li></ol></li></ol> 3. Análise Nota: As culturas tipo sanduíche são baseados em substratos 2D, e assim pode ser vulgarmente analisados ​​por procedimentos já desenvolvidos para culturas 2D padrão. Por exemplo, uma vez que é transparente e de PLLA cells são obrigados a mover-se dentro do plano xy, microscopia é feito como em substratos 2D. A migração celular pode ser, por conseguinte, analisada quanto em culturas 2D, sem a necessidade de rastrear as células no eixo z, como para culturas em 3D, o que simplifica a análise de imagem e experiência. Para estudar o ensaio de cicatrização da ferida por um ensaio zero seguir este protocolo: <ol><li> Estudo migração celular (ensaio ferida cura) dentro da cultura sanduíche-like. <ol><li> Trabalho em uma capa de cultura para garantir condições estéreis e esterilizar todos os materiais (lamelas de vidro, substratos dorsais, pinças, etc.) por exposição à radiação UV durante 30 min. </li><li> Brasão, a fim substrato ventral e dorsal com fibronectina para dirigir-adesão proteína celular específica. Para fazer isso, incubar as amostras de 20 ug / ml de fibronectina dissolvidos em Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo Ca 2+ e Mg 2+, durante 1 h. <ol><li> Depois de o revestimento de proteína, lavar as amostras duas vezes com DPBSa fim de remover a proteína em excesso. Em seguida, incubar as amostras em DPBS até à sua utilização, a fim de impedir que as amostras de ficar seco uma vez que isso poderia causar desnaturação da proteína. Utilização DPBS contendo Ca 2+ e Mg 2+ desde catiões divalentes regular o dobramento de proteínas. </li></ol></li><li> Células de sementes nas lamelas de vidro em uma alta densidade 13. </li><li> Coloque as amostras em estufa a 37 ° C com 5% de CO 2 e permitir que as células atingir a confluência. </li><li> Use uma ponteira a arranhar a monocamada de células, a fim de obter duas populações de células separadas por um espaço. </li><li> Colocar o substrato semeado ventral em um novo bem adequado para a aquisição de lapso de tempo e onde encaixam substratos dorsais (ou seja, 12 placa de multi-cavidades). </li><li> Cuidadosamente e com a ajuda de um par de pinças, sobrepor o substrato dorsal sobre as células e em seguida, encher com meio (1 ml para uma placa de 12 multi-poços). Nota: O peso da anilha vai impedir que tele dorsal substrato de flutuar. </li><li> Colocar a amostra no microscópio de lapso de tempo (ajustado para 37 ° C e 5% de CO 2) e tomar imagens do fechamento do gap a cada 20 minutos. </li><li> Analisar o fechamento do gap utilizando software específico, como o MiToBo plugin ImageJ. 14 </li></ol></li></ol> Nota: Proteína e extracção de ácido nucleico é realizada de modo semelhante como em substratos 2D. Existe apenas um passo adicional que consiste em desmontar a cultura tipo sanduíche para adicionar o tampão de lise directamente sobre as células, a fim de aumentar a eficiência da extracção. Por exemplo, para extracção de ARNm: <ol start="2"><li> Extrato de mRNA a partir de culturas Sandwich-like <ol><li> Preparar todas as memórias intermédias do kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Pegue a cultura sanduíche-como fora da incubadora. </li><li> Remover o meio de cultura das amostras. </li><li> Lavam-se as amostras de uma vez com DPBS contendo Ca2+ e Mg 2+ (1 ml) e remover toda a solução. </li><li> Com a ajuda de um par de pinças, remover o substrato dorsal e adicionar o tampão de lise (350 ul) para o substrato ventral. Overlay novamente o substrato dorsal sobre o substrato ventral, a fim de lisar as células também aderiram ao substrato dorsal. </li><li> Remover o substrato dorsal para isolar a solução de lise. </li><li> Siga as instruções do fabricante para obter o mRNA. </li></ol></li></ol> Nota: A imunodetecção das proteínas pode também ser realizada como em substratos 2D. Uma vez que as culturas tipo sanduíche pode impedir a difusão correcta dos anticorpos e tampões, tempos de incubação deve ser aumentada. Além disso, a sanduíche pode ser desmontado, antes de iniciar o protocolo de coloração, mas neste último caso, algumas células a permanecerem ligadas ao substrato dorsal e alguns ao substrato ventral. <ol start="3"><li> Immunodetect proteínas dentro de uma cultura sanduíche-like <ol&gt; <li> Lava-se a amostra uma vez com DPBS e fixar com formaldeído a 4% em PBS durante 20 min a 4 ° C. Nota: substrato dorsal pode ser removido durante o processo de fixação de modo que os problemas de difusão são evitados. </li><li> Lavar com DPBS (1 ml) e, em seguida, permeabilizar com 0,5% de Triton X-100 em DPBS (1 ml) durante 5 min à TA. </li><li> Bloquear locais de ligação não específicos com 1% de albumina em DPBS (1 ml) durante 30 min à TA. </li><li> Incubar com anticorpo primário (2 ug / ml; 1 ml) em solução de bloqueio durante 3 h à TA. </li><li> Lavar três vezes durante 10 min com DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 mL). </li><li> Incubar 2 h com anticorpos secundários (2 ug / ml) e 1 ug / ml de DAPI em solução (1 ml) à temperatura ambiente de bloqueio. </li><li> Lavar três vezes durante 10 min em DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 mL). </li><li> Lavar em DPBS. Nota: As amostras pode ser montada numa lamela com Vectashield e selado com unha polonês quando substratos dorsal são removidos antes da imunodetecção. </li><li> Observar sob a micro fluorescênciaescopo como substratos para 2D padrão. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate.">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis.">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hoje em dia, a cultura 3D é um tópico importante para a indústria farmacêutica e biotecnológica, bem como a investigação em biologia celular, incluindo câncer e células-tronco. Como consequência têm sido desenvolvidos vários sistemas de cultura 3D. Infelizmente, as diferenças entre os sistemas 3D normalmente resultar em um comportamento célula diferente, dificultando a compreensão do destino da célula. Além disso, os procedimentos experimentais geralmente não são tão simples quanto para sistemas de c...

Tradicionalmente, a cultura de células foi realizada em substratos (2D) bidimensional, embora a maior parte das micro-ambientes celulares in vivo têm uma natureza (3D) tridimensional. Este ambiente 2D não natural provoca mudanças no comportamento celular como forma de auto-adaptação a um mundo plano, o que impacta diretamente o destino da pilha 1,2. Assim, os resultados obtidos em culturas de células em 2D não são sempre reprodutível in vivo. Isso tem estimulado o desenvolvimento de novos sistemas de cultura relevantes que procuram proporcionar condições mais fisiológico-gostaria de obter mais insights sobre qualquer dependente da dimensão biológica mecanismo de 3,4. Uma das principais diferenças entre a cultura 2D e 3D no ambiente in vivo, é a distribuição de receptores de células ancorado à matriz extracelular (ECM): Considerando que, em 2D substratos células aderir ventralmente, a maioria das células in vivo estão completamente cercados pela ECM e assim cell adesão ocorre através de uma distribuição de receptores 3D. Isto provoca diferentes vias de sinalização de adesão celular modulando assim processos importantes, tais como o crescimento celular, diferenciação celular e a expressão do gene. Durante as últimas décadas, muitos sistemas de cultura 3D diferentes foram estabelecidas 5-8, apesar de sua variabilidade e complexidade dificultar a sua padronização nos procedimentos de cultura celular comum. Além disso sistemas 3D geralmente não são fáceis de manusear e procedimentos experimentais atuais sobre substratos 2D não pode ser facilmente estabelecido para culturas 3D. Além disso, a literatura raramente compara culturas 3D com a condição 2D equivalente ou outros sistemas 3D, dificultando a compreensão adequada do comportamento das células nestes modelos. Uma vez tendo as células aderidas sobre um substrato 2D, a excitação dos receptores dorsais - por sobreposição de uma película de um material novo (cultura de tipo sanduíche) - podem desencadear respostas celulares tanto ambientes 3D. A reafilho por trás disto é a activação simultânea de ambos dorsal e ventral receptores para aderir e se espalhar no ambiente sanduíche (Figura 1) 9,10. Como conseqüência, as células sofrem alterações importantes no que diz respeito às culturas 2D 11,12. Deste modo, o destino da célula é determinado durante a montagem por causa da cultura sanduíche, uma vez que a estimulação dorsal provoca alterações nas vias celulares chave. Portanto, o destino da célula é altamente determinado pelo tempo em que a cultura do tipo sanduíche é montado 11. Devido à natureza do sistema, uma cultura de tipo sanduíche é uma ferramenta simples e versátil, que permite o estudo de diferentes parâmetros em interacções célula / materiais, tais como revestimentos de química, topografia, rigidez e proteína em ambos os lados dorsal e ventral. Isto oferece um maior grau de versatilidade em comparação com outros sistemas 3D (Figura 2), devido ao independente dorsal e ventral combinação de uma grande variety de condições de superfície. Além disso, as diferentes linhas de células e diferentes tempos para montar a cultura tipo sanduíche pode ser estudado, aumentando a largura espectros de possibilidades. Um protocolo padrão da cultura tipo sanduíche é detalhado abaixo usando poli-L-ácido láctico (PLLA) electrospun fibras ou películas como substratos dorsais, lamela de vidro como substrato ventral e a fibronectina como o revestimento de proteína. Culturas sanduíche-como foram montados logo após semeadura de células ou depois de 3 horas de cultura 2D. No entanto, note que outros sistemas de materiais e proteínas poderia ser usado; Da mesma forma a cultura tipo sanduíche pode ser montado em diferentes pontos de tempo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ploy(lactic acid)</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (12 mm&#216;)</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>631-0666</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>CL0200</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105228</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010-200V0</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Glassman High Voltage</td>
			<td>Series FC</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hucoa-Herl&#246;s</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow&#160; hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>AV30/70</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

Cultura celular tem sido tradicionalmente realizada em substratos bidimensionais (2D) onde as células aderem utilizando receptores da superfície ventral para biomaterial. No entanto, in vivo, a maioria das células estão completamente rodeados pela matriz extracelular (MEC), resultando numa distribuição (3D) tridimensional dos receptores. Isto pode provocar diferenças de fora para dentro e, assim, as vias de sinalização no comportamento celular. Este artigo mostra que a estimulação dos receptores de células dorsais já aderiu a um substrato 2D através da sobreposição de uma película de um material novo (uma cultura de tipo sanduíche) provoca alterações importantes no que diz respeito a culturas 2D padrão. Além disso, a excitação simultânea dos receptores ventrais e dorsais desloca o comportamento da pilha mais próxima daquela encontrada em ambientes 3D. Além disso, devido à natureza do sistema, uma cultura de tipo sanduíche é um instrumento versátil, que permite o estudo de diferentes parâmetros em células / material de interactions, por exemplo, topografia, rigidez e diferentes revestimentos proteicos em ambos os lados ventral e dorsal. Finalmente, uma vez que as culturas sanduíche-como são baseados em substratos 2D, vários procedimentos de análise já desenvolvido para as culturas padrão 2D pode ser usado normalmente, superando procedimentos mais complexos necessários para sistemas 3D.

A estimulação dos receptores dorsais dentro da cultura tipo sanduíche provoca alterações na morfologia celular, a adesão celular e as vias de sinalização intracelulares (por exemplo, quinase de adesão focal, FAK) 10-12. Como um exemplo, os fibroblastos cultivados no sistema de sanduíche do tipo sobre-expressa a subunidade de integrina α 5 em comparação com a 2D, como observado para outras culturas 3D 15,16. Destino celular é altamente d...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K visualizações.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Vídeo: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-COLUNA: Uma Ferramenta bioquímicos na identificação de interações proteína-proteína de Proteínas de Membrana<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparação de Microambientes de Matriz Extracelular Incapaz para avaliar especificação de fenótipo celular schwann

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Methods Article

Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais